楊鳳珍，郭建國，杜 蕙，王春明，郭 成，金社林，王生榮

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院，蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，蘭州 730070)

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甘肅玉米大斑病菌對吡唑醚菌酯的敏感性監(jiān)測分析

楊鳳珍1,2，郭建國2，杜 蕙2，王春明2，郭 成2，金社林2，王生榮1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院，蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，蘭州 730070)

為明確甘肅玉米大斑病菌對吡唑醚菌酯的敏感基線和抗藥性水平，采用平皿法測定甘肅省4個典型生態(tài)區(qū)57株玉米大斑病菌對吡唑醚菌酯的敏感性。結(jié)果表明，甘肅玉米大斑病菌對吡唑醚菌酯的敏感性差異較小，EC50為0.10～1.56 mg/L，EC50平均值為0.66 mg/L，49株菌株EC50連續(xù)性正態(tài)分布時的EC50平均值 0.61 mg/L即為甘肅玉米大斑病菌對吡唑醚菌酯的敏感基線；基于此發(fā)現(xiàn)，甘肅玉米大斑病菌對吡唑醚菌酯的平均抗性為1.08，最高抗性為2.55，暫未出現(xiàn)抗藥性，其中中部干旱雨養(yǎng)生態(tài)區(qū)5株菌株十分敏感，平均抗性和最高抗性分別為0.84和1.11，而河西干旱灌溉生態(tài)區(qū)15株菌株敏感性較低，平均抗性和最高抗性分別為1.23和2.55，需警惕其抗藥性。

玉米大斑病菌；吡唑醚菌酯；敏感性

玉米大斑病(Northern Corn Leaf Blight)是中國北方春玉米區(qū)的一種嚴(yán)重葉枯病害，一般發(fā)病年份減產(chǎn)20%左右，嚴(yán)重年份減產(chǎn)50%以上，發(fā)病時可加重玉米根病流行，嚴(yán)重影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)。國內(nèi)外研究表明，玉米大斑病菌具有明顯生理分化現(xiàn)象[1]，小種變異是品種抗性喪失的主要原因[2]。Strobilurins類殺菌劑[3]是防治該病害化學(xué)防治的一種重要手段，其是在研究天然活性物質(zhì)嗜球果傘菌素結(jié)構(gòu)和作用機理基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)的單點β-甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑[4]，因其不易與其他類殺菌劑產(chǎn)生交互抗性而成為新型農(nóng)藥開發(fā)研究的熱點[5]。吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin)是該類殺菌劑的典型代表，由巴斯夫公司于2002年開發(fā)，目前已廣泛應(yīng)用于玉米葉部病害防治[6]。有研究顯示，吡唑醚菌酯已對尾孢屬(Cercospora)[7]、葡萄孢屬(Botrytis)[8]和核盤菌屬(Sclerotinia)[9]等15屬20余種病原菌普遍產(chǎn)生抗藥性，但有關(guān)其對玉米大斑病菌敏感性監(jiān)測方面的研究暫未見報道。甘肅省是中國西部內(nèi)陸省份，由東南向西北降雨量依次遞減，氣候呈現(xiàn)東南濕潤、中部干旱和西北高寒的特征[10]，玉米種植形成了河西制種與河?xùn)|高產(chǎn)栽培的兩翼結(jié)構(gòu)，中東部和南部中、晚熟玉米種植數(shù)量較多，生育期偏長。環(huán)境條件多樣和物候期延長為玉米大斑病害發(fā)生提供了良好環(huán)境，致使玉米葉部病原產(chǎn)孢量增加，變異速率加快，侵染循環(huán)周期縮短，發(fā)生普遍率和嚴(yán)重度日益增加，已嚴(yán)重影響甘肅玉米生產(chǎn)安全[11]。為此，本研究于2013-2014年采集甘肅河西干旱灌溉、中部干旱雨養(yǎng)、隴東半濕潤半干旱和隴南濕潤氣候區(qū)的玉米大斑病標(biāo)樣，分離純化后測定其對吡唑醚菌酯的敏感性，旨在明確甘肅玉米大斑病菌對吡唑醚菌酯的敏感基線和抗性水平，為甘肅玉米大斑病科學(xué)防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試菌株：2013-2014年采集甘肅河西干旱灌溉農(nóng)業(yè)區(qū)(酒泉、張掖和武威3市)、中部干旱雨養(yǎng)生態(tài)區(qū)(定西市)、隴東半濕潤半干旱生態(tài)區(qū)(平?jīng)?、慶陽2市)和南部濕潤生態(tài)區(qū)(天水、隴南2市)的玉米大斑病樣，帶回室內(nèi)沖洗干凈并晾干后，剪取病健交界處0.5 cm×0.5 cm葉片4～5塊，用φ=75%酒精表面消毒2～3 min，滅菌水沖洗3～4次，滅菌濾紙吸水后置于PDA平板，25 ℃光照培養(yǎng)，待菌絲產(chǎn)孢后在顯微鏡下挑取單孢進(jìn)行分離純化，獲得57株菌株，其中，從酒泉、張掖、武威和定西地區(qū)采集的病樣中獲得的菌株均為5株，天水、隴南地區(qū)樣品中獲得的菌株均為6株，平?jīng)龅貐^(qū)和慶陽地區(qū)樣品中獲得的菌株分別為8株和17株，各菌株均于4 ℃冰箱保存，備用。

