包信，張栩嘉,，趙元慧

1. 哈爾濱師范大學(xué) 地理科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150028 2. 東北師范大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，長春 130024

?

可離子化有機污染物對大型溞的毒性及QSAR研究

包信1，張栩嘉1,，趙元慧2

1. 哈爾濱師范大學(xué) 地理科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150028 2. 東北師范大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，長春 130024

取代苯酚、苯胺和苯甲酸類化合物是在環(huán)境水體中具有較強生物毒性的芳香族可離子化有機化合物，它們在水體中對水生生物和水生生態(tài)系統(tǒng)都有較大危害。測定此類化合物在pH值為6、7.8和9的條件下對大型溞的24 h急性毒性，計算化合物在不同pH值條件下的中性態(tài)分子所占比例F0。研究毒性與F0的相關(guān)性，結(jié)果表明F0對取代苯酚和苯甲酸類化合物的毒性的影響較大而對取代苯胺毒性的影響很小。對于鹵代苯甲酸類化合物，毒性與疏水性的相關(guān)性較好，但是羥基苯甲酸類化合物的毒性與疏水性參數(shù)的相關(guān)性很差，引入量子化學(xué)參數(shù)EHOMO和取代羥基個數(shù)NOH，可以改進苯甲酸類化合物的模型的質(zhì)量。

可離子化有機污染物；大型溞；急性毒性；QSAR

Received 22 November 2015 accepted 21 January 2016

取代苯酚、苯胺和苯甲酸類化合物是在環(huán)境水體中普遍存在的具有較強生物毒性的芳香族可離子化有機化合物，它們在水體中對水生生物和水生生態(tài)系統(tǒng)都有較大危害。苯酚和苯胺類化合物是有機化工的基本原料，被大量用于酚醛樹酯、離子交換樹酯、高分子材料、合成纖維、石料、燃料、香料、炸藥、農(nóng)藥及染料等工業(yè)當中[1-2]，進而有大量的含有苯酚和苯胺類化合物的廢水排放到環(huán)境水體當中，這是一類對人類危害嚴重的工業(yè)廢水[3]。取代苯甲酸類化合物是一類重要的植物生長調(diào)節(jié)劑，被廣泛應(yīng)用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)當中，進而大量進入到水體。目前已經(jīng)有一些研究證明了苯甲酸類化合物對細菌、無脊椎動物、大型溞和魚類都存在一定的毒性作用[4]。

取代苯酚、苯胺和苯甲酸類化合物共同具有的特點就是它們都是可離子化有機化合物，在水中有2種存在形態(tài)：離子態(tài)和非離子態(tài)。在不同pH條件下，取代苯酚、苯胺和苯甲酸類化合物的離子態(tài)和非離子態(tài)的所占比例不同。趙元慧等[5]研究了不同pH條件下(6.0，7.8，9.0) 9種苯甲酸類化合物對大型溞的24 h急性毒性，并通過建立了定量構(gòu)效關(guān)系證明，苯甲酸類化合物對大型溞的毒性可通過引入疏水性參數(shù)和一個可以表征化合物離子化程度的參數(shù)進行合理準確的預(yù)測，這說明苯甲酸類化合物的離子態(tài)和非離子態(tài)對生物吸收和毒性的貢獻不同。于瑞蓮等[6-8]研究了不同pH條件下(6.0，7.8，9.0)苯酚和苯胺類化合物對大型溞的急性毒性，研究表明隨著pH的變化苯酚和苯胺類化合物對大型溞的毒性有所變化，苯酚類化合物的毒性隨pH的升高而減小，苯胺類化合物的毒性隨pH的升高而增大，這說明可離子化有機化合物的分子態(tài)被生物吸收的速度要比離子態(tài)大，分子態(tài)所占比例越大，對生物的毒性越大[6-8]。另外，不同的水生生物由于其自身組織結(jié)構(gòu)不同，對離子態(tài)和非離子態(tài)的吸收也有所差別，張栩嘉等[9]研究了有機化合物對8種水生生物的種間關(guān)系，研究表明，對于疏水性化合物的毒性，發(fā)光菌與大型溞有很好的種間相關(guān)性，而對于可離子化有機化合物，發(fā)光菌與大型溞的相關(guān)性很差，且發(fā)光菌的毒性顯著大于大型溞毒性，這一方面說明發(fā)光菌和大型溞對可離子化有機化合物的吸收機制不同，發(fā)光菌是單細胞水生生物，無論是離子態(tài)還是非離子態(tài)都相對容易被單細胞細菌吸收，進而破壞細胞的正常功能，但是離子態(tài)化合物卻很難進入到大型溞體內(nèi)，多細胞水生生物的皮膚和脂質(zhì)層能夠阻止其對可離子化有機化合物的吸收，因此也說明了大型溞對離子態(tài)和非離子態(tài)的吸收不同。

