虎春艷　趙聲蘭　劉海鷗　林玉萍

【摘 要】 目的：從紫色胡蘿卜中提取、分離花青素，并對(duì)提取所得的花青素進(jìn)行體外抗氧化活性研究。方法：以維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照，研究不同濃度的花青素對(duì)·OH 、H2O2、O2-·的清除效果。結(jié)果：從紫色胡蘿卜提取所得的花青素對(duì)·OH 、H2O2、O2-·均有較好的清除率。結(jié)論：紫色胡蘿卜中分離提取的花青素有較好的抗氧化活性。

【關(guān)鍵詞】 紫色胡蘿卜；花青素；抗氧化；提取分離

【中圖分類號(hào)】R2842 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2016）20-0033-03

紫色胡蘿卜（Purple Carrot）為十字花科蘿卜屬植物，成熟于秋冬季節(jié)。紫色胡蘿卜富含多酚，維生素和β-胡蘿卜素等物質(zhì)外，還含有豐富的花青素（Anthocyanins）。花青素又稱花色素，是一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素， 屬黃酮類化合物[1]，多以糖苷的形式存在，也稱花色苷。從紅葡萄渣中提取的葡萄皮紅是最早且最豐富的花青素， 它于1879年在意大利上市[2]。花青素作為一種天然食用色素，安全、無(wú)毒、資源豐富，而且具有一定營(yíng)養(yǎng)和藥理作用，在食品、 化妝品和醫(yī)藥等方面有著巨大的應(yīng)用潛力。

研究發(fā)現(xiàn)，紫色胡蘿卜中所含的花青素主要為穩(wěn)定性較高且生物活性較好的酰化花青素，其含量占總花青素的70%以上[3]?；ㄇ嗨啬軠p少動(dòng)脈粥樣硬化[4-5]，具有抗腫瘤[7]，抗菌消炎[7]，以及清除自由基的抗氧化作用[4，6，8]。在機(jī)體的新陳代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生超氧自由基、羥自由基等基團(tuán)都是很多生理和病理的積極參與者[9]。國(guó)內(nèi)對(duì)紫色胡蘿卜的研究較少，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的紫色胡蘿卜一直沒(méi)有被大眾所認(rèn)識(shí)[10]。而歐美等國(guó)將紫色胡蘿卜作為一種保健食品被大量種植，紫色胡蘿卜汁也深受大眾喜愛(ài)[3-7]。本研究系統(tǒng)研究了紫色胡蘿卜中花青素的提取、分離及體外抗氧化活性，為紫色胡蘿卜的深度開(kāi)發(fā)研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

11 儀器 UV-2450型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司）；CP214型號(hào)電子天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司）； TG16-WS高速臺(tái)式離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；HHS11-4R型電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠）。

12 材料 硫酸亞鐵、鄰二氮菲、過(guò)氧化氫30%、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鄰苯三酚、三（羥甲基）氨基甲烷（Tris）、硫酸亞鐵、無(wú)水乙醇、濃硫酸、濃鹽酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純，為汕頭市達(dá)濠精細(xì)化學(xué)品有限公司產(chǎn)品；紫色胡蘿卜購(gòu)買自云南滇東北地區(qū)。

2 方法

21 花青素的提取 取一定量的新鮮紫色胡蘿卜，去芯、充分搗碎后稱量放入燒瓶?jī)?nèi)，加入80%的乙醇（料液比為1∶2），調(diào)節(jié)pH為3～4，在50℃水浴下回流提取1h，趁熱抽濾，濾渣再用80%的乙醇回流提取30min，趁熱抽濾。合并提取液，并將其旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無(wú)醇味，真空冷凍干燥得粗品。

22 花青素的分離、純化 采用AB-8型大孔樹(shù)脂對(duì)粗提的花青素進(jìn)行純化。其純化流程為：花青素粗體物→AB-8型大孔樹(shù)脂吸附1 h→用蒸餾水洗脫糖類、色素等→10%的乙醇（pH=4）洗脫雜質(zhì)→30%乙醇洗脫雜質(zhì)（pH=3～4）→80%乙醇洗脫（pH=3～4）→旋蒸（40℃、30r/min）→花青素純化液→真空冷凍干燥→樣品低溫（4℃以下較好）保存?zhèn)溆谩?/p>

