王增尚 李強(qiáng) 盛芳婷 扎西白珍 劉江云　陳虹

【摘 要】 目的：建立同時(shí)測定復(fù)方鵝絨藤中小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法，CosmosilC18-AR-Ⅱ（46mm×250mm，5μm） 色譜柱，乙腈-01%乙酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，檢測波長330nm，流速10mL/min，柱溫30℃。結(jié)果：小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷線性范圍為4004～4004μg（R2=09996），平均加樣回收率為981%；芹菜素的線性范圍為1996～1996μg（R2=09990），平均加樣回收率為984%。結(jié)論：該方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為復(fù)方鵝絨藤中該兩種成分的含量測定方法。

【關(guān)鍵詞】 鵝絨藤；白花菜籽；小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；芹菜素；含量

【中圖分類號(hào)】R2481 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2016）20-0030-03

復(fù)方鵝絨藤是由鵝絨藤、白花菜籽等藥組成的民間驗(yàn)方，是以新疆特產(chǎn)鵝絨藤藥材為主藥的在研新藥，主要外用治療肩周炎、腰肌勞損等多種外周關(guān)節(jié)炎性疼痛。根據(jù)復(fù)方鵝絨藤的藥味組成及其制備工藝，本研究在鵝絨藤[1-2]、白花菜籽化學(xué)成分分離鑒定的基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜建立該方中兩種黃酮類成分的含量測定方法，為復(fù)方鵝絨藤的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與材料

11 儀器 Agilent1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；ME215S型電子天平（德國Starorious公司）；MP2002電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

12 材料 鵝絨藤莖葉（批號(hào)：ER130901）采自新疆維吾爾自治區(qū)石河子市郊，白花菜籽（批號(hào)：BZ140301，購自湖北武漢市），經(jīng)蘇州大學(xué)藥學(xué)院陸葉博士鑒定依次為鵝絨藤（Cynanchum chinenseRBr）莖葉及白花菜（Cleome gynandra L）的種子。復(fù)方鵝絨藤提取物（批號(hào)：FE140501）按相應(yīng)處方工藝，采用鵝絨藤和白花菜籽經(jīng)醇提、減壓濃縮、大孔樹脂精制、減壓濃縮和干燥獲得。

小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷對(duì)照品為自制，從鵝絨藤中分離得到[1]；芹菜素對(duì)照品為自制，從白花菜籽中分離得到，并經(jīng)與相應(yīng)化合物[1]NMR數(shù)據(jù)比較確定。兩種對(duì)照品經(jīng)HPLC檢測，按峰面積歸一法計(jì)算其純度均大于98%。乙腈（色譜純，美國Fisher公司），純水（娃哈哈），其余試劑為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

21 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取對(duì)照品小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷1001mg、芹菜素998mg于10mL容量瓶中，用甲醇定容制成相應(yīng)對(duì)照品儲(chǔ)備液A、B。分別依次精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液A 02、04、08、12、16、20mL，對(duì)照品儲(chǔ)備液B 01、02、04、06、08、10mL于50mL容量瓶中，甲醇定容配制成系列小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素混合對(duì)照品溶液1～6。

22 供試品溶液的制備

221 復(fù)方鵝絨藤供試品溶液 精密稱取復(fù)方鵝絨藤提取物2942mg于50mL容量瓶中，用甲醇定容，即得。

222 藥材供試品溶液 參照復(fù)方鵝絨藤提取物相應(yīng)工藝進(jìn)行制備。分別精密稱定鵝絨藤藥材994g、白花菜籽藥材1148g，各用75 %乙醇100mL加熱回流提取兩次，提取液合并，減壓濃縮至約40mL，上樣于AB-8大孔樹脂柱，依次用水200mL、70 %乙醇100mL洗脫，收集70%乙醇洗脫液、減壓濃縮至約25mL，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用甲醇定容，得儲(chǔ)備液；分別精密量取該儲(chǔ)備液2mL置25mL容量瓶中，用甲醇定容，即得到相應(yīng)鵝絨藤、白花菜籽供試品溶液。

23 色譜條件 色譜柱：Cosmosil 5C18-AR-Ⅱ（46mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：01 %乙酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～15min，18%～25%B；15～16min，25%～45%B；16～25min，45% B～60% B；25～30min，60%～80%B）；流速：10mL/min；檢測波長：330nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。在此色譜條件下，各相鄰色譜峰之間分離度均大于15。見圖1。

24 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“21”項(xiàng)下6個(gè)不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液1-6，分別進(jìn)樣20μL，以峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣質(zhì)量（x）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，測得小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素的線性方程分別為y=1772x+9062，R2 =09996；y=2937x-2352，R2= 09990。結(jié)果表明小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、芹菜素分別在4004～4004μg、1996～1996μg范圍呈線性關(guān)系。

25 精密度實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品溶液3號(hào)20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、芹菜素峰面積的RSD，分別為154 %、232%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

26 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取同一復(fù)方鵝絨藤供試品溶液20μL，分別于0、2、4、6、8h進(jìn)樣測定，結(jié)果小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、芹菜素的峰面積RSD分別為137%、158%，表明穩(wěn)定性良好。

27 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批次復(fù)方鵝絨藤樣品6份，精密稱定，按“22”項(xiàng)下方法制備復(fù)方鵝絨藤供試品溶液，進(jìn)樣20μL，計(jì)算小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷含量為3968mg/g，峰面積RSD為212%；芹菜素含量為6532mg/g，峰面積RSD為224%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

28 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密稱取“27”項(xiàng)下已知含量的同一批次復(fù)方鵝絨藤樣品6份于50mL容量瓶中，每份約15mg，精密加入1mL混合對(duì)照品溶液（其中含小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷05005mg/mL，芹菜素00998mg/mL），用甲醇定容，進(jìn)樣20 μL測定，計(jì)算兩種成分回收率（表1）。測得平均回收率分別為981%、984%，RSD值分別為051%、058 %。

29 樣品測定 將“22”項(xiàng)下三種供試品溶液按照以上條件進(jìn)樣，記錄芹菜素和小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的峰面積，計(jì)算樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

3 討論

復(fù)方鵝絨藤是由鵝絨藤、白花菜籽等藥物組成的在研新藥。方中鵝絨藤作為該方主藥，主產(chǎn)于甘肅、內(nèi)蒙、寧夏、新疆等西北地區(qū)，藥用根及新鮮莖的乳汁，乳汁外敷可治療疣贅[3]，其莖葉及其中的黃酮苷類成分具有抗氧化[4]、抗腫瘤[5-6]等活性。本課題前期已對(duì)鵝絨藤莖葉中的黃酮類成分進(jìn)行了分離鑒定[1]，對(duì)其中的小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷等主成分進(jìn)行含量分析[2]。白花菜籽中主要含有黃酮、生物堿等成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌等作用[7]，但未見相關(guān)含量測定報(bào)道。通過對(duì)白花菜籽中的主要成分進(jìn)行液相分析和分離純化，經(jīng)NMR鑒定并與相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[1]對(duì)照確證為芹菜素。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)復(fù)方鵝絨藤的藥味組成及其制備工藝，本文采用高效液相色譜首次建立了該方中兩種黃酮類成分的含量測定方法（圖1）。該方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，方法學(xué)評(píng)價(jià)可行，可為復(fù)方鵝絨藤及其中的鵝絨藤、白花菜籽兩種藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

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（編輯：程鵬飛）