藥劑：將51.5 g吡唑醚菌酯原藥(97.5%吡唑醚菌酯，巴斯夫歐洲公司生產(chǎn))溶解于948.5 mL丙酮配制成50 g/L的近似飽和溶液，再將此藥液稀釋1 000倍配制成50 mg/L藥液，備用。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯 2 kg、瓊脂粉150 g、葡萄糖200 g，補水至10 L，分別量取995、990、980、960和920 mL培養(yǎng)基分裝至2 000 mL三角瓶，加塞、包扎，121 ℃滅菌20 min，冷卻后貯存，備用。

1.2 方 法

1.2.1 病菌敏感性測定 采用菌絲生長速率法[12]測定玉米大斑病菌對吡唑醚菌酯的敏感性，首先分別將995、990、980、960和920 mL PDA培養(yǎng)基加熱融化、待冷卻至45 ℃左右時，依次吸取50 mg/L藥液5、10、20、40和80 mL 加入到三角瓶配制成0.25、0.5、1.0、2和4 mg/L的含吡唑醚菌酯培養(yǎng)基，搖勻后倒入直徑75 mm培養(yǎng)皿，以不含吡唑醚菌酯的等量丙酮PDA平板為溶劑對照，以等量清水PDA平板為空白對照。待培養(yǎng)基完全凝固后，用直徑5 mm的打孔器在純化培養(yǎng)的菌落邊緣打取菌餅，單個菌碟菌絲面朝下貼于含藥PDA平板中央，25 ℃光照培養(yǎng)6 d，第7 天采用十字交叉法垂直測量記錄各質(zhì)量濃度下的菌落直徑，計算出平均值。每質(zhì)量濃度重復(fù)測定4次。

1.2.2 病菌抗性分析 依據(jù)不同質(zhì)量濃度下菌落直徑，計算各處理濃度對菌絲的生長抑制率。計算公式：D=D1-D2，D為菌落增長直徑，D1為菌落直徑，D2為菌餅直徑；I=(D0-Dt0-Dt)/D0×100，I為處理菌絲生長抑制率，D0為空白對照菌落增長直徑，Dt0為溶劑對照菌落增長直徑，Dt為藥劑處理菌落增長直徑。采用DPS 3.01軟件的數(shù)量型數(shù)據(jù)機值分析法對各質(zhì)量濃度對數(shù)值和菌絲生長抑制率進(jìn)行回歸分析，計算回歸方程、相關(guān)系數(shù)、EC50及95%置信區(qū)間，獲得57株菌株的EC50。采用SPSS Statistic 19.0軟件對EC50進(jìn)行分布頻率直方圖正態(tài)性檢驗分析，依據(jù)偏度與其標(biāo)準(zhǔn)誤和峰度與其標(biāo)準(zhǔn)誤計算偏度系數(shù)(Sk=|g1/σg1|)和峰度系數(shù)(Ku=|g2/σg2|)進(jìn)行T檢驗，2種檢驗的Sk和Ku0.05)時即可認(rèn)為該組資料服從正態(tài)分布，將符合連續(xù)性正態(tài)分布時參試菌株的EC50平均值作為甘肅玉米大斑病對吡唑醚菌酯的敏感基線?？剐运?供試菌株EC50/敏感基線EC50，當(dāng)菌株抗性水平達(dá)到5倍，則表明有抗性產(chǎn)生，抗性水平大于5倍的菌株在整個群體中所占的比例即為抗性頻率?？剐苑旨墸?倍以下為敏感；5～10倍為低抗；10～40倍為中抗；40倍以上為高抗[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘肅玉米大斑病菌對吡唑醚菌酯的敏感基線

