胡珺，杜新凱，王常高，林建國(guó)，杜馨，蔡俊*

（湖北工業(yè)大學(xué)，發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430068）

產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

胡珺，杜新凱，王常高，林建國(guó)，杜馨，蔡俊*

（湖北工業(yè)大學(xué)，發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430068）

以橄欖油為唯一碳源，采用油脂同化平板從食堂廢棄物中篩選出一株產(chǎn)脂肪酶菌株HFE722。通過測(cè)定與分析該菌株16SrRNA基因序列，鑒定該菌株為芽孢桿菌（Bacillussp.）。菌株HFE722在初始條件（發(fā)酵溫度30℃，接種量為1%，自然pH，裝液量為100mL/250mL，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min）下培養(yǎng)36 h，測(cè)得發(fā)酵液上清液脂肪酶酶活為2.17 U/mL。優(yōu)化后所得菌株HFE722產(chǎn)酶的最適發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵周期為36 h，接種量為1%（V/V），初始pH7.0，裝液量為50 mL/250 mL，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min。在最佳發(fā)酵條件下，發(fā)酵液上清液酶活可達(dá)到5.8 U/mL，酶活較優(yōu)化前提高了167.28%。

脂肪酶；篩選；鑒定；發(fā)酵條件優(yōu)化

脂肪酶是一類特殊酯鍵水解酶，是目前緊俏的生物催化劑之一，一般用于催化油脂的水解和合成反應(yīng)。脂肪酶的催化活性主要在于它的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，在油水界面上，它催化三酰甘油的酯鍵的水解，水解生成甘油一酯、二酯或者直接生成甘油和脂肪酸[1]。

微生物來源（包括細(xì)菌、霉菌和酵母）的脂肪酶含量最為豐富[2]。由于微生物種類多、繁殖快，易發(fā)生遺傳變異，產(chǎn)生的脂肪酶具有比動(dòng)植物脂肪酶作用更廣的pH值、反應(yīng)溫度范圍以及底物專一性[3]；而且微生物來源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)和樣品提純，因此，微生物脂肪酶是工業(yè)用脂肪酶的重要來源，是生物技術(shù)和有機(jī)化學(xué)應(yīng)用中使用最為廣泛的酶類之一[4-5]。

目前，已知的大約有2%的微生物產(chǎn)脂肪酶。自然界中的微生物大約有65個(gè)屬可產(chǎn)脂肪酶，其中放線菌4個(gè)屬，細(xì)菌28個(gè)屬，酵母10個(gè)屬，其他真菌23個(gè)屬，但事實(shí)上，脂肪酶在微生物群落的分布已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了這個(gè)數(shù)字[6]，且不同微生物來源的脂肪酶其組成成分、理化特性各不相同。產(chǎn)微生物脂肪酶菌種的研究主要集中在根酶[7]、黑曲霉[8]、白地霉[9]、青霉[10]、木霉[11]、毛霉、洋蔥伯克霍爾德菌[12]、枯草芽抱桿菌[13]、大腸桿菌工程菌[14]、無色桿菌、酵母[15]、小球菌、發(fā)光桿菌[16]、非極端細(xì)菌[17]、假絲酵母[18]和假單胞菌[19]等具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的菌株和應(yīng)用在臨床醫(yī)學(xué)上的金黃色葡萄球菌、鉤狀螺旋體、粉刺棒狀桿菌。

本研究從食堂廢棄物中篩選到一株產(chǎn)脂肪酶的菌株，對(duì)其進(jìn)行鑒定，并對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到最適產(chǎn)酶條件。開展這方面的研究工作，對(duì)于開發(fā)新酶種和脂肪酶擴(kuò)大應(yīng)用領(lǐng)域，具有十分現(xiàn)實(shí)的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

橄欖油乳化液：稱取聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）40.0 g，加水800 mL，在沸水浴中加熱，攪拌，直至全部溶解，冷卻后定容至1 000 mL。用干凈的雙層紗布過濾，取濾液備用。量取上述濾液150 mL，加橄欖油50 mL，用高速勻漿機(jī)處理6 min（分兩次處理，間隔5 min，每次處理3 min），即得乳白色橄欖油乳化液。該溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，F(xiàn)eSO40.01g，（NH4）2SO42g，橄欖油乳化液120mL，水1000mL；

