錢昕妤， 魏躍鋼

(1.江蘇省無(wú)錫市惠山區(qū)人民醫(yī)院皮膚科， 江蘇 無(wú)錫 214000 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院中醫(yī)皮膚教研室， 江蘇 南京 210023)

瓊玉膏抗皮膚自然老化作用的實(shí)驗(yàn)研究

錢昕妤1， 魏躍鋼2

(1.江蘇省無(wú)錫市惠山區(qū)人民醫(yī)院皮膚科， 江蘇 無(wú)錫 214000 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院中醫(yī)皮膚教研室， 江蘇 南京 210023)

目的:探討瓊玉膏抗皮膚自然老化的作用機(jī)理。方法:50只18個(gè)月齡大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、瓊玉膏大劑量組(14g/kg)、瓊玉膏中劑量組(7g/kg)、瓊玉膏小劑量組(3.5g/kg)和維生素E組(2g/kg)，各組大鼠均連續(xù)灌胃給藥4周，測(cè)定皮膚組織SOD活性、羥脯氨酸、丙二醛含量和透明質(zhì)酸水平，比較皮膚厚度和皮膚血管化程度；測(cè)定皮膚組織中VEGF和BFGF蛋白的表達(dá)。結(jié)果:瓊玉膏可增加大鼠皮膚組織SOD活性、羥脯氨酸和透明質(zhì)酸含量，降低丙二醛含量，并且呈劑量依賴性；瓊玉膏可劑量依賴性增加大鼠皮膚真皮層厚度和血管數(shù)目；瓊玉膏可劑量依賴性增加大鼠皮膚組織VEGF和BFGF蛋白含量。結(jié)論:瓊玉膏可增加皮膚組織SOD活性及丙二醛含量而提高皮膚組織的抗氧化防御能力，增加VEGF和BFGF蛋白表達(dá)而提高皮膚血管化程度，增加膠原蛋白和透明質(zhì)酸的含量而提高皮膚厚度而具有較好的抗皮膚老化作用。

皮 膚； 自然老化； 瓊玉膏

本課題研究瓊玉膏抗皮膚自然老化作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選用18月齡SPF級(jí)SD雄性大鼠50只，體重300～500g，SPF級(jí)層流柜內(nèi)分籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)正式開(kāi)始前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，整個(gè)實(shí)驗(yàn)中大鼠自由攝食飲水和進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品:瓊玉膏由本實(shí)驗(yàn)自制:取地黃500g、茯苓100g，水提2h×3次，合并濾液；將人參50g切片，適量水浸泡24h，文火水提2h×2次，合并濾液；混合兩種濾液，靜置，取上清液，水浴濃縮至1000mL(比重1.2l～1.25 kg/L)，加入煉蜜350mL，繼續(xù)濃縮至1000mL，收膏過(guò)濾(比重1.40kg/L)。維生素E軟膠囊(0.1g/粒)，上海信誼藥業(yè)延安藥業(yè)提供，注冊(cè)證號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字H31020237。

1.3主要試劑:超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)檢測(cè)試劑盒、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒、羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)檢測(cè)試劑盒、透明質(zhì)酸(Hyaluronic Acid，HA)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，兔抗鼠八因子相關(guān)抗原(Ⅷ－Rag)多克隆抗體(北京中山生物技術(shù)有限公司)，SP免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色試劑(福州邁新生物技術(shù)公司)，蛋白抽提試劑(美國(guó)Thermo公司)，BCA蛋白定量試劑盒(美國(guó)Pierce公司)，PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抗體(Vascular endothelial Growth Factor，VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Basic Fibroblast Growth Factor，BFGF)抗體、兔抗鼠GAPDH單抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(美國(guó)CST公司)，ECL Prime蛋白印跡試劑(美國(guó)Thermo公司)。

1.4主要儀器:BX52型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，核酸蛋白分析儀(美國(guó)BECKMAN公司)，電泳儀、制膠板、轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio－Red公司)，電泳槽(美國(guó)Bio－Red公司)，凝膠成像系統(tǒng)(以色列Minilumi公司)

