吳越 朱峰 劉建平 李永民

?

·論著·

四逆散對高脂血癥小鼠血脂代謝途徑的影響

吳越 朱峰 劉建平 李永民

目的 探討四逆散對高脂血癥C57BL/6小鼠脂代謝的影響并初步探討其機制。方法 40只SPF級C57BL/6小鼠作為研究對象，隨機分為對照組、模型組、四逆散(0.9 mg/g體質量)組、枳實(0.9 mg/g體質量)組，分別以生理鹽水、四逆散水煎劑、枳實水煎劑灌胃，干預時間為90天。全自動生化分析儀檢測血清甘油三脂(triglyceride，TG)，低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)，高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、ELISA法檢測血清載脂蛋白A-1(apolipoprotein A-1，APOA-Ⅰ)水平及實時定量反轉錄-聚合酶鏈反應檢測肝臟以及小腸組織中APOA-I的mRNA基因表達情況。結果 在脂代謝方面，四逆散干預可顯著防止高脂飲食小鼠血清TG、LDL-C水平的升高(P<0.05)，顯著提升血清中HDL-C和APOA-I水平(P<0.05)，顯著增加肝臟中APOA-I的mRNA表達程度(P<0.05)。結論 四逆散可能是通過促進肝臟APOA-I mRNA表達和增加APOA-I分泌來干預血脂水平。

四逆散； 高脂血癥； 載脂蛋白A-I

高脂血癥是指血中脂肪代謝或轉運異常而導致的任一或所有的脂質和(或)脂蛋白異常升高。高脂血癥的存在增加了高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化、冠心病和腦卒中等疾病的發(fā)病率，并且影響其嚴重程度[1-2]。目前用于干預高脂血癥患者的降脂藥物可能有導致其轉氨酶升高或其他毒副作用產生的風險[3]，在積極干預高脂血癥患者及高危人群的血脂水平的同時尋找新的低毒高效的防治藥物是目前的迫切需求[4]。中醫(yī)學的整體觀念對治療各種疾病具有一定的指導意義和優(yōu)勢，“高脂血癥”屬于中醫(yī)“痰濕”“濁阻”等范疇[5]。高脂血癥發(fā)病與肝郁脾滯、氣機不暢、運化不利而致痰濕郁滯密切相關，其治療以疏肝健脾、調暢氣機、除濕化痰為主。四逆散作為漢代名醫(yī)張仲景所著《傷寒論》中的經方可達木疏土、安和中州，臨床上主要用于治療肝脾氣滯、脾胃虛弱或氣機郁遏等證[6]。在本實驗中筆者團隊采用高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠作為研究模型，觀察四逆散對脂質代謝途徑的干預。

1 材料

1.1 實驗材料

SPF級C57BL/6雄性小鼠40只，體質量(20±2)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物具備實驗動物合格證書SCXK(京)2012-0001號。實驗動物在清潔級層流架中飼養(yǎng)，環(huán)境溫度(23±2)℃，照明時間每天12小時(7：00～19：00)適應性飼養(yǎng)1周后進行試驗。

1.2 高脂飼料配置

3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10 %豬油、81.3 %基礎飼料，實驗動物所用普通飼料和高脂飼料均購于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK(京)2014-0008。

1.3 藥品

四逆散中柴胡、枳實、白芍、炙甘草均由中國北京同仁堂(集團)有限責任公司購買。藥材洗凈后以10倍量水煎煮1.5小時，倒出濾液，再以5倍量水煎煮1小時，合并濾液水浴濃縮成每毫升含生藥1.5 g，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 試劑

總甘油三酯測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白固醇測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供；載脂蛋白A-I測定試劑盒購自武漢基因美生物醫(yī)學工程有限公司；TRIzol法提取總RNA所用TRIzol試劑購于Invitrogen公司、用于RT-PCR的Prime Script?RT reagent Kit with gDNA Eraser及SYBR?Premix Ex Taq TM II試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司，其余試劑為國產分析純試劑。

1.5 儀器

儀器包括全自動生化分析儀、Thermo Scientific Heraeus Fresco 21微量離心機、Thermo Multiskan MK3全自動酶標儀、Thermo Arktik多功能PCR儀、Thermo Scientific NanoDrop 2000、ABI 7300實時熒光定量PCR儀。