為了進一步深入研究取代苯酚、苯胺和苯甲酸類化合物在水中的電離程度對其毒性的影響，本研究測定了38種不同pH條件下(6.0，7.8，9.0)苯酚、苯胺和苯甲酸類化合物對大型溞的毒性，研究pH對可離子化有機化合物毒性的影響，進而解釋可離子化有機化合物的毒性作用機理，并選用適當?shù)奈锢砘瘜W(xué)參數(shù)分別對苯酚、苯胺和苯甲酸類化合物建立QSAR模型。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 受試化合物

本研究共測試了38種有機化合物對大型溞的生物毒性，受試化合物如表1所示。

1.2 試驗材料

試驗生物為大型溞(Daphnia magna)，甲殼綱，枝角亞目。本研究使用的大型溞取自北京王子健教授實驗室，再進行擴大培養(yǎng)。擴大培養(yǎng)使用的容器是容積大約為8 L的圓玻璃缸，培養(yǎng)用水是經(jīng)自然曝氣3 d以上的人工配制稀釋水，溫度控制在17～25 ℃，pH為6～9。使用實驗室培養(yǎng)的柵藻為大型溞的餌料，每周更換一次大型溞培養(yǎng)液，每天追加1次濃縮懸浮藻液，控制培養(yǎng)液中柵藻的的濃度，一般為106個·L-1左右，呈淡蘋果綠色，避免晚間缺氧引起大型溞死亡?？刂拼笮蜏械拿芏仍?0個·L-1，以保持大型溞在孤雌生殖的狀態(tài)下。

毒性實驗選用實驗室培養(yǎng)3代以上的出生6～24 h的幼溞。為了獲得6～24 h的幼溞，在實驗前從儲備缸中挑去適量的懷孕母溞放入2 L的大少杯中單獨培養(yǎng)。每個大少杯中方母溞20～30個。18 h后，用自制軟頭的吸管取走母溞，24 h時，此繁殖缸中的幼溞即為6～24 h的幼溞，可直接用于實驗。

1.3 毒性試驗

有機化合物的貯備液用人工稀釋水配制，定容到棕色容量瓶中，難容的化合物先用微量丙酮(不超過0.1 mL·L-1)助溶或者用超聲波清洗機溶解后定容。化合物的貯備液濃度均在其水中溶解度以下，實驗期間水溫為18～24 ℃。根據(jù)預(yù)實驗，按等對數(shù)間距取一系列不同體積的儲備液于50 mL具塞比色管中，用人工配制稀釋水稀釋到50 mL，加入HCl溶液或NaOH溶液調(diào)節(jié)到pH=6.0、7.8或9.0。每個化合物在不同pH下設(shè)置5個濃度點和1個空白對照，每個點作3個平行。每個比色管中放10個同齡且健康的6～24 h幼溞，觀察并計錄24 h活動被抑制的數(shù)目。使用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件將受試濃度對數(shù)和大型溞死亡數(shù)進行回歸分析，求出24 h-IC50值。實驗過程中試液中的溶解氧達到飽和時的60%以上，且對照點無死亡，實驗數(shù)據(jù)有效。

1.4 毒性數(shù)據(jù)集的建立

本實驗一共獲得了38種化合物在3個不同pH值條件下的毒性24 h-IC50值，通過文獻中獲得了在相同條件下測定的35種取代苯酚、苯胺和苯甲酸類化合物在3個與本實驗相同的pH值條件下的毒性24 h-IC50值，其中有4種重復(fù)化合物，它們是：2-硝基苯胺、2、4-二硝基苯胺、2-硝基苯酚和2、4-二硝基苯酚。共有12組重復(fù)數(shù)據(jù)，重復(fù)數(shù)據(jù)的絕對平均誤差為0.04個log單位。由于使用的試驗方法相同，重復(fù)數(shù)據(jù)的誤差很小，所以將實驗數(shù)據(jù)和文獻數(shù)據(jù)合并，建立了1個一共含有69種化合物的3個不同pH值條件下的毒性24 h-IC50值數(shù)據(jù)集，其中包括6種非可離子化有機化合物、17種取代苯胺、19種取代苯酚、3種氨基苯酚和24種取代苯甲酸類化合物。