油脂同化平板[20]：K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，（NH4）2SO42 g，橄欖油乳化液120 mL，瓊脂20 g，溴甲酚紫4 mL，水1 000 mL；

三丁酸甘油酯平板[21]：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，三丁酸甘油酯2 mL，瓊脂粉20 g，水1 000 mL；

LB斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉10 g、瓊脂粉20 g，水1000 mL；

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，（NH4）2SO45 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨25g，橄欖油10mL，水1000mL；

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5 g，（NH4）2SO41 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨20g，橄欖油10mL，水1000mL。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-25pH計(jì)：上海雷磁；3K15冷凍離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；AR1140型電子分析天平：奧豪斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；A型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZSD-1270全自動(dòng)生化培養(yǎng)箱、ZHWY系列雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種初篩

取5 g樣品于100 mL生理鹽水中，充分混勻后取1 mL接種于100 mL富集培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min培養(yǎng)4 d。取富集后的菌懸液0.5 mL做適當(dāng)?shù)奶荻认♂專坎加谟椭桨迳希?0℃培養(yǎng)3 d。挑取能使平板變黃的菌落點(diǎn)樣于三丁酸甘油酯平板上，30℃培養(yǎng)2 d。以菌落直徑與水解圈直徑的比值作為初篩依據(jù)，將比值較大的菌落保存于LB斜面，以便復(fù)篩測(cè)酶活。

1.3.2 復(fù)篩

將上述所得到的菌落接種于種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，然后將液體種子1 mL接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min培養(yǎng)36 h。取發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min，吸取上清液作為粗酶液，采用GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》中所述的酸堿滴定法測(cè)其脂肪酶酶活，篩選出脂肪酶酶活較高的菌株。脂肪酶酶活定義為：1 mL液體酶，在一定溫度和pH條件下，1 min水解底物產(chǎn)生1 μmol可滴定的脂肪酸，即為1個(gè)酶活力單位，以U/mL表示。

1.3.3 菌種的鑒定與保藏

菌株鑒定和保藏由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（China Center for Type Culture Collection，CCTCC）執(zhí)行。鑒定內(nèi)容包括菌株16S rRNA基因序列的測(cè)定與分析（如圖1所示）和微生物菌株的分類地位。菌株HFE722已于2015年12月10日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為：CCTCC M 2015735。

圖1 HFE722菌株16S rRNA基因序列Fig.1 Gene sequence of 16S rRNA of strain HFE722

1.3.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

（1）發(fā)酵周期的優(yōu)選試驗(yàn)

在發(fā)酵溫度30℃、接種量1.0%、自然pH、裝液量100 mL/250mL和搖瓶轉(zhuǎn)速200 r/min條件下，每隔6 h測(cè)一次酶活，考察發(fā)酵周期對(duì)HFE722產(chǎn)脂肪酶的影響。

（2）發(fā)酵溫度的優(yōu)選試驗(yàn)

在發(fā)酵周期36 h、接種量1.0%、自然pH、裝液量100 mL/250 mL和搖瓶轉(zhuǎn)速200 r/min條件下，分別在26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃和38℃發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)定酶活，考察發(fā)酵溫度對(duì)菌株產(chǎn)脂肪酶的影響。

（3）接種量的優(yōu)選試驗(yàn)

在發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵周期36 h、自然pH、裝液量100 mL/250 mL和搖瓶轉(zhuǎn)速200 r/min條件下，調(diào)整接種量（V/V）分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%，考察接種量對(duì)菌株產(chǎn)脂肪酶的影響。

（4）初始pH值的優(yōu)選試驗(yàn)

在發(fā)酵溫度30℃、接種量1.0%、發(fā)酵周期36 h、裝液量100 mL/250 mL和搖瓶轉(zhuǎn)速200 r/min條件下，調(diào)整初始pH值分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，考察初始pH值對(duì)菌株產(chǎn)脂肪酶的影響。

（5）裝液量的優(yōu)選試驗(yàn)

在發(fā)酵溫度30℃、接種量1.0%、pH 7.0、發(fā)酵周期36 h和搖瓶轉(zhuǎn)速200 r/min條件下，采用250 mL搖瓶裝液，搖瓶裝液量分別為25 mL、50 mL、75 mL、100 mL和125 mL，考察裝液量對(duì)菌株產(chǎn)脂肪酶的影響。

