高吉 潘麗娜 郭東東 魏羽佳

(貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院皮膚科，貴陽 550004)

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·論著·

硼酸抗白念珠菌作用的試驗研究

高吉 潘麗娜 郭東東 魏羽佳

(貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院皮膚科，貴陽 550004)

目的 探討硼酸對白念珠菌臨床分離株菌株的生長狀態(tài)和細胞形態(tài)的影響。方法 用加入0%、0.1%、0.15%硼酸 (w/v)的Lee’s glucose培養(yǎng)基于25℃和37℃分別培養(yǎng)8株臨床分離的白念珠菌，觀察各菌株在不同培養(yǎng)條件下生長狀況。結果 25℃培養(yǎng)條件下，0.1%的硼酸明顯抑制白念珠菌生長，其中對HJ065的抑制效果最明顯，0.15%的硼酸進一步抑制白念珠菌生長，并且SC5314、HJ058菌株的菌絲生長能力隨硼酸濃度增高而減弱。37℃培養(yǎng)條件下，硼酸對白念珠菌生長狀態(tài)和菌絲生長能力的抑制效果較25℃更明顯。相同培養(yǎng)條件下，硼酸對不同CAI重復數(shù)的白念珠菌的抑制效應存在差異。結論 硼酸對白念珠菌臨床分離菌株的抑制作用表現(xiàn)出明顯菌株的差異性。其抑制作用與培養(yǎng)溫度有關：表現(xiàn)為生理溫度下抑制作用更明顯。硼酸對8株白念珠菌抑制作用與CAI的重復數(shù)無明顯相關性。

白念珠菌；硼酸；耐受性；CAI

[Chin J Mycol，2016，11(5):275-278]

近幾十年來隨著廣譜抗生素和免疫抑制劑在臨床上的廣泛使用、艾滋病的流行及人口老齡化等原因，導致免疫功能缺陷患者增多，真菌感染的發(fā)病率呈明顯上升的趨勢。尤其是侵襲性念珠菌感染嚴重威脅人類健康，其死亡率達40%以上[1-2]。白念珠菌通常共生于人體不引起疾病，當人體免疫功能受損時，該菌容易過度生長并危害人體健康。研究表明，白念珠菌形態(tài)發(fā)生與其致病性密切相關[3]，比如酵母-菌絲形態(tài)之間的轉換與白念珠菌侵染宿主上皮細胞屏障和逃避免疫細胞的吞噬作用有密切關系[4-7]。

常用抗真菌藥物的長期使用導致白念珠菌耐藥菌株的出現(xiàn)，給臨床上念珠菌病的治療帶來很大困難。因此，開發(fā)新型抗念珠菌藥物或開拓新治療策略，具有重要的現(xiàn)實意義。硼酸是一種多功能分子，高濃度的硼酸混合物可用于防腐、消毒或殺蟲。低濃度時，有益于各種生化及生理過程，如植物細胞壁的穩(wěn)定及生物骨鹽沉積[8]。硼酸在臨床上用于皮膚、口腔、黏膜、膀胱等傷口的沖洗，加速傷口愈合[9]。研究表明，硼酸可用于治療陰道耐藥念珠菌感染[10]，并可部分抑制白念珠菌酵母形態(tài)向菌絲形態(tài)轉換[11]。微衛(wèi)星序列廣泛存在于真核生物基因中，是一類優(yōu)良的遺傳標記。白念珠菌中三核苷酸單元 (CAA/G)重復數(shù)決定其微衛(wèi)星序列CAI的多態(tài)性，因CAI位點易識別性和物種特異性的優(yōu)點而被廣泛用于白念珠菌的流行病學的研究[12-13]。研究表明白念珠菌CAI基因型與其在不同宿主組織中的定植能力和耐藥性具有明顯相關性，CAI基因型與白念珠菌形態(tài)轉換也有較大關系，特別是白念珠菌的white-opaque形態(tài)轉換[14]。

既然硼酸可用于治療念珠菌感染，而CAI基因型與白念珠菌的耐藥性相關，為弄清硼酸對不同組織來源的白念珠菌的影響，我們選取分離于人體不同部位的7株白念珠菌臨床分離株和1株實驗室標準菌株進行研究，比較硼酸對不同白念珠菌的抑制作用，并分析抑制作用與CAI重復數(shù)之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株 實驗室標準菌株SC5314，7株白念珠菌臨床分離株 (分離自北大醫(yī)院男性生殖器、口腔黏膜、唾液等人體不同部位)：HJ058、HJ059、HJ071、HJ065、HJ074、HJ029、HJ055。