1.5 分子描述符

本研究對全部69種化合物計算了總共17種描述符。其中包括疏水性參數(shù)log KOW、酸性解離常數(shù)pKa，在給定pH值下某種化合物中性態(tài)和離子態(tài)所占百分比，Abraham溶劑化參數(shù)(E, S, A, B, V)。 這些參數(shù)是使用ACD/Labs程序(Advanced Chemistry Development, Inc., http: // www.acdlabs.com)計算的。另外還有量子化學(xué)參數(shù)最高占據(jù)軌道能EHOMO和最低未占軌道能ELUMO，是使用程序MOPAC2009 (Stewart Computational Chemistry, USA, openmopac. Net)計算的，使用AM1的方法對于化合物結(jié)構(gòu)進行能量最小化。附表1中列出了取代苯酚、苯胺和苯甲酸類化合物的描述符計算結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計分析

本研究所使用的統(tǒng)計分析軟件是Minitab (version 14)，建立QSAR方程的方法是最小二乘回歸分析法和逐步回歸分析法。每個回歸分析方程都給出了如下信息：樣品數(shù)量n，相關(guān)系數(shù)的平方R2，估計值的標準誤差S和Fisher檢驗值F。用于篩選有效描述符的逐步回歸分析方法也是使用Minitab軟件進行的。

表1 受試化合物名稱、純度和生產(chǎn)廠家

2 結(jié)果(Results)

2.1 pH為6.0、7.8和9.0的條件下取代苯酚化合物對大型溞的毒性

表1中列出了在pH為6、7.8和9的條件下，苯酚、苯胺和苯甲酸類化合物對大型溞的24 h急性毒性log 1/IC50值。觀察它們的毒性發(fā)現(xiàn)化合物的毒性隨著取代基數(shù)量、種類和取代位置的不同而變化。毒性隨著取代基數(shù)量的增加而增加，如2,3-二甲基苯酚﹥單甲基苯酚、2,4-二硝基苯酚﹥單硝基苯酚、五氯酚﹥2,4,6-三氯苯酚﹥2,4-二氯苯酚﹥一氯苯酚、三氯苯胺﹥二氯苯胺﹥一氯苯胺﹥苯胺。鹵代苯甲酸類的毒性隨著鹵素取代基數(shù)量的增加而增加，即四氯取代﹥?nèi)热〈兌热〈円宦热〈?。取代基的不同也會影響毒性，苯酚類化合物的變化?guī)律為：NO2≈CH3﹤Cl﹤Br﹤OH。苯胺類化合物的變化規(guī)律為NO2≈CH3﹤Cl﹤Br﹤OH。鹵素取代基的不同也會影響鹵代苯甲酸的毒性，其變化規(guī)律為：Br﹥Cl﹥F。對于具有相同個數(shù)的同種基團取代的化合物，取代位置的變化也會影響苯酚類化合物的毒性。對于鹵代苯酚而言，毒性順序為間位﹥對位﹥鄰位，而鹵代苯甲酸的毒性順序為對位﹥間位﹥鄰位。本研究還測定了6種羥基苯甲酸類化合物的毒性，6種化合物的毒性順序為：3,4,5-三羥基苯甲酸﹥2,5-二羥基苯甲酸﹥2,4-羥基苯甲酸﹥2-羥基苯甲酸﹥4-羥基苯甲酸﹥3-羥基苯甲酸。這說明羥基苯甲酸的毒性也隨著羥基取代數(shù)目的增加而增強。對于單羥基取代苯甲酸而言，鄰位取代的毒性最強，而2,5-二羥基苯甲酸的毒性大于2,4-羥基苯甲酸，這說明鄰位上的羥基取代對苯甲酸類化合物的毒性有增強作用。Kamaya等[10]研究了羥基苯甲酸類化合物對大型溞的48 h急性毒性，也發(fā)現(xiàn)了相同結(jié)果。

觀察pH值為6.0、7.8和9.0時化合物對大型溞的毒性-logIC50值發(fā)現(xiàn)，苯酚和苯甲酸類化合物的毒性值隨著pH的增大而減小，苯胺類化合物的毒性隨著pH的增大而增大。對于可離子化有機化合物而言，隨著取代基種類和數(shù)量的改變，化合物的離子化程度也不相同。表1列出了在pH為6、7.8和9的條件下，取代苯酚、苯胺和苯甲酸類化合物在水溶液中非離子態(tài)所占的比例F0。對于酸性化合物而言非離子態(tài)化合物隨著溶液pH的增大而減小，對于堿性化合物而言非離子態(tài)化合物隨著溶液pH的增大而增大。這說明可離子化有機化合物對大型溞的毒性隨著非離子態(tài)化合物的增多毒性增強，非離子態(tài)對毒性貢獻較大。