甘肅玉米大斑病菌對吡唑醚菌酯的敏感性差異較小，EC50為0.10～1.56 mg/L，57株病菌的EC50平均值為0.66 mg/L，其中，最敏感菌株為天水清水紅堡Tsqshb-1-2，最不敏感菌株為酒泉肅州清水鎮(zhèn)Jqszqs-1(表1)。正態(tài)性檢驗表明，57株病菌的EC50呈現(xiàn)偏正態(tài)非連續(xù)性分布(圖1)，曲線平緩[g1=0.82>0，σg1=0.32，Sk=2.58>T0.05=1.96(P<0.05)；g2=1.27>0，σg2=0.62，Ku=2.04>T0.05=1.96(P<0.05)]，表明甘肅玉米大斑病菌對吡唑醚菌酯的敏感性存在一定分化；49株菌株的EC50呈現(xiàn)連續(xù)性正態(tài)分布(圖2)，曲線平緩[g1=0.17>0，σg1=0.34，Sk=0.500.05)；g2=-0.69<0，σg2=0.67，Ku=1.030.05)]，其 EC50平均值0.61 mg/L即為甘肅玉米大斑病菌對吡唑醚菌酯的敏感基線。

2.2 甘肅玉米大斑病菌對吡唑醚菌酯的抗性水平

甘肅玉米大斑病菌對吡唑醚菌酯的EC50平均值、平均抗性和最高抗性的高低順序依次為河西干旱灌溉生態(tài)區(qū)>南部濕潤生態(tài)區(qū)>隴東半濕潤半干旱生態(tài)區(qū)>中部干旱雨養(yǎng)生態(tài)區(qū)；57株病菌的平均抗性為1.08，最高抗性為2.55，全部屬于敏感性菌株，暫未出現(xiàn)抗藥性，其中，中部干旱雨養(yǎng)生態(tài)區(qū)玉米大斑病菌對吡唑醚菌酯十分敏感，EC50為0.32～0.68 mg/L， EC50平均值為0.51 mg/L，平均抗性為0.84，最高抗性為1.11，而河西干旱灌溉生態(tài)區(qū)菌株對吡唑醚菌酯的敏感性相對較低，EC50為0.34～1.56 mg/L，EC50平均值為0.75 mg/L，平均抗性為1.23，最高抗性為2.55(表2)。

表1 甘肅玉米大斑病菌對吡唑醚菌酯的敏感性

圖1 57株病菌EC50非連續(xù)性正態(tài)分布

圖2 49株菌株EC50連續(xù)性正態(tài)分布

表2 甘肅玉米大斑病菌對吡唑醚菌酯的抗性水平

3 結(jié)論與討論

玉米大斑病是影響中后期產(chǎn)量形成的一種嚴(yán)重葉枯病害，主要危害葉片、葉鞘和苞葉，喇叭口前期噴霧施藥防治技術(shù)是該病害化學(xué)防控的有效手段，而殺菌劑對病菌敏感性的監(jiān)測是病害控制的前期基礎(chǔ)工作，通常不同來源病原菌對同一種類殺菌劑的敏感性存在地理尺度差異性[14]，這與本研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，甘肅57株玉米大斑病菌對吡唑醚菌酯的敏感性差異均較小， EC50為0.10～1.56 mg/L，其中，中部干旱雨養(yǎng)生態(tài)區(qū)5株病菌對吡唑醚菌酯十分敏感，平均抗性水平和最高抗性水平分別為0.84和1.11，而河西干旱灌溉生態(tài)區(qū)15株病菌對吡唑醚菌酯敏感性均較低，平均抗性水平和最高抗性水平分別為1.23和2.55，說明，甘肅玉米大斑病菌對Strobilurins類殺菌劑吡唑醚菌酯的敏感性具有顯著地理尺度差異性。

有研究顯示，EC50呈連續(xù)性正態(tài)分布時的EC50平均值可作為衡量殺菌劑對病害是否敏感的敏感基線[15]，因此，本研究將49株菌株的EC50呈連續(xù)性正態(tài)分布時的EC50平均值0.61 mg/L作為甘肅玉米大斑病菌對吡唑醚菌酯的敏感基線?；诖税l(fā)現(xiàn)，甘肅57株玉米大斑病菌對吡唑醚菌酯的平均抗性水平和最高抗性水平分別為1.08和2.55，全部屬于敏感性菌株，無抗藥性產(chǎn)生，這與本研究確定的敏感基線有關(guān)。本研究選擇病原群體呈連續(xù)性正態(tài)分布時的EC50平均值為敏感基線，未將甘肅玉米大斑病菌對吡唑醚菌酯EC50最小值 0.10 mg/L視為敏感基線，基線水平較高，因此所有菌株表現(xiàn)為敏感菌株，這對甘肅玉米大斑病菌抗藥性水平分布有一定的影響，但不影響它們對吡唑醚菌酯的敏感水平。因此，究竟是以病原群體對殺菌劑EC50的最小值為敏感基線還是以病原群體連續(xù)性正態(tài)分布時的EC50平均值為敏感基線還值得商榷，有待進(jìn)一步分析研究。