2 方法

2.1 動物分組及標本采集

健康雄性C57BL/6實驗小鼠40只，飼養(yǎng)1周后隨機分為4組，每組10只：對照組、模型組、四逆散組、枳實組(陽性對照組)。每日給予足量飼料，空白對照組以普通飼料喂養(yǎng)，其余組均以高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料若第二天還有剩余則用新的高脂飼料代替，自由飲水[7]。四逆散組用上述四逆散煎液灌胃，劑量0.02 mL/(g·d)，枳實組用上述枳實煎液灌胃，劑量0.02 mL/(g·d)，模型組和空白組用生理鹽水灌胃0.02 mL/(g·d)，每天1次，以高脂飼料喂養(yǎng)開始連續(xù)90天，禁食不禁水16小時，麻醉后摘眼球取血備用。采血后處死，每只小鼠取肝臟、小腸，焦硫酸二乙酯處理水清洗后分裝到焦硫酸二乙酯處理過的凍存管中，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 血清相關指標測定

將全血室溫放置0.5小時，4000 rpm離心5分鐘，取上層血清為測試樣品，按試劑盒說明分別測定血清甘油三脂(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、ELISA法檢測血清載脂蛋白A-1(apolipoprotein A-1，APOA-I)。

2.3 肝臟和小腸中APOA-I mRNA表達的檢測

TRIzol法提取小鼠肝臟及小腸總RNA，組織在液氮中研磨成粉后，每50 mg組織加入1mL TRIzol，根據TRIzol試劑說明書進行總RNA提取。按照說明書逆轉錄。(1)在RNase free的離心管內配制混合液：Total RNA：1 μL；5×gDNA Eraser Buffer：2 μL；gDNA Eraser：1 μL；RNase Free dH2O：up to 10 μL。(2)42℃溫育2分鐘以除去基因組DNA。(3)取上述反應液10 μL，5×PrimeScripT?Buffer2(for Real Time)：4 μL；PrimeScripT?RT Enzyme Mix I：1 μL；RT Primer Mix：1 μL；RNase Free dH2O：up to 20 μL。反轉錄體系為37℃15分鐘、85℃5秒、4℃，獲取cDNA模版。(4)qPCR反應體系：SYBR?Premix Ex Taq II(TIIRNaseH Plus)(2×)：10 μL；Primer R (10 μM)：0.8 μL；Primer F (10 μM)：0.8 μL；ROX Reference Dye(50×)：0.4 μL；cDNA：2 μL；dH2O：6 μL。PCR反應條件為：20 μL反應體系兩步法PCR擴增，預變性95℃30秒，PCR反應95℃5秒、60℃31秒，共40個循環(huán)。引物信息見表1。

表1 APOA-ImRNA和β-actin引物信息

2.4 統(tǒng)計學處理

3 結果

3.1 各組小鼠血清TG、LDL-C、HDL-C及APOA-I水平

與對照組相比，模型組小鼠血清TG和LDL-C水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，四逆散組和枳實組小鼠血清TG和LDL-C水平均顯著降低(P<0.05)，四逆散組HDL-C水平顯著升高(P<0.05)。四逆散組和枳實組TG和HDL-C水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。四逆散組血清APOA-I含量明顯高于模型組和對照組(P<0.05)，但枳實組APOA-I只與模型組有差別(P<0.05)，說明四逆散可通過提高血清APOA-I促進脂質在體內的消化。見表2。

3.2 小腸和肝臟APOA-I mRNA基因實時熒光定量方法檢測

3.2.1 方法的特異性分析 溶解曲線可見APOA-I mRNA基因與β-Actin RNA基因的熒光定量產物均呈較為銳利的單一峰(圖1、圖2)，溶解溫度Tm分別為86.1℃和84.9℃。溶解曲線中沒有其他雜峰出現，可知在用SYBR Green熒光染料進行RT-PCR檢測時，熒光信號全部為RT-PCR擴增產物，沒有其他干擾，驗證了反應的特異性。

表2 四逆散對高脂血癥小鼠血清TG、LDL-C、HDL-C及APOA-I水平的影響

注： 與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

圖1 APOA-I mRNA擴增產物溶解峰圖

圖2 β-Actin RNA擴增產物溶解峰圖

3.2.2 APOA-I mRNA基因 在小腸和肝臟中相對表達量在小腸中，APOA-I mRNA 2在四個實驗組中均有不同的表達，在四逆散組APOA-I mRNA表達量最高，約為模型組的2.4倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。對照組APOA-I mRNA的表達量約是模型組的1.5倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，枳實組的APOA-I mRNA的表達量與模型組表達量相當，差異不顯著(P>0.05)。在肝臟中，四逆散組APOA-I mRNA的表達量約是模型組的5倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。枳實組APOA-I mRNA的表達量約是模型組的3倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，對照組APOA-I mRNA的表達量約是模型組的2.2倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。將模型組mRNA的相對表達量作為一個單位，由此計算出四組小腸和肝臟中APOA-I mRNA的相對表達量。四逆散組、枳實組、對照組的肝臟APOA-I mRNA的表達量均比小腸中的高。