表2 不同pH值下取代苯酚、苯胺和苯甲酸類化合物對大型溞的毒性

在pH從6～9的范圍內(nèi)，不同化合物的電離程度并不相同。如苯酚類化合物，若環(huán)上有強吸電子基團，例如鹵素或者硝基，會使酚羥基上的電子密度下降，進而增大苯酚的電離能力，而中性基團取代苯酚，如甲基則對電離能力無影響。因此，苯酚和甲基苯酚的電離能力相對較差，在pH為6～9的范圍內(nèi)，仍然主要以非離子態(tài)形式存在，雖然非離子態(tài)所占比例隨著pH的增大有所下降，但是變化很小，同時甲基苯酚類化合物的毒性隨pH的下降也很小。鹵代苯酚和硝基苯酚類化合物(2,4,6-三氯苯酚、五氯酚和2,4-二硝基苯酚除外)在pH=6時仍然主要以非離子態(tài)形式存在，但是非離子態(tài)所占比例隨著pH的增大而顯著下降，下降的程度根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)有所不同，但是非離子態(tài)化合物所占比率明顯低于甲基苯酚類化合物。這類化合物毒性隨pH的下降比甲基苯酚類化合物的程度要大，但是仍然不十分顯著，同時其毒性隨pH的下降也不十分顯著。2,4,6-三氯苯酚、五氯酚和2,4-二硝基苯酚由于吸電子基團的能力很強，在pH=6時已經(jīng)有很高的電離程度，在pH為6～9的范圍內(nèi)都主要以離子態(tài)形式存在，這3種化合物的毒性隨著pH的增大而下降非常顯著。這說明苯酚類化合物的離子化程度越高，其毒性受pH影響越顯著。對于苯胺類化合物，在pH從6～9的范圍內(nèi)都主要以分子態(tài)形式存在，分子態(tài)所占比例隨pH變化較小，因此毒性隨pH的變化并不顯著。本研究設(shè)定的3個pH值6.0、7.8和9.0均大于所測定苯甲酸類化合物的pKa，所以在測定條件下取代苯甲酸類化合物主要呈離子態(tài)形式。非離子態(tài)化合物隨著溶液pH的增大而減小，毒性值也隨著pH的增大而減小。

2.2 不同pH值下取代苯酚、苯胺和苯甲酸對大型溞毒性的QSAR研究

有機污染物對水生生物的致毒過程是一個復(fù)雜的過程，包括有機物傳輸?shù)阶饔冒形缓陀袡C污染物與作用靶位發(fā)生反應(yīng)2個部分。假設(shè)我們所研究的可離子化有機化合物不具有反應(yīng)性，或者放映性很弱，那么其毒性與其傳輸?shù)阶饔冒形坏哪芰τ泻艽箨P(guān)系，有機物傳輸?shù)阶饔冒形坏哪芰εc化合物的疏水性有關(guān)，因此我們分別建立了不同pH條件下的苯酚、苯胺和苯甲酸類化合物的疏水性方程。應(yīng)用逐步回歸方法，對計算的17種描述符進行篩選，結(jié)果如表3。

表3 不同pH值下取代苯酚、苯胺和苯甲酸對大型溞毒性的QSAR回歸方程

圖1 苯酚類化合物log1/IC50與logKOW散點圖Fig. 1 Plot of log 1/IC50 against logKOW for phenols

如圖1所示，圖中實線是根據(jù)大型溞基線毒性方程建立的[4]，大部分苯酚類化合物在pH從6～9的范圍內(nèi)的毒性都高于基線毒性，2,4,6-三氯苯酚和五氯酚在pH=9的情況下毒性顯著低于基線毒性。除各別離群點之外苯酚類化合物與log KOW表現(xiàn)出了較好的相關(guān)性。因此我們對取代苯酚類化合物在3個pH條件下對大型溞的毒性建立了log KOW單參數(shù)模型，見表3中方程(1)、(3)和(5)。單參數(shù)模型具有顯著性，但是擬合優(yōu)度不高。為了改進模型，逐步回歸方程引入了可離子化有機化合物在水溶液中非離子態(tài)所占比例參數(shù)logF0，與log KOW建立了二元線性回歸模型，見表3中方程(2)、(4)和(6)。在引入logF0后模型的決定系數(shù)得到較大改善。

圖2 苯胺類化合物log1/IC50與logKOW散點圖Fig. 2 Plot of log 1/IC50 against logKOW for anilines

