邵建寧，彭章普，張文齊，麻和平，劉彩云，王潔，趙昊星

（甘肅省科學(xué)院生物研究所，甘肅蘭州730000）

尾菜青貯乳酸菌的分離鑒定及其培養(yǎng)條件研究

邵建寧，彭章普，張文齊，麻和平，劉彩云，王潔，趙昊星

（甘肅省科學(xué)院生物研究所，甘肅蘭州730000）

從泡菜中分離鑒定適合尾菜（廢棄白菜葉、青筍葉）青貯的乳酸菌，獲得產(chǎn)酸能力強(qiáng)、青貯效果好的2株菌株SD2和SD4，并對其培養(yǎng)條件進(jìn)行研究。結(jié)果表明，菌株SD2、SD4最適培養(yǎng)溫度分別為35℃、37℃；最適培養(yǎng)時(shí)間分別為20 h、16 h；最適初始pH值均為6.5；最適接種量均為6%。菌株SD2和SD4分別在30℃條件下進(jìn)行尾菜發(fā)酵7 d后，pH值均＜4.0，乳酸菌活菌數(shù)＞1×108CFU/g。對菌株SD2和SD4進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生化檢測及16S rRNA序列分析，鑒定菌株SD2為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），菌株SD4為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）。

尾菜；青貯；乳酸菌；分離鑒定；培養(yǎng)條件

隨著我國蔬菜種植面積不斷擴(kuò)大和蔬菜種植布局不斷集中，在蔬菜產(chǎn)區(qū)蔬菜采收與初加工過程中常伴有大量的尾菜產(chǎn)生，造成了環(huán)境污染[1-2]。為解決尾菜污染環(huán)境，實(shí)現(xiàn)尾菜資源化利用，對無腐爛變質(zhì)的尾菜進(jìn)行青貯飼料制備，可以降低尾菜的營養(yǎng)物質(zhì)損失，較長期保存尾菜的青鮮狀態(tài)，提高尾菜青貯飼料的適口性、消化率和營養(yǎng)價(jià)值[3-6]。青貯飼料是在厭氧條件下利用乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，使青貯料pH值迅速下降，抑制其他耗氧微生物對青綠飼料營養(yǎng)成分的分解作用，并改善青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)，從而達(dá)到長期保存飼料營養(yǎng)物質(zhì)的目的[7-9]。青貯過程中乳酸菌必須具備較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力且達(dá)到一定數(shù)量，才能更好地發(fā)揮其生物功效。因此，篩選出產(chǎn)酸能力強(qiáng)、青貯發(fā)酵效果好的乳酸菌菌株，是制備優(yōu)良青貯劑的核心，也是青貯成功的關(guān)鍵。目前，專門針對用于尾菜青貯的乳酸菌研究很少，自然青貯又不能保證尾菜青貯的品質(zhì)，因此，分離鑒定可應(yīng)用于尾菜青貯的優(yōu)良乳酸菌非常重要。本實(shí)驗(yàn)從市售泡菜中分離乳酸菌，進(jìn)行產(chǎn)酸性能、青貯發(fā)酵效果研究，篩選適合尾菜青貯的乳酸菌，對篩選到2株菌株的最適培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，并通過形態(tài)學(xué)、生化檢測及16S rRNA序列分析，對2株菌進(jìn)行了鑒定。以期為尾菜青貯劑的研究開發(fā)與利用提供了參考和菌種保證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種來源

實(shí)驗(yàn)菌株是本研究室從蘭州市售泡菜中分離篩選出的菌株，由本研究室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基[10]：酪蛋白胨10 g/L，牛肉粉10 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖5 g/L，乙酸鈉5 g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，吐溫80 1 mL/L，K2HPO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.02 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，瓊脂粉15 g/L，蒸餾水1 L，pH 6.8。

MC培養(yǎng)基[11]：大豆蛋白胨5 g/L，牛肉粉5 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，乳糖20 g/L，CaCO310 g/L，瓊脂粉15 g/L，中性紅0.05 g/L，蒸餾水1 L，pH 6.0。