1.5分組與造模:將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組，分別為空白對(duì)照組、瓊玉膏大劑量組(14g/kg)、瓊玉膏中劑量組(7g/kg)、瓊玉膏小劑量組(3.5g/kg)和維生素E組(2g/kg)。瓊玉膏大劑量、中劑量和小劑量組大鼠分別給予瓊玉膏原液以及用純凈水按1:1或1:3稀釋后進(jìn)行灌胃，維生素E組大鼠灌胃給予維生素E2g/kg，空白對(duì)照組大鼠灌胃給予等體積純凈水。各組大鼠均連續(xù)灌胃給藥4周。

1.6觀察指標(biāo):各組大鼠給藥4周后分別測(cè)定皮膚組織SOD活性、羥脯氨酸、丙二醛含量和透明質(zhì)酸水平，比較各組大鼠皮膚厚度和皮膚血管化程度；并且測(cè)定各組大鼠皮膚組織中VEGF和BFGF蛋白的表達(dá)。

1.6.1皮膚組織SOD活性、MDA、HYP及HA含量的測(cè)定:各組大鼠處死后立即脫毛后取頸背部皮膚組織約2cm×3cm，制備10%皮膚組織勻漿，離心，取上清液進(jìn)行測(cè)定。SOD活性測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法，HYP及MDA含量測(cè)定分別采用二甲氨基苯甲醛法及硫代巴比妥酸法，HA含量測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA)測(cè)定。

1.6.2皮膚厚度的測(cè)定:皮膚樣本均被切成0.5cm×0. 5cm大小的組織塊進(jìn)行HE染色，具體步驟如下:多聚甲醛浸泡，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片，貼于載玻片，烘干。二甲苯脫去石蠟，乙醇水化，最后入蒸餾水。蘇木精染色，經(jīng)酸水及氨水中分色，蒸餾水沖洗，乙醇脫水，入乙醇伊紅染色液染色，脫水，透明，封固。光鏡下觀察皮膚病理學(xué)形態(tài)觀察。使用Image－Pro Plus顯微分析系統(tǒng)，形態(tài)計(jì)量表皮厚度(μm)。

1.6.3皮膚血管化程度的測(cè)定:石蠟標(biāo)本連續(xù)切片后進(jìn)行SP免疫組化染色，具體步驟如下:常規(guī)脫蠟、水化，胃蛋白酶抗原修復(fù)，PBS沖洗。滴加兔抗人八因子相關(guān)抗原(Ⅷ－Rag)多克隆抗體(1:100)，37℃孵育60min，4℃下過(guò)夜，室溫下孵育20min；PBS沖洗。滴加二抗，37℃孵育30min；PBS沖洗；3，3－二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，0.1%鹽酸分化，自來(lái)水沖洗，PBS沖洗；梯度乙醇脫水干燥，中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察老化皮膚組織血管化程度(放大倍數(shù)200×)。

1.6.4皮膚組織VEGF和bFGF含量測(cè)定:稱取組織重量，提取蛋白并進(jìn)行蛋白定量，調(diào)整蛋白濃度為4. 0mg/mL，煮沸5min變性。按蛋白量40μg/孔進(jìn)行10%SDS－PAGE凝膠電泳(80V20min，150V約1.5h)，轉(zhuǎn)膜(400mA2h)至0.45μm的PVDF膜，于5%脫脂奶粉室溫封閉1h，分別加入一抗，4℃過(guò)夜，TBST緩沖液洗膜，滴加二抗，室溫孵育，洗膜，顯色，顯影，對(duì)條帶進(jìn)行定量分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析(One－way ANOVA)，多重比較采用LSD法多重比較采用什么方法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié) 果