表3 APOA-I mRNA在小腸和肝臟中的相對表達量

注： 與模型組比較，aP<0.05。

4 討論

脂質在體內的過量積累能夠直接引起高脂血癥，進而誘發(fā)各種疾病。鑒于飲食是導致人類高脂血癥發(fā)生的重要原因，因此在實驗研究中模擬高脂血癥的發(fā)病規(guī)律，用高脂飲食誘導小鼠高脂血癥模型以研究相關病理生理改變，對干預目前高脂血癥的發(fā)生發(fā)展有一定的意義[8]。

中醫(yī)治療高脂血癥是以“郁”“痰”“瘀”為根本出發(fā)，四逆散以柴胡疏肝解郁，透熱邪于外；枳實行氣導滯，散積結于內；柴胡與枳實配伍可奏升清降濁之功。芍藥柔肝養(yǎng)血斂陰，與柴胡共奏疏經通絡之效而無耗傷陰血之弊；炙甘草益脾和胃而安中。四藥合用疏肝和脾，調達氣機，促進臟腑功能復常，運化水濕痰液，避免聚而成痰[9]。研究證實組成四逆散的四味中藥的成分均有不同程度的降血脂作用，甘草酸通過促進血管壁細胞脂質外流降低了血清TG、總膽固醇(total cholesterol，TC)水平進而調節(jié)血管壁的脂質沉積[10]。芍藥苷可減少動脈粥樣硬化模型小鼠血清中TC和TG水平，使其腹主動脈脂質沉積顯著減少[11]。柴胡可改善四氧嘧啶誘導的高脂血癥小鼠血清中TG、TC、LDL-C升高及HDL-C降低的情況[12]。枳實能夠通過改善高脂血癥患者內皮功能以降低血清TC、TG和、LDL-C含量，升高HDL-C含量[13]。本實驗證實四逆散可顯著干預高脂血癥小鼠血清的TG、LDL-C上升水平且可升高HDL-C的水平。

四逆散降血脂的機制之一可能是影響肝臟APOA-I mRNA基因的表達促使APOA-I分泌增多，APOA-I約占HDL蛋白組成的70%，因而血清APOA-I的濃度與HDL-C水平密切相關。新生的APOA-I作為ATP結合盒式轉運子的配體可以促進巨噬細胞內膽固醇流出并與之形成新的HDL，新生及圓盤狀HDL不斷地從外周組織攝取磷脂和游離膽固醇逐漸成為成熟的HDL，進行脂質結合和分化無脂APOA-I，進一步激活卵磷脂膽固醇脂?；D移酶促進膽固醇的酯化以實現膽固醇逆向轉運[14-15]，實現膽固醇在肝外組織的清除，達到干預血脂的目的。

四逆散[16]具有一定的防止肝損傷的作用且均優(yōu)于方中單味藥柴胡[17]、白芍[18]、枳實[19]和甘草[20]，在降脂治療過程配合四逆散干預血脂代謝途徑，可達到降脂保肝目的。

[1] kazuo Shigematsu，Yoshiyuki Watanabe，Hiromi. Nakano Influences of hyperlipidemia history on strokeoutcome； a retrospective cohort study based onthe Kyoto Stroke Registry[J].BMC Neurology，2015，15(1)：1-6.

[2] Karcher HS，Holzwarth R，Mueller HP，et al. Body fat distribution as a risk factor for cerebrovascular disease：an MRI-basedbody fat quantification study[J].Cerebrovasc Dis，2013，35(4)：341-348.

[3] Michael Demyen，Kawtar Alkhalloufi，Nikolaos T. Pyrsopoulos. Lipid-Lowering Agents and Hepatotoxicity[J].Clin Liver Dis，2013，17(4)：699-714

[4] Seth S，Martin Erin D，Michos. Mapping Hyperlipidemia in Young Adulthood to Coronary Risk：Importance of Cumulative Exposure and How to Stay Young[J].Circulation，2015，131(5)：445-447.

[5] 樸勝華，郭姣，胡竹平. 高脂血癥住院患者中醫(yī)證候臨床研究[J].中國中西醫(yī)結合雜志 2012，32(10)：1322-1325 .

[6] 張喬，金陽，徐瑞鑫，等.四逆散有效組分改善睡眠作用與5-羥色胺能神經系統(tǒng)相關性的實驗研究[J].中國醫(yī)藥導報，2012，14(9)：29-30.

[7] 陳華.醫(yī)學實驗動物學[M].北京：軍事醫(yī)學科學出版社，2013：270-273.