1.1.3 青貯原料

挑選無腐爛變質(zhì)的廢棄白菜葉、青筍葉進(jìn)行清洗，切割成長2 cm、寬3 cm，晾曬，使廢棄白菜葉、青筍葉水分含量降至70%左右備用。

1.1.4 化學(xué)試劑

蛋白胨、酵母浸出粉、牛肉粉、大豆蛋白胨、瓊脂粉：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖、乳糖：天津市百世化工有限公司；吐溫-80：上海大眾制藥廠；K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCO3：北京化工廠。所用化學(xué)試劑為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；DELTA320pH計(jì)：梅特勒-托利多（METTLERTOLEDO）集團(tuán)；UV-120-02型分光光度計(jì)：日本島津公司；JA2003N電子天平：上海精密儀器有限公司；DG-1多功能培養(yǎng)箱：上海醫(yī)療器械修造廠；SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；BH-2顯微鏡：日本奧林巴斯（OLYMPUS）公司。1.3方法

1.3.1 分離篩選

（1）乳酸菌分離與純化

從采購的市售泡菜中取5 mL泡菜汁和45 mL無菌生理鹽水，混勻，以10倍梯度稀釋，選取10-3、10-4、10-5三個(gè)稀釋度，各稀釋度取0.2 mL，分別均勻涂布于MC培養(yǎng)基平板上，30℃平板倒置培養(yǎng)48 h，選擇菌落顯紅色，周圍有明顯溶鈣環(huán)的單菌落進(jìn)行保存。對分離的菌株在含有CaCO3的MRS培養(yǎng)基平板上劃線分離純化2～3次，挑取溶鈣圈明顯的單菌落，經(jīng)鏡檢確認(rèn)為純種后，用MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，采用甘油法進(jìn)行保藏[12]。

（2）乳酸菌初篩及復(fù)篩

初篩：將上述分離純化的菌株活化后，按5%（V/V）接種量（菌種活菌數(shù)約為1×108CFU/mL）接入MRS液體培養(yǎng)基，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，每隔2 h無菌取樣測定各菌株發(fā)酵液的pH值，根據(jù)發(fā)酵時(shí)間和pH值繪制產(chǎn)酸速率曲線。選擇能在MRS液體培養(yǎng)基，16～20 h內(nèi)發(fā)酵液pH值下降到4.0以下的菌株作為初篩菌株。

復(fù)篩Ⅰ：將初篩得到的菌株在30℃靜置培養(yǎng)24 h，進(jìn)行產(chǎn)酸量測定，采用酸堿滴定法中和法，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定，計(jì)算產(chǎn)酸量，產(chǎn)酸量以吉爾涅爾度（°T）表示。

復(fù)篩Ⅱ：將復(fù)篩Ⅰ選出菌株培養(yǎng)液按質(zhì)量比0.5%的接種量（菌種活菌數(shù)約為1×109CFU/mL），接種在預(yù)處理后的廢棄白菜葉、青筍葉中。分別均勻噴灑到500 g青筍葉及500 g白菜葉中，裝袋后壓實(shí)、袋口密封，在30℃條件下發(fā)酵，測定尾菜青貯飼料pH值及活菌數(shù)，綜合尾菜青貯飼料感官指標(biāo)評價(jià)復(fù)篩菌株發(fā)酵性能[13]。

1.3.2 活菌數(shù)測定

（1）發(fā)酵菌液活菌數(shù)測定

取1 mL待測定發(fā)酵菌液，用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取10-6、10-7稀釋梯度，吸取0.2 mL菌懸液置于MRS瓊脂平板上，每個(gè)稀釋梯度做3個(gè)平行，以滅菌的涂布器將菌懸液均勻涂開，然后將平板倒置于培養(yǎng)箱中，37℃條件下培養(yǎng)48 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[14]。

（2）尾菜飼料乳酸菌總數(shù)測定

取5 g尾菜青貯飼料和45 mL無菌生理鹽水混勻，以10倍梯度稀釋，選取10-5、10-6稀釋梯度，吸取0.2 mL菌懸液用涂布棒涂布于MC瓊脂平板上，培養(yǎng)48 h后，選擇菌落顯紅色，周圍有明顯溶鈣環(huán)的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.3 pH值測定