如圖2所示，取代苯胺類化合物的毒性與基線毒性相比表現(xiàn)出了較高的剩余毒性，尤其是鄰羥基苯胺和對羥基苯胺。這是由于這2種化合物在環(huán)境或者生物有機體中很容易被氧化成苯醌類化合物，而苯醌可以與生物親核試劑發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，有很高的毒性。我們應(yīng)用取代苯胺類化合物(氨基苯酚除外)在3個pH條件下對大型溞的毒性建立了logKOW單參數(shù)模型，見表3中方程(7)、(9)和(11)。單參數(shù)模型具有一定顯著性，但是擬合優(yōu)度不高。苯胺類化合物對大型溞具有反應(yīng)性，因此我們引入能夠在一定程度上代表親電-親核反應(yīng)的參數(shù)pKa，與log KOW建立了二元線性回歸模型，見表3中方程(8)、(10)和(12)。在引入pKa后，pH=9的模型的決定系數(shù)得到顯著改善，而pH=6 和pH=7.8的模型的決定系數(shù)提高的并不顯著。

本研究嘗試用logKOW與取代苯甲酸類化合物對大型溞的毒性建立QSAR模型，但是得到的相關(guān)方稱的結(jié)果很差，R2均小于0.2，見表3中方程(13)、(16)和(19)。但是我們發(fā)現(xiàn)鹵代苯甲酸類化合物毒性與logKOW的相關(guān)性較好，見表3中方程(14)、(17)和(20)。在pH=6的條件下，相關(guān)方程的決定系數(shù)R2高達0.9以上，但隨著pH的增高，相關(guān)方稱的決定系數(shù)相應(yīng)降低。這說明隨著pH的增高，疏水性對鹵代苯甲酸類化合物的毒性貢獻減小。圖3是取代苯甲酸類化合物在不同pH條件下毒性與log KOW的散點圖。從圖中可以看出，在pH=6、pH=7.8和pH=9的條件下，鹵代苯甲酸和苯二甲酸都表現(xiàn)出了低于基線毒性的毒性作用。

圖3 苯甲酸類化合物log 1/IC50與log KOW散點圖Fig. 3 Plot of log 1/IC50 against log KOW for acids

在圖3中，我們也發(fā)現(xiàn)了部分取代苯甲酸類化合物表現(xiàn)出了較高的剩余毒性，這部分化合物主要是羥基苯甲酸類。這說明羥基苯甲酸類化合物可能具有反應(yīng)型毒性。應(yīng)用疏水性參數(shù)logKOW和電性參數(shù)EHOMO與毒性建立QSAR模型，結(jié)果見表3中方程(15)、(18)和(21)。引入電性參數(shù)EHOMO，雖然能夠使方程的決定系數(shù)有所改進，但是并不顯著。

取代羥基的個數(shù)顯著影響羥基苯甲酸類化合物的毒性，如圖4所示。因此，將取代羥基的數(shù)量(NOH)引入回歸方程，見方程(22)、(23)和(24)。結(jié)果表明：引入NOH之后，方程的決定系數(shù)得到明顯改善。

圖4 苯甲酸類化合物log 1/IC50與NOH散點圖Fig. 4 Plot of log 1/IC50 against NOH for acids

pH=6: log1/ IC50= 0.694 log KOW+ 0.835 EHOMO+ 0.194 ( NOH)2+ 9.72

n=24 R2=0.84 S=0.265 F=36.52

(22)

pH=7.8: log1/ IC50= 0.589 log KOW+ 0.670 EHOMO+ 0.203 ( NOH)2+ 7.58

n=24 R2=0.825 S=0.292 F=24.94

(23)

pH=9: log1/ IC50= 0.591 log KOW+ 0.555 EHOMO+ 0.194 ( NOH)2+ 6.51

n=24 R2=0.789 S=0.261 F=31.43

(24)

3 討論(Discussion)

大型溞的pH耐受范圍是5.5～9.5，在此范圍內(nèi)大型溞可以正常生存，因此本研究在此范圍內(nèi)設(shè)定了6、7.8和9三個pH節(jié)點。為了證明pH值對可離子化有機化合物毒性的影響是由離子化帶來的，我們測定了6種中性化合物在pH為6、7.8和9的條件下對大型溞的毒性，見表4。結(jié)果證明，中性化合物在pH從6～9的范圍內(nèi)都以中性態(tài)形式存在，不隨著pH的變化而變化，而中性化合物在pH從6～9的范圍內(nèi)對大型溞的毒性差異很小，無規(guī)律，我們認為這種差異是由試驗誤差帶來的。因此，pH對中性有機物的毒性無影響。