（6）搖瓶轉(zhuǎn)速的優(yōu)選試驗(yàn)

在發(fā)酵溫度30℃、接種量1.0%、pH 7.0、裝液量50 mL/250 mL和發(fā)酵周期36 h條件下，搖瓶轉(zhuǎn)速分別為120r/min、140r/min、160 r/min、180 r/min和200 r/min，考察搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)脂肪酶的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

利用油脂同化平板初篩出能產(chǎn)脂肪酶的61株菌株，然后點(diǎn)樣于三丁酸甘油酯平板（如圖2所示），將菌落直徑與水解圈直徑之比大的挑出來檢測(cè)酶活，結(jié)果如表1所示，菌株HFE722酶活最高為2.17 U/mL，將菌株HFE722稀釋涂布，分離純化確保其為單菌落后，保存于LB斜面。

圖2 產(chǎn)脂肪酶菌株在三丁酸甘油酯平板上形成的水解圈Fig.2 Hydrolyzation circle performed by the lipase-producing strains on tributyrin plate

表1 不同菌株的脂肪酶酶活Table 1 Lipase activity of different strains

2.2 菌種鑒定

對(duì)菌株HFE722的16S rRNA基因序列進(jìn)行測(cè)定后經(jīng)Blast比對(duì)部分結(jié)果如表2所示，菌株HFE722的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。結(jié)果表明，菌株HFE722的基因序列與Bacillus siamensis、Bacillus vanillea、Bacillus methylotrophicus相似度較高，但還不能準(zhǔn)確鑒定到種，由此鑒定菌株HFE722為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

表2 HFE722菌株16S rRNA基因序列部分BLAST結(jié)果Table 2 Part BLAST consequence of 16S rRNA gene sequence of strain HFE722

圖3 菌株HFE722的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain HFE722

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 發(fā)酵周期的優(yōu)選試驗(yàn)

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)脂肪酶酶活的影響Fig.4 Effect of fermentation time on lipase activity

發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響（圖4）可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，脂肪酶酶活逐漸升高，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為36 h時(shí)，脂肪酶酶活最高為4.7 U/mL。隨著時(shí)間的繼續(xù)增加，酶活呈下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)楹笃跔I(yíng)養(yǎng)不足，菌體自溶導(dǎo)致的。故最佳發(fā)酵時(shí)間為36 h。

2.3.2 發(fā)酵溫度的優(yōu)選試驗(yàn)

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)脂肪酶酶活的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on lipase activity

由圖5可知，從26℃開始，隨著溫度的升高酶活逐漸升高，可能是因?yàn)闇囟壬?，菌株生長(zhǎng)和代謝加快，有利于酶的產(chǎn)生。當(dāng)溫度為30℃時(shí)，酶活最高為5.2 U/mL。而30℃過后，隨著溫度升高酶活逐漸降低，可能是因?yàn)檫^高的溫度不利于菌體的生長(zhǎng)，菌株為了能更好的在高溫條件下生存，改變了代謝途徑，從而脂肪酶酶活也受到影響。故最佳發(fā)酵溫度為30℃。

2.3.3 接種量的優(yōu)選試驗(yàn)

圖6 接種量對(duì)脂肪酶酶活的影響Fig.6 Effect of inoculum on lipase activity

由圖6可知，接種量為0.5%時(shí)酶活較低，當(dāng)接種量為1.0%（V/V）時(shí)，酶活最高為4.3 U/mL。隨著接種量升高，酶活反而下降，可能是因?yàn)檩^大的接種量使得微生物生長(zhǎng)過快，從而培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)消耗過快，溶氧下降，不利于后期產(chǎn)酶。故最佳接種量為1.0%。

2.3.4 初始pH值的優(yōu)選試驗(yàn)

由圖7可知，當(dāng)初始pH在4.5～7.0時(shí)，隨著初始pH升高酶活逐漸增加。當(dāng)初始pH為7.0時(shí)，酶活最高為4.8 U/mL。隨著初始pH的繼續(xù)升高，酶活顯著下降，說明菌株HFE722在中性條件下更易產(chǎn)脂肪酶，過酸或過堿的環(huán)境都對(duì)菌株代謝有一定的影響，從而影響了脂肪酶的產(chǎn)量。故最佳初始pH值為7.0。