發(fā)酵液pH測定：無菌取樣5 mL，用pH計(jì)測定發(fā)酵液的pH值。

青貯尾菜pH測定：稱取尾菜青貯樣品20g，加入180 mL蒸餾水，使用組織搗碎機(jī)搗碎，然后用四層紗布和濾紙分別進(jìn)行過濾，用pH計(jì)測定尾菜青貯樣品過濾液的pH值。

1.3.4 培養(yǎng)條件研究

將培養(yǎng)溫度分別設(shè)定為30℃、33℃、35℃、37℃、40℃、42℃，初始pH值分別調(diào)至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，接種量分別按照1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%（V/V），用MRS液體培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)24 h，每隔2 h在波長600 nm條件下測定培養(yǎng)液的OD600nm值，考察培養(yǎng)溫度、初始pH值、接種量及培養(yǎng)時(shí)間等因素對菌株生長的影響。每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件做3個(gè)平行樣取平均值。

1.3.5 菌種鑒定

（1）形態(tài)特征觀察：將篩選獲得的菌株分別涂布到MRS固體培養(yǎng)基，37℃條件下培養(yǎng)2 d左右，觀察菌落特征，取典型菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)[15]。

（2）生理生化特性測定：對待鑒定菌株進(jìn)行過氧化氫酶、吲哚、明膠試驗(yàn)及葡萄糖、木糖、水楊苷、七葉苷、麥芽糖、甘露醇、蔗糖碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)[16]。

（3）16S rRNA基因序列分析：提取待鑒定菌株16S rRNA，引物為原核生物16S rRNA的通用引物，27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-CTACGGCTACC TTGTTACGA-3'。16S rRNA PCR產(chǎn)物全序列由上海派森諾生物科技有限公司測定，將測得的16SrRNA序列與NCBI GenBank中的已知序列進(jìn)行同源性比較后，判定菌株種類，從而確定鑒定菌株的屬種信息[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離篩選

2.1.1 分離純化

本實(shí)驗(yàn)從采購的市售泡菜中進(jìn)行乳酸菌分離純化，從MC培養(yǎng)基選擇菌落顯紅色，周圍有明顯溶鈣環(huán)的單菌落進(jìn)行保存，對分離菌株在含有CaCO3的MRS平板培養(yǎng)基上反復(fù)劃線純化，挑選出溶鈣環(huán)明顯的單菌落，經(jīng)鏡檢確認(rèn)為純種，最終分離獲得20株產(chǎn)酸菌株。

2.1.2 初篩

青貯要求在較短時(shí)間內(nèi)青貯基質(zhì)pH值迅速下降到4.0以下，這樣才能有效抑制真菌及其他雜菌的生長。對分離純化獲得的20株菌株進(jìn)行產(chǎn)酸速率試驗(yàn)，選擇能在MRS培養(yǎng)液中16～20 h內(nèi)發(fā)酵液pH值下降到4.0以下的菌株作為初篩菌株，經(jīng)初篩后選出7株產(chǎn)酸量大、產(chǎn)酸快的菌株見圖1。由圖1可以看出，菌株SD2、SD4、SD5、SD13、SD14、SD16、SD17在20 h時(shí)培養(yǎng)液pH值均降到4.0以下，7株菌株的pH值變化趨勢基本一致，在培養(yǎng)初期pH值的變化都不明顯。8 h以后pH值下降較快，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，pH值逐漸下降。

圖1 初篩菌株在不同培養(yǎng)時(shí)間下pH變化Fig.1 pH changes of primarily screening strains at different culture time

2.1.3 復(fù)篩Ⅰ

圖2 初篩菌株產(chǎn)酸能力測定結(jié)果Fig.2 Determination results of acid-producing ability of primarily screening strains