23 不同濃度的待測(cè)液對(duì)·OH的清除率 羥自由基清除率的測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[11-12]，10mL具塞試管中加不同濃度的待測(cè)液1mL，依次加入1mL 075mmol/L FeSO4，1mL 075mmol/L鄰二氮菲，最后加入001% H2O21mL，37℃保溫1h，4mL蒸餾水調(diào)零，在536nm下測(cè)定吸光度?？瞻坠苡?mL蒸餾水代替花青素，1mL蒸餾水代替001% H2O2，損傷管用1mL蒸餾水代替花青素，樣品空白管用1mL蒸餾水代替001% H2O2。

OH清除率=（1-A2-A3A0-A1）×100/%

式中，A0為空白管的吸光值；A1為損傷管的吸光值；A2為樣品空白管的吸光值；A3為樣品對(duì)照管的吸光值。

24 不同濃度的待測(cè)液對(duì)H2O2的清除率 測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[12-13]，25mL具塞試管中加不同濃度的待測(cè)液1mL，加入40mmol/L H2O2 25mL，加入65mL蒸餾水，室溫反應(yīng)10min后在230nm下測(cè)定吸光度?？瞻坠苡?mL蒸餾水代替花青素，樣品空白管用25mL蒸餾水代替H2O2 。

H2O2清除率=A0-（A1-A2）A0

式中， A0為不加花青素的吸光度；A1為樣品對(duì)照組的吸光度即加花青素又加40mmol/L H2O2；A2為不加40mmol/L H2O2的吸光度。

25 不同濃度的待測(cè)液對(duì)O2-·的清除率 采用鄰苯三酚自氧化法產(chǎn)生O2-·，加不同濃度待測(cè)液進(jìn)行清除，測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[8-12]，并略做修改。10mL具塞試管中加入15mL 005mol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH=82），15mL蒸餾水，搖勻，25℃水浴中保溫20min，取出后立即加入25℃預(yù)熱過(guò)的3mmol/L鄰苯三酚05mL（以10mmol/L的HCl配制，空白管用10mmol/L的HCl代替鄰苯三酚）迅速搖勻后倒入比色杯中，在325nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算線性范圍內(nèi)每1min吸光度的增加值，即為鄰苯三酚的自氧化速率ΔA對(duì)照。測(cè)定待測(cè)樣品時(shí)加入鄰苯三酚前先加入一定量（15mL）的待測(cè)物（不同濃度的花青素），同時(shí)減少同體積的蒸餾水，其余操作同上，測(cè)出ΔA樣品。

按上式計(jì)算出超氧陰離子的清除率。

3 結(jié)果與討論

31 花青素的提取、分離 提取液制備過(guò)程中需操作迅速，減少花青素的氧化，提高提取率。先處理好樹(shù)脂備用，花青素提取液制備好后立即上樣。質(zhì)量濃度為3g/mL上樣速率為2mL/min，洗脫速率為2mL/min，洗脫體積隨上樣體積增大而增大，可根據(jù)顏色變化進(jìn)行下樣，即顏色由暗紫色變?yōu)闇\紫色，紫色部分即為有效的花青素。240 g新鮮的紫色胡蘿卜用乙醇提取，經(jīng)大孔樹(shù)脂洗脫純化后，再經(jīng)旋蒸冷凍干燥可得花青素樣品約03g。由此可知花青素的提取率為0125%。

由圖1可知，紫色胡蘿卜提取物最大吸收波長(zhǎng)在526nm，而520～530nm為花色苷類物質(zhì)的特征吸收峰，與文獻(xiàn)報(bào)道花青素的紫外-可見(jiàn)吸收光譜一致[14]。

