陳潔 曾慶磊 李晶晶 胡秋月 余炎 余祖江

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·綜 述·

精氨酸剝奪治療在肝細胞癌中的研究進展

陳潔 曾慶磊 李晶晶 胡秋月 余炎 余祖江

肝細胞癌是全球第六常見的惡性腫瘤，占惡性腫瘤死因的第三位[1]。據(jù)統(tǒng)計：中國每年新患肝癌人數(shù)為46.61萬，每年死亡人數(shù)為42.21萬[2]。肝癌的主要病因有病毒性肝炎、肝硬化、黃曲霉素、化學(xué)致癌物和環(huán)境因素等[1]。治療方法主要是肝切除術(shù)、經(jīng)導(dǎo)管動脈化療栓塞、射頻消融術(shù)(transcatheter arterial chemoembolization,TACE)和肝移植。索拉非尼是晚期肝癌患者全身化療的一線用藥，只能延長患者生存時間3個月左右。

隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的深入，發(fā)現(xiàn)腫瘤有其特殊的生理學(xué)特性。譬如，精氨酸是半必需氨基酸，正常細胞可攝取外源性精氨酸，也可從頭合成精氨酸。一些腫瘤，特別是肝細胞癌，精氨酸琥珀酸合成酶(ASS1)是缺陷的，使得精氨酸代謝障礙，而完全依賴于外源性精氨酸來支持必需的生物過程，即精氨酸營養(yǎng)缺陷型。研究發(fā)現(xiàn)精氨酸剝奪治療在肝癌中有一定效果，本文就精氨酸剝奪治療在肝細胞癌中的研究進展進行如下綜述。

一、精氨酸的生物化學(xué)及在腫瘤中的作用

精氨酸是尿素循環(huán)中鳥氨酸的上游產(chǎn)物。經(jīng)鳥氨酸氨甲酰氨基轉(zhuǎn)移酶(OTC)催化，鳥氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸。瓜氨酸由ASS1和精氨酸琥珀酸裂解酶(ASL)催化而生成精氨酸。精氨酸酶水解精氨酸為鳥氨酸和尿素，鳥氨酸再次進入尿素循環(huán)。精氨酸也可在一氧化氮合酶催化下產(chǎn)生一氧化氮(NO)和瓜氨酸，還可由鳥氨酸生成多胺類(圖1)。

精氨酸參與多種細胞代謝過程，可促進傷口愈合，促進多種激素釋放，并有免疫調(diào)節(jié)活性等。1930年，ESM1R等發(fā)現(xiàn)了精氨酸促進腫瘤生長的作用。無論對于原發(fā)還是種植產(chǎn)生腫瘤的小鼠，精氨酸喂養(yǎng)都促進其腫瘤生長[3]。同時，精氨酸是多胺類的前體，這被證明促進了腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、侵襲[4]。另外，精氨酸是NO的唯一底物，NO可通過血管內(nèi)皮生長因子促進腫瘤血管生成，并可調(diào)控腫瘤細胞DNA的破壞及修復(fù)，還可通過caveolin-1來調(diào)控腫瘤細胞侵襲行為等[5]。

注：①OTC；②ASS1；③ASL；④精氨酸酶。Ⅰ氨基甲酰磷酸合成酶2；Ⅱ門冬氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶；Ⅲ二氫乳清酸酶。

圖1 尿素循環(huán)和嘧啶從頭合成的關(guān)系及精氨酸剝奪治療途徑

注：[1]未提供，[2]陽性相關(guān)，[3]陰性不相關(guān)

二、ASS1在腫瘤中的重要作用

肝癌中缺乏ASS1[6](表1)。ASS1缺失由ASS1基因啟動子甲基化造成，并被認為促進了腫瘤增殖、侵襲、遷移[11][15]。例如檢測149位乳腺癌患者腫瘤組織中ASS1表達情況時發(fā)現(xiàn)，ASS1陰性占63.8%(95/149)[16]。用shASS1敲除ASS1基因則促進了乳腺癌細胞增殖和侵襲[16]。體外實驗重新引入ASS1抑制了腫瘤血管生成、腫瘤增殖和遷移，表明ASS1可能是一種新型的腫瘤抑制因子[22]。