將初篩到的7株菌株在MRS液體培養(yǎng)基中30℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，進(jìn)行產(chǎn)酸量測定，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，菌株SD2、SD4、SD14、SD16、SD17酸度均≥70°T，其中菌株SD2、SD4產(chǎn)酸量較高，酸度達(dá)到了75°T以上，復(fù)篩出5株產(chǎn)酸性能較好的菌株；SD5、SD13產(chǎn)酸量較低，酸度均＜70°T。因此，將菌株SD2、SD4、SD14、SD16、SD17進(jìn)行下一步復(fù)篩。

2.1.4 復(fù)篩Ⅱ

將復(fù)篩Ⅰ選出菌株接種在預(yù)處理后的廢棄白菜葉、青筍葉中，測定尾菜青貯飼料發(fā)酵7 d后的pH值及乳酸菌活菌數(shù)，綜合尾菜青貯飼料感官指標(biāo)評價(jià)復(fù)篩Ⅰ菌株發(fā)酵性能，結(jié)果見表1。由表1可知，從感官指標(biāo)、pH值、乳酸菌活菌數(shù)量比較可見，菌株SD2、SD4發(fā)酵廢棄白菜葉、青筍葉，發(fā)酵7 d，尾菜青貯飼料pH均＜4.0，乳酸菌數(shù)量＞1.0×108CFU/g，顏色、氣味、質(zhì)地等感官指標(biāo)良好，適合用于尾菜青貯飼料的發(fā)酵。

表1 不同復(fù)篩菌株發(fā)酵青貯尾菜結(jié)果Table 1 Results of vegetable wastes silage fermented by different secondary screening strains

2.2 培養(yǎng)條件研究

2.2.1 不同培養(yǎng)溫度對菌株生長的影響

將菌株SD2、SD4分別接種在裝MRS液體培養(yǎng)基中，置于不同溫度下靜置培養(yǎng)24 h，測定培養(yǎng)液OD600nm值，考察不同培養(yǎng)溫度對篩選菌株SD2、SD4生長的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株SD2在35℃條件下，培養(yǎng)液OD600nm值最高，因此，35℃是菌株SD2最適生長溫度。菌株SD4在37℃條件下，培養(yǎng)液OD600nm最高，因此，37℃是菌株SD4最適生長溫度。

圖3 不同培養(yǎng)溫度對菌株生長的影響Fig.3 Effects of different culture temperature on strains growth

2.2.2 不同初始pH對菌株生長的影響

將菌株SD2、SD4分別接種在不同初始pH的MRS液體培養(yǎng)基中，置于37℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，測定培養(yǎng)液OD600nm值，考察不同初始pH對篩選菌株SD2、SD4生長的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，培養(yǎng)基初始pH過高或過低均不利于菌株的生長。SD2在初始pH 6.5培養(yǎng)基中，培養(yǎng)液OD600nm值最高，因此，選擇pH 6.5為菌株SD2最適生長初始pH值。SD4在初始pH 6.5培養(yǎng)基中，培養(yǎng)液OD600nm值最高，因此，選擇pH 6.5為菌株SD4最適生長初始pH值。

圖4 不同初始pH值對菌株生長的影響Fig.4 Effects of different initial pH on strains growth

2.2.3 不同接種量對菌株生長的影響

圖5 不同接種量對菌株生長的影響Fig.5 Effects of different inoculum on strains growth

將菌株SD2、SD4分別按不同接種量接種在MRS液體培養(yǎng)基中，置于37℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，測定培養(yǎng)液OD600nm值，考察不同接種量對篩選菌株SD2、SD4生長的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，菌株SD2、SD4在接種量6%的條件下，培養(yǎng)液OD600nm值最高，因此選擇菌株SD2、SD4最佳接種量均為6%。

2.2.4 不同的培養(yǎng)時(shí)間對菌株生長的影響

將株SD2、SD4分別在上述最適培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)24h，考察不同培養(yǎng)時(shí)間對篩選菌株SD2、SD4生長的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可知，菌株SD2培養(yǎng)約10 h進(jìn)入對數(shù)生長期，培養(yǎng)20 h后進(jìn)入穩(wěn)定期；菌株SD4培養(yǎng)約8 h進(jìn)入對數(shù)生長期，培養(yǎng)16 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。因此，SD2、SD4的最佳培養(yǎng)時(shí)間分別為20 h及16 h。