32 不同濃度的待測(cè)液對(duì)·OH的清除率 由圖2知，隨著花青素和Vc濃度的增大，其對(duì)·OH的清除率逐漸增大，并且在同濃度下，Vc對(duì)·OH的清除率要稍高于紫色胡蘿卜中花青素對(duì)·OH的清除率。花青素濃度為15mg/mL時(shí)，其清除率達(dá)到了50%以上；花青素濃度為30mg/mL時(shí)，其對(duì)·OH的清除率為87%，由此可以知道從紫色胡蘿卜中提取的花青素具有較強(qiáng)的抗氧化活性。Vc在06mg/mL時(shí)清除率就已經(jīng)達(dá)到50%以上，30mg/mL時(shí)對(duì)·OH的清除率能達(dá)到94%。在較高濃度下，花青素和Vc對(duì)·OH的清除率比較接近。

33 不同濃度的待測(cè)液對(duì)H2O2的清除率 由圖3可知，隨著花青素和Vc的濃度不斷增大，其對(duì)H2O2的清除率也不斷增大，花青素的清除率呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。在花青素濃度為15mg/mL時(shí)，花青素對(duì)H2O2的清除率就能到達(dá)50%，但Vc在其濃度為20mg/mL時(shí)，對(duì)H2O2的清除率才能達(dá)到50%以上； 當(dāng)濃度低于20mg/mL時(shí)，花青素對(duì)H2O2的清除率高于Vc對(duì)H2O2的清除率；當(dāng)濃度大于20mg/mL時(shí)，花青素對(duì)H2O2的清除率低于Vc對(duì)H2O2的清除率。

34 不同濃度的待測(cè)液對(duì)O2-·的清除率 由圖4、5可知，花青素對(duì)O2-·的清除率隨濃度的增大而增大，當(dāng)花青素的濃度為為15mg/mL時(shí)達(dá)到50%以上，在濃度為20mg/mL時(shí)，其對(duì)O2-·的清除率達(dá)到90%。濃度越大，對(duì)O2-·的清除效果越好。當(dāng)濃度為008mg/mL時(shí)，Vc對(duì)O2-·的清除率達(dá)到了9667%，在004mg/mL時(shí)達(dá)到50%以上?；ㄇ嗨貪舛葹?41mg/mL對(duì)O2-·的清除率相當(dāng)于004mg/mL的Vc對(duì)O2-·的清除率。從數(shù)據(jù)可看出，Vc對(duì)O2-·清除率高于紫色胡蘿卜中的花青素對(duì)O2-·清除率。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了紫色胡蘿卜中花青素的提取、分離，并對(duì)所得花青素進(jìn)行抗氧化活性的研究。結(jié)果表明，紫色胡蘿卜中提取所得的花青素有很好的抗氧化活性，但其抗氧化活性沒(méi)有同濃度的維生素C的活性高，這可能是在花青素的提取分離過(guò)程中的部分環(huán)節(jié)，導(dǎo)致部分花青素聚集體解離、失去了活性。通過(guò)該研究，增加了花青素的來(lái)源，提高紫色胡蘿卜的利用價(jià)值；使花青素在醫(yī)藥和保健等領(lǐng)域能夠得到更好的應(yīng)用；此外紫色胡蘿卜物美價(jià)廉，含有豐富的糖類物質(zhì)，本身具有很好的口感，可以作為很好的保健飲品在日常飲食和市場(chǎng)中推廣。

參考文獻(xiàn)

[1]Anna R， Renato C N， Daniela V， et al. Modification of glass transition temperature through carbohydrates addition and anthocyanin and soluble phenol stability of frozen blueberry juices[J]. J Food Eng， 2003，56（2-3） ：229 -231.

[2]Joao RM A， Eleonora DA， Anja P， et al. Characterization of major enzymes and genes involved in flavonoid and proanthocyanidin biosynthesis during fruit development in strawberry （Fragaria×ananassa）[J]. Arch Biochem Biophys， 2007， 465（1） ：61 -71.

[3]Anne C K， Beverly A C， Steven J B， et al. Plasma and Urine Responses Are Lower for Acylated vs Nonacylated Anthocyanins from Raw and Cooked Purple Carrots [J]. Agric. Food Chem，2005，53： 6537-6542.

[4]Ghiselli A， Nardini M， Baldi A， et al. Antioxidant activity of different phenolic fractions separated from an Italian red wine[J]. Agric. Food Chem，1998， 46： 361-367.