2.1各組大鼠皮膚組織SOD活性、HYP、MDA和HA含量的比較:治療后瓊玉膏小劑量組大鼠皮膚組織SOD活性、HYP、MDA和HA含量與空白對(duì)照組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；瓊玉膏中劑量組大鼠皮膚組織SOD活性、HYP和HA含量較瓊玉膏小劑量組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，MDA含量較瓊玉膏小劑量組大鼠顯著降低(P＜0.01)；瓊玉膏大劑量組大鼠皮膚組織SOD活性、HYP和HA含量較瓊玉膏中劑量組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，MDA含量較瓊玉膏中劑量組大鼠降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。維生素E組大鼠皮膚組織SOD活性、MDA和HA含量較空白對(duì)照組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，MDA含量較空白對(duì)照組大鼠降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，具體見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠皮膚組織SOD活性、HYP、MDA和HA含量的比較(±s)

表1　各組大鼠皮膚組織SOD活性、HYP、MDA和HA含量的比較(±s)

與空白對(duì)照組比較，?P＜0.01；與玉膏小劑量組組比較，＃P＜0.01；與瓊玉膏中劑量組比較，＆P＜0.01

組別nSOD(U/mg)HYP(μg/mg)MDA(nmoL/mg)HA(μg/mg)空白對(duì)照組1022.12±2.620.21±0.043.96±0.52251.64±13.62瓊玉膏小劑量組1024.65±2.750.23±0.053.85±0.47263.27±15.74瓊玉膏中劑量組1027.34±2.84?，＃0.29±0.06?，＃2.95±0.42?，＃293.26±14.66?，＃瓊玉膏大劑量組1035.21±3.35?，＃，＆0.40±0.07?，＃，＆2.28±0.36?，＃，＆324.71±15.49?，＃，＆維生素E組1037.49±3.47?0.38±0.06?2.57±0.33?316.35±13.29?

圖1　皮膚組織HE染色結(jié)果 A:空白對(duì)照組；B:瓊玉膏小劑量組；C:瓊玉膏中劑量組；D:瓊玉膏大劑量組；E:維生素E組

圖2　皮膚組織免疫組化分析結(jié)果 A:空白對(duì)照組；B:瓊玉膏小劑量組；C:瓊玉膏中劑量組；D:瓊玉膏大劑量組；E:維生素E組

2.2各組大鼠皮膚真皮層厚度和血管化程度的比較:治療后瓊玉膏小劑量組大鼠皮膚真皮層厚度和血管數(shù)目與空白對(duì)照組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，瓊玉膏中劑量組大鼠皮膚真皮層厚度和血管數(shù)目較瓊玉膏小劑量組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，瓊玉膏大劑量組大鼠皮膚真皮層厚度和血管數(shù)目較瓊玉膏中劑量組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。維生素E組大鼠皮膚真皮層厚度和血管數(shù)目較空白對(duì)照組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，具體見(jiàn)表2。

2.3各組大鼠皮膚組織VEGF和BFGF蛋白含量的比較:治療后瓊玉膏小劑量組大鼠皮膚組織VEGF和BFGF蛋白含量與空白對(duì)照組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0. 05)，瓊玉膏中劑量組大鼠皮膚組織VEGF和BFGF蛋白含量較瓊玉膏小劑量組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，瓊玉膏大劑量組大鼠皮膚組織VEGF和BFGF蛋白含量較瓊玉膏中劑量組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。維生素E組大鼠皮膚組織VEGF和BFGF蛋白含量較空白對(duì)照組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，具體見(jiàn)表3。

表2　各組大鼠皮膚真皮層厚度和皮膚血管數(shù)目的比較(±s)

表2　各組大鼠皮膚真皮層厚度和皮膚血管數(shù)目的比較(±s)

與空白對(duì)照組比較，?P＜0.01；與玉膏小劑量組組比較，＃P＜0.01；與瓊玉膏中劑量組比較，＆P＜0.01

組別n真皮層厚度(μm)血管數(shù)目(個(gè)/高倍視野)空白對(duì)照組10424.12±25.363.65±1.54瓊玉膏小劑量組10436.45±23.744.74±1.60瓊玉膏中劑量組10477.27±25.29?＃7.82±2.47?＃瓊玉膏大劑量組10524.65±29.66?＃＆12.35±2.54?＃＆維生素E組10494.38±28.42?11.57±2.76?