圖6 菌株SD2及菌株SD4生長曲線Fig.6 Growth curves of strain SD2 and strain SD4

2.3 菌株鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察

對篩選獲得菌株SD2、SD4進(jìn)行菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)觀察，結(jié)果分別見圖7及圖8。由圖7及圖8可知，菌株SD2在MRS瓊脂平板上，菌落灰白色，圓形，凸起，表面平滑，濕潤，邊緣整齊，直徑2～3 mm。顯微鏡油鏡下觀察，菌體呈長桿狀，單個(gè)，成對或成短鏈，革蘭氏染色陽性。菌株SD4在MRS瓊脂平板上，菌落微白色，圓形，扁平，濕潤，邊緣不規(guī)則，直徑為1～2 mm。顯微鏡油鏡下觀察，細(xì)胞短桿狀，單個(gè)、成對或鏈狀排列，革蘭氏染色陽性。

圖7 菌株SD2(A)及菌株SD4(B)的菌落形態(tài)Fig.7 Colonial morphology of strain SD2(A)and strain SD4(B)

圖8 菌株SD2(A)及菌株SD4(B)的細(xì)胞形態(tài)Fig.8 Cells morphology of strain SD2(A)and strain SD4(B)

2.3.2 生理生化檢測

對篩選獲得菌株SD2、SD4進(jìn)生理生化檢測，結(jié)果見表2。由表2可知，菌株SD2明膠液化、吲哚形成、過氧化氫酶試驗(yàn)均為陰性，葡萄糖、木糖、水楊苷、七葉苷、麥芽糖、甘露醇、蔗糖碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)均為陽性。菌株SD4明膠液化、吲哚試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)，木糖、水楊苷、七葉苷、麥芽糖、甘露醇發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)均為陰性，葡萄糖、蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)為陽性。從菌株菌落、菌體形態(tài)和革蘭氏染色反應(yīng)基礎(chǔ)上結(jié)合生理生化檢測結(jié)果，菌株SD2初步鑒定為植物乳桿菌，菌株SD4初步鑒定為發(fā)酵乳桿菌。

表2 菌株SD2及菌株SD4生理生化檢測結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical detection results of strain SD2 and strain SD4

2.3.3 16S rRNA測序

將菌株SD2、SD4的16S rRNA基因測序結(jié)果在NCBI Genbank進(jìn)行BLAST比對，從基因序列同源性對比結(jié)果可知，菌株SD2與登錄號FJ386491.1的16S rDNA基因序列相似性為100%，菌株SD4與登錄號EU419593.1的16S rDNA基因序列相似性為99%，結(jié)合2株菌的菌落形態(tài)、菌體形態(tài)特征，生理生化試驗(yàn)結(jié)果，將菌株SD2鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），菌株SD4鑒定為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentums）。

3 結(jié)論

從泡菜中分離篩選適合尾菜青貯的乳酸菌，通過產(chǎn)酸性試驗(yàn)和尾菜青貯發(fā)酵試驗(yàn)篩選出出SD2、SD4兩株產(chǎn)酸能力強(qiáng)，青貯廢棄白菜葉、青筍葉效果良好的菌株。在30℃進(jìn)行尾菜青貯發(fā)酵，尾菜青貯飼料7 d后pH均低于4.0，尾菜青貯飼料乳酸菌活菌數(shù)大于1×108CFU/mL。

菌株SD2、SD4最適培養(yǎng)溫度分別為35℃、37℃，最適培養(yǎng)基初始pH均為6.5，最適接種量均為6%，最適培養(yǎng)時(shí)間分別為20 h、16 h。兩株菌在最適條件下培養(yǎng)20 h后pH值均能下降到pH 3.5以下，具有良好的尾菜青貯發(fā)酵潛能。

對篩選獲得的菌株SD2、SD4經(jīng)細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察，生理生化特性檢測及16S rRNA基因序列分析，菌株SD2鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），菌株SD4鑒定為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentums）。

[1]杜鵬祥，韓雪，高杰云，等.我國蔬菜廢棄物資源化高效利用潛力分析[J].中國蔬菜，2015（7）：15-20.