培養(yǎng)基 Lee’s glucose培養(yǎng)基根據(jù)參考文獻[15]，pH調至6.8，加入2%瓊脂 (Becton，Dicknson and Company，美國)，110℃，15 min高壓滅菌，待溫度降至50～60℃左右時，加入熒光桃紅B (phloxine B，5 μg/mL，Sigma，美國)和4%硼酸溶液 (w/v)至硼酸終濃度分別為0%、0.1%、0.15%，混合均勻后倒板。

實驗器材與裝置 電熱恒溫培養(yǎng)箱 (上海一恒科學儀器有限公司)，生物顯微鏡 (B203LED,重慶奧特光學儀器有限公司)，血細胞計數(shù)板 (0.10 mm，1/400 mm2)，體式顯微鏡 (M125，萊卡)，正置熒光顯微鏡 (Axio Imager A2，德國zeiss)。

1.2 方法

梯度稀釋培養(yǎng)法：活化8株白念株菌臨床分離株，放30℃溫箱培養(yǎng)2 d。取適量單菌落于1 mL雙蒸水中，混勻后用血細胞計數(shù)板在生物顯微鏡下計數(shù)，根據(jù)計數(shù)量推算出原液濃度，將原菌液稀釋為5×107CFU/mL，逐一10倍梯度稀釋，至菌液濃度為5×103CFU/mL，制備上述5種濃度菌液待用，每株菌5個濃度分別取2 μL點到含0%、0.1%、0.15%硼酸的Lee’s glucose平板上，后分別放置25℃培養(yǎng)5 d，37℃培養(yǎng)3 d，并觀察菌體生長情況及對硼酸耐受性，并用體式顯微鏡觀察各株菌細胞形態(tài)并拍照。

涂板：將8株臨床白念珠菌原菌液稀釋到1×103CFU/mL，分別取100 μL于含0%、0.1%、0.15%硼酸的Lee’s glucose平板上，均勻涂板，使每板上有100個細胞左右，后分別放置25℃培養(yǎng)5 d或37℃培養(yǎng)3 d。觀察各分離株菌落形態(tài)。

2 結 果

2.1 白念珠菌臨床分離株相關信息

Hu等[14]根據(jù)微衛(wèi)星CAI基因型CAG序列的重復數(shù)將白念珠菌分為六類，我們選取具有代表性的CAI-1、CAI-4和CAI-6三類中的8株菌株，其中包括實驗室常用菌株SC5314。8株菌株的MTL及CAI基因型如表1所示，其中HJ055、HJ074、HJ058、HJ071屬于CAI-1類，這四株菌的CAI重復數(shù)較少，HJ065和HJ059屬于CAI-4類，這兩株菌的CAI重復數(shù)中等，HJ029、SC5314屬于CAI-6類，CAI重復數(shù)較高。

2.2 25℃條件下，硼酸對不同臨床菌株的影響

首先我們在25℃條件下Lee’s Glucose培養(yǎng)基中觀察硼酸對白念珠菌的不同臨床菌株生長狀況的影響。如圖1所示，硼酸濃度為0.1%時，8株菌的生長相比0%硼酸時都受到很大的抑制。從梯度稀釋培養(yǎng)法形成的菌落形態(tài)上看，這幾株菌相互之間的生長趨勢沒有太大差異，但單克隆的生長狀況不一致，HJ058、HJ059、HJ071、HJ029單克隆與SC5314單克隆大小基本相同，而HJ065、HJ074和HJ055的單克隆生長較SC5314慢,單克隆大小較SC5314小。硼酸濃度為0.15%時，打點的克隆中只有菌體濃度高 (細胞數(shù)105cells，即第1打點處)時才能存活，但長勢較弱，而菌體濃度較低時基本不生長，而HJ065的菌體濃度較高時也不生長。所有菌株的單克隆在0.15%硼酸濃度時，25℃培養(yǎng)5 d仍見不到克隆長出。8株菌的細胞形態(tài)在不同的硼酸濃度時也有差異，在不含硼酸的培養(yǎng)基上，細胞形態(tài)較小，且SC5314有些細胞長出菌絲形態(tài)，隨著硼酸濃度的增加，菌絲生長能力減弱，細胞狀況也較差，其余菌株出現(xiàn)細胞膨大、空泡。

表1 白念珠菌臨床分離菌株CAI重復數(shù)、MTL基因型及所屬CAI類別

Tab.1 The CAI types,MTL genotypes and the CAI categories ofCandidaalbicans

菌株CAIMTLCAI類型HJ05511/18a/alphaCAI-1HJ07411/18a/alphaCAI-1HJ05817/17a/alphaCAI-1HJ07118/18a/alphaCAI-1HJ06520/20a/alphaCAI-4HJ05923/23a/alphaCAI-4HJ02944/44a/alphaCAI-6SC531438/44a/alphaCAI-6

