張知俠

(咸陽(yáng)師范學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西咸陽(yáng) 712000)

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虎耳草精油化學(xué)成分及其抑菌活性

張知俠

(咸陽(yáng)師范學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西咸陽(yáng) 712000)

采用水蒸氣蒸餾法提取虎耳草精油，通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)對(duì)精油進(jìn)行成分分析。鑒定出35種化學(xué)成分，占總餾出峰面積的 78.22%，主要成分為十五烷酸27.93%， (2E,5E)-3,4,5,6-四甲基-2-5-辛二烯6.28%、鄰苯二甲酸丁酯辛酯5.54%、9-十六碳烯酸5.01%。生長(zhǎng)速率法測(cè)定表明，虎耳草精油對(duì)小麥全蝕病菌和番茄早疫病菌的抑制活性較高，在500 mg/L劑量下抑制率均在90%以上；對(duì)玉米大斑病菌和油菜菌核病菌在750 mg/L劑量下的抑制率在80% 以上，而對(duì)其他幾種病菌的抑制率相對(duì)較低。

虎耳草；精油；化學(xué)成分；抑菌活性

虎耳草[Saxifragastolonifera(L.)Meerb.]為虎耳草科虎耳草屬的多年生草本植物，產(chǎn)于河北、陜西、甘肅的東南部、江蘇、浙江、安徽、湖北北部等地。其主要成分有巖白菜素、槲皮素、原兒茶酸、虎耳草素、黃酮、山奈酚、蘆丁、槲皮素-3 -鼠李糖苷、沒(méi)食子酸、琥珀酸、反甲基丁烯二酸、正十六烷酸、8,10 二甲氧基-十八烷酸、辛酯二烯等[1-5]。虎耳草全草可入藥，其性狀略帶微辣、味微苦，有消腫祛濕和清熱解毒的作用。在中國(guó)民間很早就用來(lái)治療急性中耳炎、燙傷，效果明顯，虎耳草還具有消炎、鎮(zhèn)痛、止血、止咳的作用。近年來(lái)，對(duì)虎耳草的藥理研究取得了新的進(jìn)展，研究發(fā)現(xiàn)虎耳草乙酸乙酯、乙醇提取物可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖，對(duì)治療前列腺癌細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡作用[6]，乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌有抑制作用[7]，其中巖白菜素沒(méi)食子酸酯類對(duì)丙型肝炎絲氨酸蛋白酶具有一定抑制活性[8]，活性成分槲皮素對(duì)人的胃腺癌細(xì)胞增殖具有抑制作用[9]，虎耳草總黃酮可提高抗氧化酶活力，具有抗衰老作用[10], 虎耳草還可用來(lái)治療乳腺小葉增生癥[11]?？梢姡⒍菰谒幱梅矫嬗泻芨叩难芯?jī)r(jià)值。本試驗(yàn)對(duì)虎耳草精油的化學(xué)成分及其抑菌活性進(jìn)行研究，旨在充分挖掘虎耳草精油作為農(nóng)藥的有效成分，為開發(fā)天然產(chǎn)物農(nóng)藥提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

虎耳草全草購(gòu)置于成都中藥材市場(chǎng)，產(chǎn)地四川。粉碎過(guò)30 目篩后于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

供試病原菌：玉米大斑病菌 [Exserohilumturcicum(Pass.)Leonard & Suggs];番茄早疫病菌 [Alternariasolani(Ell,et Mart) Johnes et Grout]、辣椒疫霉病菌 (PhytophthoracapsiciLeonian)、番茄灰霉病菌 (BotrytiscinereaPers. ex Frs.)、番茄枯萎病菌 (Fusariumoxysporumf.sp. Lycopersici Snyder et Hansen)、蘋果腐爛病菌 (ValsamaliMiyabe et Yamada)、黃瓜黃萎病菌 (VerticilliumdahliaeKleb)、小麥全蝕病菌 [Gaeumannomycesgraminis(Sacc.) Arx.et Olivier]、油菜菌核病菌 [Sclerotiniasclerotiorum(Lib.) de Bary]、小麥赤霉病菌 [Fusariumgiaminearum(Schw.) Petch]，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)無(wú)公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心提供。試驗(yàn)中辣椒疫霉病菌用V8 培養(yǎng)基培養(yǎng), 其余病菌用 PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 儀 器