[8] Ma S，Yu H，Zhao Z，et al. Activation of the cold-sensing TRPM8channel triggers UCP1-dependent thermogenesis and prevents obesity[J]. J Mol Cell Biol，2012，4(2)：88-96.

[9] 趙玉敏. 調暢氣機在治療高脂血癥中的意義[J].中華中醫(yī)藥雜志，2005，20(8)：488-489

[10] 黃金花，馬俐，杜芬，等.甘草酸對動脈粥樣硬化斑塊的消退作用[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2015，35(7)：571-575.

[11] 吳東方，靳善睿，劉娟，等.芍藥苷抗ApoE基因缺失小鼠動脈粥樣硬化作用的初步研究[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2015，35(5)：385-388

[12] 邵淑麗，徐興軍，馬德濱，等.柴胡、姜黃對小白鼠實驗性高脂血癥的預防作用[J].中醫(yī)藥學報，2002，30(4)：59-60.

[13] 吳立華，吉中強，紀文巖，等.枳實對高脂血癥患者血脂和內皮功能的影響[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2012，10(3)：283-285

[14] 吳劍鋒，唐艷艷，曾高峰，等. 載脂蛋白AI對HDL生成影響的研究新進展[J].生理科學進展，2014，45(2)：81-86.

[15] Lagerstedt JO，Budamagunta MS，Liu GS，et al． The “beta-clasp” model of apolipoprotein A-I a lipid-free solutionstructure determined by electron paramagnetic resonance spectroscopy[J]. Biochim Biophys Acta，2012，1821(3)：448-455．

[16] 蔣潔云，徐強.四逆散及其各組成中藥對實驗性肝損傷的影響[J].中國天然藥物，2004，2(1)：45-49

[17] 鄭純威，丁華熳，陳宇，等.柴胡皂苷改善大鼠肝纖維化的實驗研究[J]．中國中醫(yī)急癥，2011，20(5) ：755．

[18] 魏偉，劉家駿，劉家琴，等.白芍總苷對乙型肝炎的治療作用及其前景[J]．中國藥理學通報，2000，16(5) ：596

[19] 焦士蓉，黃承鈺，王波，等.枳實提取物對實驗性糖尿病小鼠肝臟抗氧化防御功能的影響[J]. 衛(wèi)生研究，2007，36(6):689-693.

[20] 陳云華，黃明進，王文全，等.不同來源甘草藥材成分含量及其保肝降酶作用比較[J]. 中國實驗方劑學雜志， 2013，18(19):113-116.

(本文編輯： 董歷華)

Effects ofSinipowder on blood lipid metabolism in mice with hyperlipidemia

WUYue，ZHUFeng，LIUJian-Ping，etal.

ShanxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Taiyuan030024，China

LIYong-min，E-mail：liyongmin2001@sina.com

Objective To observe the effects ofSinipowder on C57BL/6J mice with hyperlipidemia and explore its mechanism. Methods 40 C57BL/6 mice were randomly divided into blank control group，hyperlipidemia group，hyperlipidemia plusSinipowder (0.9 mg/g weight) group and hyperlipidemia plus fructus aurantii immaturus (0.9mg/g weight). Blank control group were fed with normal diet and the other groups were fed with high fat diet. Mice were received gavage administration with corresponding drug，Sinipowder and fructus aurantii immaturus were intervened for 90 days. The automatic biochemistry analyzers method was used to measure the levels of TG，LDL-C，HDL-C in serum. Elisa methods were used to detect the APOA-I levels in serum. Real-time PCR methods were used to detect the APOA-I mRNA expression changes in liver and small intestine. Results Compared with hyperlipidemia group，Sinipowder could decrease the levels of TG and LDL-C(P<0.05)，increase the levels of HDL-C and improve the level of APOA-I in serum(P<0.05). The mRNA expressions of APOA-I in liver was increased inSinipowder combined hyperlipidemia group. ConclusionSinipowder may be to promote the expression of mRNA APOA-I in liver and increase APOA-I secretion to interfere with blood lipid level.

Sinipowder； Hyperlipidemia； Apolipoprotein A-1

河北北方學院創(chuàng)新人才培育基金(CXRC1319)；河北省中醫(yī)藥管理局課題(2015171)

030024 太原，山西中醫(yī)學院(吳越)；河北北方學院中醫(yī)學院(朱峰、李永民)；中南大學湘雅二醫(yī)院(劉建平)

吳越(1991- )，2014級在讀碩士研究生。研究方向：中醫(yī)藥防治心血管疾病。E-mail：dawn_233@163.com

李永民(1970- )，博士，教授。研究方向：中醫(yī)內科學、中藥藥理學。E-mail：liyongmin2001@sina.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.12.003

2016-07-22)