研究結(jié)果表明，取代苯酚和苯甲酸類化合物的毒性隨著pH的升高而減小，而苯胺類化合物的毒性隨著pH的升高而增大，這主要是由于化合物的離子化造成的。有機弱酸和弱堿在水中會發(fā)生電離作用，對于一元弱酸來說：

HA=A-+H+

同理，對于一元弱堿來說：

pKb=14-pKa, pOH=14-pH

因此：

表4 不同pH值下中性化合物對大型溞的毒性

所以，當pH = pKa時，有機弱酸或者弱堿的非離子態(tài)和離子態(tài)所占比例各為50%；對于有機弱酸而言，當pH > pKa時離子態(tài)占優(yōu)勢，反之則非離子態(tài)占優(yōu)勢；對于有機弱堿而言，當pH > pKa時非離子態(tài)占優(yōu)勢，反之則離子態(tài)占優(yōu)勢；pH與pKa差值的絕對值越大，離子態(tài)或非離子態(tài)所占比例越高。Rendal等[11]認為，對酸性化合物而言，當pH-pKa在 -1 ～ 3的范圍內(nèi)時，離子化率對化合物毒性影響較大；對堿性化合物而言，當pH-pKa在 -3 ～ 1的范圍內(nèi)時，離子化率對化合物毒性影響較大。

在本研究中，取代苯酚類化合物隨著取代基的不同，離子化率的影響也不相同。苯酚和烷基取代苯酚pH從6～9的范圍內(nèi)pH-pKa均小于-1，所以離子化率對其影響也不顯著，平均毒性變化僅為0.18個log單位。而對于鹵代酚和硝基苯分類化合物，由于鹵素和硝基是吸電子基團，會降低酚羥基上的電子密度，使酚羥基更容易電離。苯酚環(huán)上連接的鹵素或者硝基越多，吸電子能力就越強，苯酚就越容易水解。一鹵代、二鹵代苯酚和一硝基苯酚在pH=6時，pH-pKa均小于-1，但是在pH=9時鹵代苯酚均大于-1，而由于硝基的吸電子能力更強，單硝基苯酚的pH-pKa都在1左右，因此離子化率對毒性的影響比烷基苯酚類化合物顯著，平均毒性變化為0.32個log單位，其中pH從6～7.8平均毒性變化為0.1 log單位，pH從7.8～9平均毒性變化為0.22 log單位。2, 4, 6-三氯苯酚的pH-pKa為-0.2～2.8，在-1～3的范圍之內(nèi)，因此其毒性變化較大為1.19個log單位。五氯酚在pH從6～9的范圍內(nèi)毒性變化最大，為1.66 log單位，這不僅是由于其pH-pKa為1～4，接近-1～3的范圍，更重要的是五氯酚和2, 4-二硝基苯酚與以上其他苯酚類化合物的毒性作用機理不同，它們具有氧化磷酸化解偶聯(lián)效應(yīng)，既它們進入到生物體細胞內(nèi)，增加了細胞基質(zhì)中的質(zhì)子濃度，破壞了線粒體內(nèi)外的質(zhì)子濃度勢，阻礙了線粒體的信號傳導(dǎo)，使氧化作用和磷酸化作用解偶聯(lián)，對生物造成很高毒性。因此，毒性隨pH值的變化程度不僅與離子化率有關(guān)，還與可離子化有機化合物的作用類型和其與生物受體靶位的反應(yīng)的程度有關(guān)。苯胺類化合物的pH-pKa均大于1，所以離子化率F0值對苯胺類化合物的影響并不顯著，在pH從6～9 的范圍內(nèi)，平均毒性增長僅為0.24個log單位。

苯胺類化合物的pH-pKa均大于1，所以離子化率F0值對苯胺類化合物的影響并不顯著，在pH從6～9的范圍內(nèi)，平均毒性增長僅為0.24個log單位。苯胺類化合物整體對大型溞都表現(xiàn)出了較高毒性，這是由于苯胺類化合物具有反應(yīng)性。苯胺本身是親核試劑，氨基上的孤對電子使苯胺很容易與生物大分子中的缺電子基團發(fā)生取代反應(yīng)，如果苯胺的環(huán)上連有烷基等給電子基團，則這種反應(yīng)會增強，毒性也隨之增強。如果苯胺環(huán)上連有吸電子基團，則這種反應(yīng)就會減弱，但是如果苯胺環(huán)上連著強吸電子基團，如2, 4, 6- 三溴苯胺和2,4-二硝基苯胺，那么氨基將會呈現(xiàn)缺電子狀態(tài)，使苯胺變成親電試劑，使毒性增強。在基團活化理論中，鄰位的作用最強，其次是對位，間位取代由于有空間位阻效應(yīng)，活化效果最差。觀察一鹵代苯胺的毒性發(fā)現(xiàn)，間鹵代苯胺的毒性最高，這是由于間位鹵素與鄰對位鹵素比，吸電子能力相對較差，對苯胺的親核性質(zhì)降低較小，所以毒性較高。