全自動(dòng)蒸汽滅菌鍋(D-1型)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R213型)，智能型生化培養(yǎng)箱(SPX-150B型 )，日本島津(SHIMADZU)GC-MS/QP2010 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 虎耳草精油提取 稱取虎耳草試驗(yàn)樣品60 g于1 000 mL蒸餾燒瓶中，加350 mL蒸餾水浸泡2 h后，采用水蒸氣蒸餾法[12]連續(xù)蒸餾8 h，共收集餾出液2 000 mL，將此餾出液經(jīng)氯化鈉飽和后用石油醚萃取3次，合并石油醚萃取液加無(wú)水硫酸鈉干燥, 將干燥后的萃取液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮回收石油醚, 即得虎耳草精油。

1.3.2 GC-MS分析 氣相色譜條件: 島津CBP5-M25-025彈性石英毛細(xì)管色譜柱(25 m×0.25 mm×0.25 μm) ; 載氣為純度99.995%的氦氣; 柱初溫 60 ℃, 保溫 2 min, 以 10 ℃/min升溫速率升至 240 ℃, 保溫 2 min; 進(jìn)樣口溫度 260 ℃；柱前壓 63.4 kPa, 分流比 1∶100; 進(jìn)樣量 1 μL。

質(zhì)譜條件: EI 離子源, 電子能量 70 eV,電子倍增器電壓0.97 V，質(zhì)量掃描范圍 29m/z～350m/z, 離子源溫度 200 ℃, 接口溫度230 ℃，溶劑峰切除時(shí)間 2.0 min, 質(zhì)譜檢測(cè)起測(cè)時(shí)間 2.5 min。質(zhì)譜圖計(jì)算機(jī)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)NIST 147 。

1.3.3 抑菌活性測(cè)定 采用生長(zhǎng)速率法[13]測(cè)試虎耳草精油的抑菌活性，選用玉米大斑病菌、番茄早疫病菌等10種病原菌。配制虎耳草精油的丙酮溶液: 采用虎耳草精油配制成質(zhì)量濃度為 1 500 mg/L 的母液, 然后將其進(jìn)行稀釋成質(zhì)量濃度分別為1 500、1 200、1 000、750、500 mg/L的系列溶液, 在無(wú)菌條件下將配制的不同質(zhì)量濃度的虎耳草精油溶液分別加入到冷卻至50 ℃的PDA 培養(yǎng)基(辣椒疫霉病菌用 V8培養(yǎng)基)中。每次取1 mL虎耳草精油溶液加入到9 mL的培養(yǎng)基中，混合均勻倒入直徑為90 mm的培養(yǎng)皿，制成帶毒的平板培養(yǎng)基, 然后在平面上接種供試的病原菌, 每濃度處理重復(fù)3次。 在 26 ℃下置于生化培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng), 72 h后通過(guò)卡尺用十字交叉法測(cè)量供試真菌菌落生長(zhǎng)直徑,取其平均值。根據(jù)公式(1)和(2)計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。

菌落生長(zhǎng)直徑= 2次直徑平均值-4.0(菌餅直徑)

(1)

菌絲生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照菌生長(zhǎng)直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑×100%

(2)

2 結(jié)果與分析

2.1 虎耳草精油收率

采用水蒸氣蒸餾法得到的虎耳草精油為黃色具有特殊氣味的油狀液體。稱量后計(jì)算虎耳草精油收率為0.712%。

2.2 虎耳草精油化學(xué)成分的GC-MS分析

按“1.3.2”的試驗(yàn)方法和條件，對(duì)精油的化學(xué)成分進(jìn)行GC-MS 分析, 得虎耳草精油的總離子流圖1。應(yīng)用 SHIMADZUGCMSsolution Release 2.10 專業(yè)分析軟件對(duì)總離子流圖進(jìn)行分析，得到 35 個(gè)色譜峰, 按色譜峰面積歸一法確定各組成化合物的相對(duì)百分含量。成分鑒定根據(jù) GC-MS 聯(lián)用測(cè)定所得到的質(zhì)譜信息, 應(yīng)用 NIST147 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索, 通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)照、分析，確定虎耳草精油的成分有35種,占總餾出峰面積的 78.22%。其成分含量最高的為十五烷酸(27.93% )， 其次是 (2E,5E)-3,4,5,6-四甲基-2-5-辛二烯(6.28%)、鄰苯二甲酸丁酯辛酯(5.54%)、9-十六碳烯酸(5.01%)。還含有少量其他的烴類、醇類、酸類和烯類等(表1)。