三、精氨酸剝奪抑制肝癌細胞生長的機制

機制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)精氨酸剝奪抑制多種腫瘤細胞生長，可能機制總結(jié)如下：(1)直接影響蛋白質(zhì)合成，特別是富精氨酸核組蛋白合成。(2)誘導(dǎo)細胞凋亡。精氨酸剝奪通過調(diào)節(jié)Cyclin和CDK導(dǎo)致了肝癌細胞G2/M期停滯和caspase依賴的凋亡[23]。(3)誘導(dǎo)細胞自噬。精氨酸剝奪可通過溶酶體氨基酸轉(zhuǎn)運體SLC38A9抑制mTORC1途徑而誘導(dǎo)自噬[24]。前列腺癌中精氨酸剝奪抑制mTOR信號通路，說明它也可能誘導(dǎo)自噬。(4)抑制血管生成。ADI在體外實驗中抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖、遷移，體內(nèi)實驗中抑制腎癌腫瘤血管生成[17]，這可能與ADI調(diào)控細胞外精氨酸水平來抑制NO合酶而導(dǎo)致NO下調(diào)有關(guān)(圖2)。

四、精氨酸剝奪的途徑

基于上述機制，精氨酸剝奪治療肝癌取得一定成果，并處于研究活躍領(lǐng)域(表2、3)。實際上，早在1953年BACH等就發(fā)現(xiàn)精氨酸酶通過破壞精氨酸而抑制Jensen肉瘤細胞的有絲分裂[25]。由于Km值、適宜pH要求和底物特異性等限制，精氨酸脫亞胺酶(ADI)和精氨酸酶現(xiàn)為精氨酸剝奪最常用的酶(圖2)。

(一)ADI 聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞胺酶(ADI-PEG20)抗原性減弱，半衰期增加至7天，可將精氨酸濃度從130 μmol/L降至可檢測水平 (2 μmol/L)以下[23, 26]。

在轉(zhuǎn)移性肝細胞癌的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗中，患者每周肌肉注射ADI-PEG20 160 IU/m2。47%(9/19)的患者顯示出臨床應(yīng)答，其中2人為完全應(yīng)答。所有患者的中位生存期延長到至少410 d，其中4人存活至680 d[23]。在另一個臨床Ⅱ期試驗中，76位轉(zhuǎn)移性肝細胞癌患者隨機接受80或160 IU/m2每周的ADI-PEG 20治療共6個月，所有患者的中位生存期大于15.8個月[27]。試驗中，患者耐受良好。另有一個全球的臨床Ⅲ期實驗正在進行中，以進一步確定ADI-PEG在肝癌中的有效性(表2)。

(二)精氨酸酶 經(jīng)修飾的聚乙二醇重組人精氨酸酶(Peg-rhArg)延長半衰期至6 d，降低對精氨酸的Km值至2.9 mM[28]。

Peg-rhArg的臨床Ⅰ期試驗在晚期肝癌中進行。試驗中單次靜脈注射劑量從 500 U/kg 到 2500 U/kg，在1 600～2 500 U/kg時可實現(xiàn)充分的精氨酸耗竭(血清精氨酸水平<8 uM)。在2 500 U/kg時1位患者出現(xiàn)了劑量限制性毒性。試驗中最好的應(yīng)答僅是病情穩(wěn)定(>8周)，占26.7%(4/15)，且有7位患者因疾病進展太快未納入結(jié)果評估，如納入，病情穩(wěn)定率將更低[29]。

圖2 精氨酸剝奪的機制及耐藥機制

圖3 干預(yù)肝癌細胞中嘧啶從頭合成

NTC編號分期治療方案對照入選人數(shù)地區(qū)起始時間(預(yù)計)完成時間NCT02101593*[2]ⅠADI-PEG20+索拉菲尼NA[3]8美國2014.112016.2NCT02006030ⅡADI-PEG20+TACETACE40中國臺灣2014.62016.9NCT01287585ⅢADI-PEG20安慰劑636美國、中國、韓國、中國臺灣、英國、意大利2011.72016.6NCT00056992*ⅡADI-PEGNA34美國2002.92003.10NCT02029690ⅠADI-PEG20+順鉑+培美曲塞NA88英國2014.42018.8NCT02102022ⅠADI-PEG20+奧沙利鉑NA148美國2014.112017.10NCT00988195*ⅠPeg-rhArg阿霉素15中國香港2008.52009.5NCT02089633ⅡPeg-rhArg+奧沙利鉑+卡培他濱NA73中國香港2014.42018.3NCT01092091*Ⅰ/ⅡPeg-rhArgNA20中國香港2010.32012.2NCT02089763ⅡPeg-rhArgNA35中國香港2014.42017.4NCT02285101ⅠPeg-rhArgNA36美國2014.112016.6