比較取代苯甲酸在pH值為6.0、7.8和9.0情況下的毒性值，我們發(fā)現(xiàn)：pH=6和pH=7.8兩種條件下的毒性值的平均差值為0.45個log單位，而pH=7.8和pH=9兩種條件下的pH-pKa均大于3，毒性值的平均差值僅為0.19個log單位。這是因為取代苯甲酸類化合物大部分在pH=7.8的情況下已經(jīng)達到了很高的解離程度，因此，在pH從7.8～9的范圍內(nèi)，離子化率對毒性沒有影響，但是毒性還是隨著pH的降低有所下降，這說明pH除了影響苯甲酸類化合物的離子化率以外，可能還產(chǎn)生了一些其他方面的影響。大型溞的脂質(zhì)外殼對離子態(tài)化合物有很強的阻礙作用，因此大部分苯甲酸類化合物的毒性都在基線毒性以下，但是羥基苯甲酸類化合物對大型溞確表現(xiàn)出了較高的剩余毒性。這可能是由于羥基苯甲酸類化合物在水溶液中可以形成具有較高疏水性的酯類化合物，進而增強了其生物富集能力，大量進入到水生生物體內(nèi)。而在酯基上連有苯環(huán)的酯類化合物在有機體內(nèi)可以與生物大分子發(fā)生雙分子歷程的親核取代反應(yīng)，使毒性增強。由于空間位阻效應(yīng)，間硝基苯甲酸生成酯類比較困難，所以其毒性相對較低。

綜上可知，為了探討離子化率對化合物毒性的影響，本研究通過實驗測定了取代苯酚、苯胺和苯甲酸類化合物在pH值為6、7.8和9的條件下對大型溞的24 h急性毒性。得出以下結(jié)論：取代苯酚和苯甲酸類化合物的毒性隨著pH的升高而降低，而取代苯胺類化合物的毒性隨著pH的升高而升高。氨基苯酚類化合物對大型溞表現(xiàn)出了較高毒性，毒性隨pH值變化無規(guī)律。離子化率是影響苯酚類化合物毒性的重要因素，可以引入log F0進入到苯酚類化合物的疏水性模型，改進模型的決定系數(shù)。苯胺類化合物的離子化程度較低，在設(shè)定pH值內(nèi)主要以非離子態(tài)形式存在，離子化率對毒性的影響很小，引入可以代表親電性質(zhì)的參數(shù)pKa，也不能使模型得到較好改進。氯代苯甲酸類化合物與疏水性的相關(guān)性較好，但是羥基苯甲酸類化合物與疏水性參數(shù)的相關(guān)性很差，引入量子化學(xué)參數(shù)EHOMO和取代羥基個數(shù)NOH，可以改進苯甲酸類化合物的模型的質(zhì)量。

致謝：感謝哈爾濱師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院高梅香副教授在文章修改中給予的幫助。

[1] Yangjeh A H, Jenagharad M D, Nooshyar M. Application of artificial neural networks for predicting the aqueous acidity of various phenols using QSAR [J]. Journal of Molecular Modeling, 2006, 12: 338-347

[2] 金相燦. 有機化合物污染化學(xué)[M]. 北京: 清華大學(xué)出版社, 1990

Jin X C. Chemistry of Organic Compounds [M]. Beijing: Tsinghua University Press, 1990 (in Chinese)

[3] 王紅娟, 奚紅霞, 夏啟斌, 等. 含酚廢水處理技術(shù)的現(xiàn)狀與開發(fā)前景[J]. 工業(yè)水處理, 2002, 22(6): 6-9

Wang H J, Xi H X, Xia Q B, et al. Present situation and future development of phenol-containing wastewater treatment [J]. Industrial Water Treatment, 2002, 22(6): 6-9 (in Chinese)

[4] Layton A C, Lajoie C A, Easter J P, et al. Molecular diagnostics for polychlorinated biphenyl degradation in contaminated soils [J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 1994, 721: 407-421