圖1 虎耳草精油總離子流圖

2.3 虎耳草精油抑菌活性測(cè)試

用生長(zhǎng)速率法測(cè)試表明，虎耳草精油對(duì)供試的10種病原菌表現(xiàn)出不同程度的抑菌活性。其對(duì)小麥全蝕病菌和番茄早疫病菌的抑制活性最強(qiáng)，在500 mg/L劑量下抑制率均在90%以上；對(duì)玉米大斑病菌和油菜菌核病菌的抑制活性次之，在750 mg/L劑量下抑制率均在80%以上，而對(duì)其他幾種供試病菌的抑制活性相對(duì)較低(表2)。

表1 虎耳草精油化學(xué)成分與相對(duì)含量

表2 虎耳草精油對(duì)10種病原菌的抑制效果

3 結(jié) 論

利用水蒸氣蒸餾法獲得虎耳草精油。通過(guò) GC-MS方法對(duì)其精油進(jìn)行成分分析，鑒定出35 個(gè)成分，占總餾出峰面積的 78.22%。檢測(cè)得到虎耳草精油化學(xué)成分含量最高的是十五烷酸(27.93%)， 其次是 (2E,5E)-3,4,5,6-四甲基-2-5-辛二烯(6.28%)、鄰苯二甲酸丁酯辛酯(5.54%)、9-十六碳烯酸(5.01%)。這與先春等[14]、左國(guó)營(yíng)等[2]對(duì)虎耳草成分研究結(jié)果差異很大，原因除研究方法不同，與產(chǎn)地氣候土壤等因素也有一定關(guān)系。

通過(guò)對(duì)供試病原菌的抑菌試驗(yàn)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，虎耳草精油對(duì)小麥全蝕病菌和番茄早疫病菌的抑制活性最強(qiáng)，試驗(yàn)質(zhì)量濃度下抑制率均在90%以上，對(duì)玉米大斑病菌和油菜菌核病菌的抑制率在75%以上，對(duì)其他幾種病菌也有不同程度的抑制率。該結(jié)果與鈕緒燕等[15]用石油醚和二氯甲烷對(duì)虎耳草提取物所做的抑菌效果是一致的。由此可見，虎耳草精油含有重要的抑菌活性成分，目前的效果只是精油綜合作用的結(jié)果，具體的單體活性成分有待進(jìn)一步分離鑒定，并通過(guò)進(jìn)一步的抑菌試驗(yàn)，有可能發(fā)現(xiàn)具有新型殺菌活性的先導(dǎo)化合物, 為新型抑菌劑的創(chuàng)制奠定基礎(chǔ)。

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Received 2016-01-21 Returned 2016-04-01

Foundation item Scientific Researching Funding Projects form Xianyang Normal University (No.13XSYK026).

About author ZHANG Zhixia, female, senior engineer. Research area: natural products analysis and application.E-mail:zhazhixia@126.com

(責(zé)任編輯：史亞歌 Responsible editor:SHI Yage)

Chemical Constituents and Antibacterial Activity of Essential Oil fromSaxifragastolonifera

ZHANG Zhixia

(Department of Chemistry, Xianyang Normal University, Xianyang Shaanxi 71200,China )

The essential oil ofSaxifragastoloniferawas extracted by steam distillation. Components of the essential oil were analyzed by GC-MS and 35 components were identified, accounting for 78.22% of total compositions. The essential oils mainly consisted of pentadecanoic acid(27.93%), (2E,5E)-3,4,5,6-tetramethy -2,5-octadiene(6.28%), phthalic acid,butyl octyl ester(5.54%) and 9-hexadecenoic acid (5.01%). The test of inhibition rate against mycelial growth showed that essential oil fromSaxifragastoloniferahad good antifungal effects, and the inhibition rates surpassed 90% at the concentrations of 500 mg/L against gaeumannomyces graminis andAlternariasolani, at 500 mg/L dose，and above 80% ofExserohilumturcicumand sclerotinia scleroticorum，at 750 mg/L dose，and the rest of the fungus had weaker inhibition.

Saxifragastolonifera; Essential oils ; Extract; Antifugal activity

2016-01-21

2016-04-01

咸陽(yáng)師范學(xué)院科研基金(13XSYK026)。

張知俠,女,高級(jí)工程師, 研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物分析及其應(yīng)用。E-mail:zhazhixia@126.com

日期：2016-10-20

O629.9

A

1004-1389(2016)10-1536-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161020.1655.034.html