注：[1]來自https://clinicaltrials.gov/，[2]*表示臨床試驗已完成，[3]未提供

表3 精氨酸剝奪治療肝細胞癌臨床試驗的結(jié)果匯總

五、精氨酸剝奪治療肝細胞癌的局限性

精氨酸剝奪在治療肝細胞癌中取得了一定成效，但仍有一定局限性。(一)有效率低(表3)。原因可能如下：(1)ASS1陰性可能存在精氨酸非依賴的其他效應(yīng)；(2)循環(huán)來自ADI的瓜氨酸需要ASS1和ASL，而循環(huán)來自精氨酸酶的鳥氨酸除了ASS1和ASL外還需要OTC(圖1)。OTC缺陷的肝癌細胞對ADI天然耐受。故應(yīng)根據(jù)病人基因表達不同而選擇ADI-PEG20和Peg-rhArg[28]。(3)病人選擇、劑量和用藥頻率影響了精氨酸剝奪治療的有效性。(二)耐藥。通過研究耐ADI的黑素瘤變異株，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生了一些變化[32]，這可能與耐藥相關(guān)。(1)ASS1再表達。33%(7/21)ASS1陰性的黑素瘤細胞在ADI治療后，重新表達ASS1而對ADI耐受。ADI激活Ras/PI3K/ERK信號通路，c-Myc持續(xù)穩(wěn)定表達，結(jié)合到ASS1啟動子上而增加了ASS1表達。(2)耐藥變異體顯示出增強的AKT信號通路和減弱的mTOR信號通路，而對PI3K/AKT抑制劑敏感和對mTOR抑制劑耐受。(3)ADI耐藥細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運體1、乳酸脫氫酶A、谷氨酸脫氫酶、谷氨酰胺酶表達增加，同時丙酮酸脫氫酶表達下降，說明糖酵解增強。(4)耐藥變異體谷氨酰胺脫氫酶和谷氨酰胺酶表達增加，對谷氨酰胺抑制劑敏感。另外，抗ADI抗體出現(xiàn)。治療肝癌的2期臨床試驗中，應(yīng)用 ADI-PEG20后肝癌細胞中發(fā)現(xiàn)了抗ADI抗體，且精氨酸水平出現(xiàn)反彈[30]，抗ADI抗體可能會促進抵抗精氨酸剝奪。(三)精氨酸和NO都有免疫調(diào)節(jié)作用，精氨酸耗竭方案存在爭議。 Rodríguez等[33]發(fā)現(xiàn)Peg-rhArg可間接抑制T細胞應(yīng)答而促進腫瘤生長。Peg-rhArg誘導(dǎo)髓源性抑制細胞增加而抑制小鼠T細胞增殖，并促進了髓源性抑制細胞數(shù)量增多的小鼠中腫瘤的生長。Rodríguez等指出精氨酸剝奪治療有風(fēng)險。

六、總結(jié)與展望

近來，Robinovich等[34]將尿素循環(huán)與嘧啶從頭合成相聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)了ASS1缺乏的精氨酸非依賴效應(yīng)。細胞質(zhì)中門冬氨酸是ASS1和嘧啶從頭合成中CAD(氨基甲酰磷酸合成酶Ⅱ，門冬氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶和二氫乳清酸酶的總稱)的共同底物(圖1)。肝癌等細胞缺乏ASS1，細胞質(zhì)內(nèi)門冬氨酸水平增高，這使得CAD活性因底物可利用度和mTOR途徑的S6K1磷酸化而增高，促進了嘧啶從頭合成，從而促進了癌細胞增殖。

結(jié)合上述發(fā)現(xiàn)，干預(yù)嘧啶合成可用于治療肝細胞癌。一是抑制citrin，減少嘧啶合成原料，抑制腫瘤增殖。citrin是將線粒體內(nèi)門冬氨酸運至細胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運體，對于為嘧啶合成提供底物十分重要。二是降低CAD活性。應(yīng)用mTOR抑制劑雷帕霉素或胸苷酸合成酶抑制劑5-氟尿嘧啶治療后，細胞增殖受到抑制(圖3)。綜上，精氨酸剝奪在治療肝細胞癌上很有前景，但也有一定局限性。干擾嘧啶從頭合成與精氨酸剝奪治療有共通之處，為攻克肝癌提供了新思路。

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(本文編輯：張苗)

國家自然科學(xué)基金(81302593)；河南省高等學(xué)校重點科研項目(15A320083)

450000 河南 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染病科(陳潔，曾慶磊，胡秋月，余炎，余祖江)，重點實驗室(李晶晶)

余祖江，Email: johnyuem@zzu.edu.cn

2016-09-03)