圖7 初始pH對(duì)脂肪酶酶活的影響Fig.7 Effect of initial pH on lipase activity

2.3.5 裝液量的優(yōu)選試驗(yàn)

圖8 裝液量對(duì)脂肪酶酶活的影響Fig.8 Effect of loading volume on lipase activity

由圖8可知，當(dāng)裝液量為50 mL/250 mL時(shí)，酶活最高為5.8 U/mL，此時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧量適合菌體生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)酶。隨著裝液量的逐漸增加，酶活呈下降趨勢(shì)，說明是由于發(fā)酵體系溶氧不足，菌體生長(zhǎng)與代謝產(chǎn)酶失去平衡，從而代謝產(chǎn)酶過程受到抑制。故最佳裝液量為50 mL/250 mL。

2.3.6 搖瓶轉(zhuǎn)速的優(yōu)選試驗(yàn)

圖9 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)脂肪酶酶活的影響Fig.9 Effect of rotating speed on lipase activity

由圖9可知，搖床轉(zhuǎn)速在120～160 r/min時(shí)，隨著搖床轉(zhuǎn)速的升高酶活逐漸增加，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min時(shí)，酶活最高為5.2 U/mL。隨著搖床轉(zhuǎn)速的繼續(xù)增加，酶活變化很小，從節(jié)約成本和簡(jiǎn)化工藝條件著手，選擇160 r/min作為最佳的搖床轉(zhuǎn)速。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

在上述優(yōu)化下得到的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵周期36 h，發(fā)酵溫度30℃，接種量1%（V/V），初始pH值7.0，裝液量50 mL/250 mL，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min。按此最佳發(fā)酵工藝條件發(fā)酵驗(yàn)證3批，每批次3次重復(fù)，測(cè)得菌株HFE722的脂肪酶活力平均值為5.8 U/mL。驗(yàn)證結(jié)果與優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果一致，說明工藝穩(wěn)定可行。

3 結(jié)論

本文以橄欖油為唯一碳源篩選到一株產(chǎn)脂肪酶酶活較高的菌株HFE722，酶活為2.17U/mL。通過對(duì)菌株HFE722進(jìn)行菌落形態(tài)特征、顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察和16S rRNA基因序列的測(cè)定與分析，確定該菌株HFE722為芽孢桿菌（Bacillus sp.）。通過發(fā)酵條件優(yōu)化，確定了該菌株的最佳產(chǎn)酶條件：發(fā)酵周期36 h，發(fā)酵溫度30℃，接種量1%（V/V），初始pH值7.0，裝液量50 mL/250 mL，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min。優(yōu)化后酶活為5.8 U/mL，較優(yōu)化前提高了167.28%。

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Screening and identification of lipase-producing strains and optimization of fermentation conditions

HU Jun,DU Xinkai,WANG Changgao,LIN Jianguo,DU Xin,CAI Jun*
(Key Laboratory of Fermentation Engineering(Ministry of Education),Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

Using olive oil as unique carbon source,a lipase-producing strain HFE722 was isolated from the waste of canteen by screening plates. Through 16S rRNA gene sequence determination and analysis,results showed that strain HFE722 was identified as aBacillussp.Strain HFE722 was incubated for 36 h in the initial fermentation condition(fermentation temperature 30℃,inoculum 1%,natural pH,loading volume 100 ml/250 ml, shaking speed 200 r/min),the lipase activity of the fermentation broth was 2.17 U/ml.Single-factor method was used for optimizing the fermentation conditions,and then the optimum lipase production conditions were determined as follows:fermentation temperature 30℃,time 36 h,inoculum 1% (v/v),initial medium pH 7.0,loading volume 50 ml/250 ml,and shaking speed 160 r/min.Under these fermentation conditions,the lipase activity of fermentation broth of strain HFE722 reached 5.8 U/ml,which was 167.28%higher than that of before optimization.

lipase;screening;identification;fermentation conditions optimization

Q815

0254-5071（2016）11-0039-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.008

2016-08-13

國(guó)家自然科學(xué)基金（31401807）

胡珺（1988-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵過程優(yōu)化與放大。

*通訊作者：蔡?。?968-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵工程。