2.3 生理溫度 (37℃)下，硼酸對不同臨床菌株的影響

人體分離的白念珠菌的生長溫度為37℃。我們在37℃培養(yǎng)3 d觀察這8株白念珠菌的生長狀況，如圖2所示，生理溫度下硼酸對白念珠菌的抑制效果更明顯。在0.1%硼酸濃度時培養(yǎng)條件下只有HJ071、HJ058和HJ029的耐受性與SC5314較一致，打點處細胞數(shù)為102個細胞 (即第4個點的細胞數(shù))時仍可見克隆長出，這幾株菌的單克隆生長速率明顯低于SC5314，單克隆較SC5314小。HJ055、HJ074、HJ065、HJ059的長勢較SC5314弱很多，打點菌落在菌體數(shù)最高105個細胞時 (即第1個點的細胞數(shù))也基本長不起來，單克隆培養(yǎng)3d時隱約可見。當硼酸濃度提高到0.15%時，只有HJ071可長出較小的單克隆，其他菌株都基本不能生長，尤其是HJ059、HJ065完全不生長，拍攝細胞圖所用細胞來源于打點的高濃度菌體菌斑處，可見細胞膨大，有些細胞出現(xiàn)空泡狀，基本處于死亡狀態(tài)。高濃度硼酸對HJ058、SC5314菌絲生長也有明顯抑制作用。

圖1 25℃條件下8株白念珠菌臨床分離株在不同硼酸濃度培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)和細胞形態(tài) (硼酸濃度為0.15%時，細胞圖所用菌體來源于打點處的高濃度菌斑) 圖2 生理溫度 (37℃)條件下8株白念珠菌臨床分離菌株在不同硼酸濃度培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)和細胞形態(tài) (白框處無菌)

Fig.1 Colony and cellular morphologies of eight clinical isolates ofC.albicansunder different concentration of boric acid at 25℃ Fig.2 Colony and cellular morphologies of eight clinical isolates ofC.albicansunder different concentration of boric acid at 37℃

2.4 白念珠菌對硼酸的耐受性與CAI類型的相關性分析

硼酸對不同CAI類別的8株臨床菌株的抑制作用如表2所示，25℃時CAI-6類的SC5314與CAI-1類的HJ058生長趨勢基本相似，表比其他菌株的生長狀況較好，CAI-1類的HJ055、HJ074兩株菌與CAI-4類的HJ065菌株的生長狀況基本一致，較SC5314長勢差。CAI-1的HJ071與CAI-4的HJ059無明顯差異。硼酸對同屬CAI-1類的HJ058、HJ055、HJ074、HJ071的作用效果不同，而對不同CAI類型之間的影響有相似、也有不同。37℃時，硼酸對白念珠菌抑制作用更強，CAI-1的HJ071受硼酸的影響相對較其他菌株較小，CAI-1類的HJ074與CAI-6的HJ029其次，其余菌株受硼酸的抑制作用顯著。硼酸對白念珠菌的抑制程度與CAI類型無明顯相關性，CAI-1類的HJ055、HJ058，CAI-4類的HJ065、HJ059，及CAI-6類的SC5314均受到硼酸的明顯抑制。由此可以看出,25℃或37℃條件下，硼酸對8株不同來源的白念珠菌株均有較強的抑制作用，并且臨床菌株受硼酸的影響與其CAI的重復數(shù)沒有太大關系。

表2 白念珠菌臨床分離菌株CAI類型、所屬CAI類別及受硼酸抑制程度

Tab.2 The CAI types,CAI categories ofCandidaalbicansclinical isolates and boric acid tolerance

菌株CAICAI類型抑制程度(+++,0.15%硼酸)25℃37℃HJ05511/18CAI-1+++++++HJ07411/18CAI-1++++++HJ05817/17CAI-1+-+++++HJ07118/18CAI-1++++HJ06520/20CAI-4++++++++HJ05923/23CAI-4+++++++HJ02944/44CAI-6++++SC531438/44CAI-6++++++

3 討 論

硼酸在對于治療陰道酵母菌感染有長期療效，它能破壞白念珠菌菌絲的細胞骨架從而抑制白念珠菌的侵襲性生長。本研究中，我們在Lee’s glucose中添加不同濃度硼酸作為培養(yǎng)基，在25℃和37℃條件下培養(yǎng)，通過觀察實驗室白念珠菌標準菌株SC5314在不同硼酸濃度下的生長狀況。發(fā)現(xiàn)0.1%～0.15%的硼酸濃度能夠較好的抑制白念珠菌的生長，與先前報道臨床上0.1%的硼酸對白念珠菌有較好的治療效果相符合[15]，此濃度能有效控制白念珠菌的菌絲相形成，防止對人體造成危害，同時又保證不完全殺滅白念珠菌。我們選擇0.1%和0.15%的硼酸濃度作為培養(yǎng)條件觀察8株白念珠菌臨床菌株受硼酸的影響。