[5] Zhao Y H, Ji G D, Cronin M T D, et al. QSAR study of the toxicity of benzoic acids to Vibrio fischeri, Daphnia magna and carp [J]. Science of the Total Environment, 1998, 216(3): 205-215

[6] 于瑞蓮, 趙元慧, 袁星, 等. 取代苯胺和苯酚類化合物對大型溞的毒性及pH值對其毒性的影響[J]. 環(huán)境化學(xué), 1998, 17(5): 451-456

Yu R L, Zhao Y H, Yuan X, et al. Effect of pH Daphnia magna toxicity of substituted anilines and phenals [J]. Environmental Chemistry, 1998, 17(5): 451-456 (in Chinese)

[7] 于瑞蓮, 胡恭任. 苯胺類化合物在不同pH值下對大型溞的急性毒性及QSAR研究[J]. 重慶環(huán)境科學(xué), 2002, 24(6): 47-49

Yu R L, Hu G R. Acute toxicities of organic acids and bases to photobacterium phosphoreum at different pH [J]. Chongqing Environmental Science, 2002,24(6): 47-49 (in Chinese)

[8] 于瑞蓮, 趙元慧, 胡恭任. 酚類對大型溞的急性毒性及QSAR研究[J]. 華僑大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版, 2003, 24(1): 44-47

Yu R L, Zhao Y H, Hu G R. Acute toxicity of phenol chemicals to Daphnia magna at different pH values and the QSAR study [J]. Journal of Huaqiao University: Natural Science, 2003, 24(1): 44-47 (in Chinese)

[9] Zhang X J, Qin H W, Su L M, et al. Interspecies correlations of toxicity to eight aquatic organisms: Theoretical considerations [J]. Science of the Total Environment, 2010, 408: 4549-4555

[10] Kamaya Y, Fukaya Y, Suzuki K. Acute toxicity of benzoic acids to the crustacean Daphnia magna [J]. Chemosphere, 2005, 59: 255-261

[11] Rendal C, Kusk K O, Tarrp S. Optimal choice of pH for toxicity and bioaccumulation studies of ionizing organic chemicals [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2011, 30(11): 2395-2406

The Toxicities of Ionized Organic Compounds toDaphniamagnaand QSAR Study

Bao Xin1, Zhang Xujia1,*, Zhao Yuanhui2

1. College of Geographical Sciences , Harbin Normal University, Harbin 150028, China 2. School of Environmental, Northeast Normal University, Changchun 130024, China

The ionization organic compounds of substituted phenols, anilines and benzoic acids are ubiquitous with strong biotoxicity in environmental water and quite harmful to aquatic organisms and aquatic ecosystems. The 24 h acute immobilization toxicity of the three kinds of compounds was determined for the freshwater crustacean Daphnia magna under the condition of pH equal to 6, 7.8 and 9 respectively. The proportion of neutral form (F0) was consequently calculated for the three kinds of compounds at three different pH conditions. Based on the correlation between toxicity and F0, the results showed that it was an important influencing factor of ionization to the toxicity of phenols; and neutral form accounts for absolute advantage, so the effect of ionization on anilines was smaller than phenols. The correlation between the toxicity of halogenated benzoic acids and hydrophobicity parameter was strong, while, the correlation between the toxicity of hydroxyl benzoic acids and hydrophobicity parameter was much weaker. Moreover, the results suggested that inclusion of EHOMOand the number of hydroxyl (NOH) with log KOWcan improve the determinate coefficient of the models.

ionized organic compounds; Daphnia magna; acute toxicity; QSAR

◆

10.7524/AJE.1673-5897.20151122001

黑龍江省自然科學(xué)基金(C201022)；哈爾濱師范大學(xué)博士啟動基金項目(kxb201314)

包信(1989-)，女，碩士研究生，研究方向為水生生態(tài)毒理學(xué)，E-mail: 317499292@qq.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: zhangxj957@nenu.edu.cn

2015-11-22 錄用日期：2016-01-21

1673-5897(2016)2-720-12

X171.5

A

簡介：張栩嘉(1983-)，女，環(huán)境科學(xué)博士，講師，主要研究方向為有機污染物毒性作用機理及構(gòu)效關(guān)系，發(fā)表學(xué)術(shù)論文10余篇。

包信, 張栩嘉, 趙元慧. 可離子化有機污染物對大型溞的毒性及QSAR研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2016, 11(2): 720-731

Bao X, Zhang X J, Zhao Y H. The toxicities of ionized organic compounds to Daphnia magna and QSAR study [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(2): 720-731 (in Chinese)