[2]韓雪，常瑞雪，杜鵬祥，等.不同蔬菜種類的產(chǎn)廢比例及性狀分析[J].農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2015，32（4）：377-382.

[3]周苗苗，崔景香.蔬菜莖葉混合青貯技術(shù)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（26）：9057-9058.

[4]馮煒弘，汪建旭，楊道蘭，等.乳酸菌劑對花椰菜莖葉青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響[J].中國飼料，2013（15）：19-24.

[5]任海偉，趙拓，李金平，等.玉米秸稈與廢棄白菜混貯料的發(fā)酵特性及其乳酸菌分離鑒定[J].草業(yè)科學(xué)，2015，32（9）：1508-1517.

[6]楊道蘭，汪建旭，馮煒弘，等.花椰菜莖葉與玉米秸稈的混貯品質(zhì)[J].草業(yè)科學(xué)，2014，31（3）：551-557.

[7]AVILA C L D,VALERIANO A R,PINTO J C,et al.Chemical and microbiological characteristics of sugar cane silages treated with microbial inoculants[J].Rev Bras Zootecn,2010,39(1):25-32.

[8]FILYA I.The effect ofLactobacillus buchneri,with or without homofermentative lactic acid bacteria,on the fermentation,aerobic stability and ruminal degradability of wheat,sorghum and maize silages[J].J Appl Microbiol,2003,95(5):1080-1086.

[9]張?jiān)鲂溃蹪?青貯添加劑研究進(jìn)展[J].草業(yè)科學(xué)，2006，23（9）：56-63.

[10]中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保存管理中心.中國農(nóng)業(yè)菌種目錄[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2012：504.

[11]杜鵬.乳品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2006：226.

[12]周德慶，徐德強(qiáng).微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程（第3版）[M].北京：高等教育出版社，2013：164-166.

[13]黃曉晗.青貯飼料發(fā)酵用乳酸菌的篩選及其發(fā)酵劑的制備研究[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[14]邵建寧，張文齊，麻和平，等.長雙歧桿菌活菌制劑下游制備方法優(yōu)化[J].中國釀造，2012，31（1）：99-101.

[15]東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學(xué)出版社，2001：353-364.

[16]凌代文，東秀珠.乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1999：6-16.

[17]何軼群，雷趙民，吳潤，等.青貯飼料中優(yōu)良乳酸菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究[J].生物技術(shù)通報(bào)，2013（5）：177-183.

Isolation,identification and culture condition of lactic acid bacteria for vegetable wastes silage

SHAO Jianning,PENG Zhangpu,ZHANG Wenqi,MA Heping,LIU Caiyun,WANG Jie,ZHAO Haoxing
(Institute of Biology,Gansu Provincial Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

Lactic acid bacteria strain SD2 and SD4 which had a strong acid-producing ability and good silage effect on vegetable wastes(the waste Chinese cabbage leaves and endive sprout leaves)were isolated from pickles and identified,and their culture conditions were researched.The results showed that the optimum culture temperatures of strain SD2 and SD4 were 35℃and 37℃,respectively.The optimum culture times were 20 h and 16 h,respectively.The both optimum initial pH were 6.5.The both optimum inoculums were 6%.The strain SD2 and SD4 were proceeded vegetable wastes fermentation at 30℃,respectively.After 7 d,the both vegetable wastes silage pH were lower than 4.0,and the viable cell counts of lactic acid bacteria were more than 1×108CFU/g.The morphology,biochemical detection and 16S rRNA sequence of strain SD2 and SD4 were analyzed.The strain SD2 and SD4 were identified asLactobacillus plantarumandLactobacillus fermentum,respectively.

vegetable waste;silage;lactic acid bacteria;isolation and identification;culture condition

Q939.97

0254-5071（2016）11-0123-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.025

2016-09-02

蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012-2-143）

邵建寧（1971-），男，高級工程師，本科，主要從事生物工程應(yīng)用基礎(chǔ)研究工作。