8株臨床菌株在相同培養(yǎng)條件下抗硼酸的能力有菌株差異性，尤其是各菌株單克隆生長狀況差異性較為明顯，如在25℃，0.15%硼酸培養(yǎng)條件下，HJ065較其余菌受硼酸抑制作用更明顯。37℃，0.15%硼酸中HJ071較其余菌受抑制作用更弱。細胞形態(tài)方面，相同溫度、培養(yǎng)時間及濃度硼酸中，各細胞大小、生長速度快慢有差異，隨硼酸濃度增加SC5314、HJ058菌絲有受抑制趨向，相對于酵母形態(tài)，菌絲形態(tài)細胞對宿主有著更強的侵襲性，由實驗可以看出硼酸對白念珠菌菌絲生長有一定的抑制作用。由于菌株取材于人體不同部分，可以推斷人體不同部位感染的白念珠菌對硼酸的敏感程度不一致。另外，由表2可以看出，8株菌株對硼酸的敏感性與溫度相關，相同硼酸濃度時，各菌株在生理溫度37℃培養(yǎng)條件下較25℃時受硼酸抑制程度更顯著，以HJ058在兩溫度間差異性最大，為硼酸可用于臨床治療連珠菌感染提供理論依據(jù)。有研究表示其中CAI類型與白念珠菌形態(tài)轉換有較大關系，其形態(tài)轉換與其致病性有關，特別是白念珠菌的white-opaque形態(tài)轉換。臨床分離的白念珠菌主要以MTLa/alpha的基因型的white形態(tài)存在，常規(guī)培養(yǎng)條件下white很難向opaque形態(tài)的轉換。研究表明CAI的重復數(shù)越多，白念珠菌越容易向opaque形態(tài)轉換。白念珠菌的形態(tài)轉換與其在不同宿主組織中的定植能力和耐藥性密切相關。本文中關于硼酸對不同CAI分型的白念珠菌的作用研究發(fā)現(xiàn),硼酸對分屬于CAI-1、CAI-4、CAI-6類別的8株白念珠菌菌株的抑制作用均有差異，表明白念珠菌受硼酸抑制作用程度與CAI的重復數(shù)無相關性，如CAI-1類的HJ071在0.15%的硼酸濃度下仍可長出單克隆，而同為CAI-1類的HJ074在0.1%的硼酸濃度下長勢也很弱。

臨床中硼酸在傷口沖洗、皮炎濕疹治療等方面應用較多，本研究發(fā)現(xiàn)白念珠菌的生長狀況和菌絲生長能力均受到硼酸的明顯抑制，使用硼酸治療念珠菌感染有利于減少抗真菌藥物的使用，同時減少新興多藥物耐藥菌株的威脅[16],具有安全、經(jīng)濟、副作用少等優(yōu)點，為臨床治療白念珠菌感染帶來了新方向。硼酸是通過什么分子機制和途徑抑制白念珠菌菌絲生長等問題有待進一步深入研究。

致謝感謝中國科學院微生物研究所黃廣華研究員和曹承俊在文章寫作中提供的幫助。

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Experimental study on the effect of boric acid againstCandidaalbicans

GAO Ji,PAN Li-na,GUO Dong-dong,WEI Yu-Jia

(DepartmentofDermatology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity，Guiyang550004)

Objective We aimed to study the different effects of boric acid on cell growth and cell morphology in eight clinical isolates ofCandidaalbicans.Method Lee's glucose media containing different concentration of boric acid (0%,0.1%,0.15%) were used for cell growth ofCandidaalbicans.The growth of the strains in different culture conditions were observed.Result When treated with 0.1% of boric acid at 25℃,the growth of eight strains were extremely inhibited,especially HJ065.When treated with 0.15% of boric acid,the growth of all strains were further inhibited.Boric acid with high concentration impacted the filamentation growth of HJ058 and SC5314.At 37℃,the inhibition effect of boric acid on the growth ofC.albicnaswas more obvious than at 25℃.Under the same culture condition,the effect of boric acid had no relationship with the number of CAI inC.albicans.Conclusion The inhibitory effect of boric acid on the clinical isolates ofCandidaalbicansshowed significant differences among the strains,and also was related to the culture temperature.Under physiological temperature,C.albicanswas more sensitivity to boric acid.There was no significant correlation between the inhibitory effect of boric acid and the CAI genotype of the 8 strains ofC.albicanswe used.

Candidaalbicans;boric acid;tolerance;CAI

貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長專項資金 (【2011】28號)

高吉，女 (仡佬族)，碩士研究生在讀.E-mail:176358070@qq.com

魏羽佳,E-mail:362971672@qq.com

R 379.4

A

1673-3827(2016)11-0275-04

2016-04-20 [本文編輯] 施 慧