病原對殺菌劑的敏感性降低是菌株抗藥的外在表現(xiàn)形式，內(nèi)在原因則是真菌對有毒化學(xué)物解毒代謝能力的增強。Strobilurins類殺菌劑可作用于真菌呼吸系統(tǒng)復(fù)合體Ⅲ細(xì)胞色素bcⅠ的Qo部位，通過阻止細(xì)胞色素b至c1的電子傳遞抑制真菌能量循環(huán)，而氨基酸殘基位點突變則是其抗藥的主要分子機制[16]。有研究顯示，接觸Strobilurins類殺菌劑后，植株的Cyt b基因129位點的苯丙氨酸可突變?yōu)榱涟彼醄17]、137位點的甘氨酸可突變?yōu)榫彼醄18]和143位點的甘氨酸可突變?yōu)楸彼醄19]。本研究僅在菌絲生物量水平對甘肅玉米大斑病菌對吡唑醚菌酯的敏感性進(jìn)行監(jiān)測分析，取得的階段性研究成果需在分子水平進(jìn)一步驗證。

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(責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsible editor:GUO Baishou)

Monitoring and Analyzing Sensitivity ofSetosphaeriaturcicato Pyraclostrobin in Gansu

YANG Fengzhen1,2,GUO Jianguo2,DU Hui2,WANG Chunming2,GUO Cheng2,JIN Shelin2and WANG Shengrong1

(1.College of Grassland Science,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China; 2. Institute of plant protection,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730070,China)

The sensitivity of 57 isolates ofSetosphaeriaturcicato pyraclostrobin on four typical ecological regions in Gansu was tested by Petri plate in order to determine their sensitive baseline and resistance factor.The results showed that the sensitivity ofS.turcicato pyraclostrobin in Gansu is little different,EC50range is 0.10-1.56 mg/L,mean EC50is 0.66 mg/L.The sensitive baseline ofS.turcicato azoxystrobin in Gansu is 0.61 mg/L only when normality test of EC50on 49 isolates ofS.turcicais continuously normal distribution.On the base of sensitive baseline,we find that the highest and mean resistance factor for 57 isolates to pyraclostrobin is respectively 2.55 and 1.08 in Gansu,and there is no resistance.5 isolates from rainfed dryland in Central is sensitive to pyraclostrobin,the highest and mean resistance factor for resistance to pyraclostrobin is respectively 1.11 and 0.84,as well as 15 isolates from irrigated dryland in Hexi is lowly sensitive to pyraclostrobin,the highest and mean resistance factor for resistance to pyraclostrobin is respectively 2.55 and 1.23,we need to be wary of the resistance.

Setosphaeriaturcica; Pyraclostrobin; Sensitivity

YANG Fengzhen,female,master student.Research area:phytopathology.E-mail:1078056640@qq.com

GUO Jianguo,male,master,associate research fellow.Research area:plant protection.E-mail:jguo1001@163.com

2015-11-04

2015-12-28 基金項目：國家十二五科技支撐計劃(2012BAD19B04-11)；甘肅省自然科學(xué)基金(145RJZA164)；甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新專項(2012GAAS07-3)。

楊鳳珍，女，碩士研究生，從事植物病理學(xué)方面研究。E-mail：1078056640@qq.com

郭建國，男，碩士，副研究員，從事植物保護(hù)學(xué)研究。E-mail：jguo1001@163.com 王生榮，男，博士，教授，從事植物病理學(xué)方面研究。E-mail：wangsr@gsau.edu.cn

日期：2016-10-20

S432.4

A

1004-1389(2016)10-1548-06

WANG Shengrong,male,Ph.D,professor.Research area:plant protection.E-mail:wangsr@gsau.edu.cn

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161020.1655.037.html

Received 2015-11-04 Returned 2015-12-28

Foundation item Key Projects in the National Science & Technology Pillar Program during the Twelfth Five-year Plan Period (No.2012BAD19B04-11); The Natural Science Foundation of Gansu Province (No.145RJZA164 ); Technological Innovation Foundation of Gansu Academy of Agricultural Sciences(No.2012GAAS07-3).