表3　各組大鼠皮膚組織VEGF和BFGF蛋白的比較(±s)

表3　各組大鼠皮膚組織VEGF和BFGF蛋白的比較(±s)

與空白對(duì)照組比較，?P＜0.01；與玉膏小劑量組組比較，＃P＜0.01；與瓊玉膏中劑量組比較，＆P＜0.01

組別nVEGFBFGF空白對(duì)照組100.24±0.040.32±0.05瓊玉膏小劑量組100.26±0.050.35±0.04瓊玉膏中劑量組100.38±0.06?＃0.44±0.06?＃瓊玉膏大劑量組100.48±0.05?＃＆0.54±0.07?＃＆維生素E組100.42±0.06?0.48±0.05?

3　討 論

活性氧自由基造成基因損傷是細(xì)胞老化的一項(xiàng)重要機(jī)制。自由基是一類能獨(dú)立存在的具有活潑不成對(duì)電子的特殊物質(zhì)，是人體生命活動(dòng)中多種生化反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物，介導(dǎo)了許多疾病和老化的發(fā)生，與組織過(guò)氧化、DNA損傷、蛋白質(zhì)交聯(lián)變性、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)都有重要聯(lián)系。超氧陰離子自由基(O2·－)是生物活性最離的活性氧自由基之一，可對(duì)生物膜、蛋白質(zhì)和核酸造成損傷，誘發(fā)細(xì)胞老化。SOD是機(jī)體主要抗氧化酶之一，參與清除活性氧自由基[1]。MDA是自由基脂質(zhì)過(guò)氧化的分解產(chǎn)物，其水平的變化間接反映了組織中自由基的變化。本研究結(jié)果顯示，瓊玉膏中劑量組大鼠皮膚組織SOD活性較瓊玉膏小劑量組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，丙二醛含量較瓊玉膏小劑量組大鼠降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；瓊玉膏大劑量組大鼠皮膚組織SOD活性較瓊玉膏中劑量組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，丙二醛含量較瓊玉膏中劑量組大鼠降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0. 01)，說(shuō)明瓊玉膏可以劑量依賴性提高老化皮膚組織的抗氧化防御能力。

真皮組織結(jié)構(gòu)的改變是皮膚老化的主要原因，皮膚老化時(shí)出現(xiàn)的皺紋、彈性下降等均與真皮中膠原蛋白和膠原纖維的含量下降有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，瓊玉膏中劑量組大鼠皮膚真皮層厚度和血管數(shù)目較瓊玉膏小劑量組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，瓊玉膏大劑量組大鼠皮膚真皮層厚度和血管數(shù)目較瓊玉膏中劑量組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。維生素E組大鼠皮膚真皮層厚度和血管數(shù)目較空白對(duì)照組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說(shuō)明瓊玉膏可劑量依賴性增加老化皮膚真皮層厚度及血管數(shù)目。

膠原蛋白是哺乳動(dòng)物皮膚的組成成分，其肽鏈氨基酸中占主要成分的是羥脯氨酸[2]，因此羥脯氨酸的含量可以反映皮膚中膠原蛋白的含量。粘多糖足構(gòu)成細(xì)胞間結(jié)締組織的主要成分，其中透明質(zhì)酸是一種直鏈酸性粘多糖，可結(jié)成凝膠將細(xì)胞緊密地粘合在一起，能保持組織間的水分，并使皮膚具有一定的堅(jiān)韌性、彈性和返回性。本研究結(jié)果顯示，瓊玉膏中劑量組大鼠皮膚組織羥脯氨酸和透明質(zhì)酸含量較瓊玉膏小劑量組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；瓊玉膏大劑量組大鼠皮膚組織羥脯氨酸和透明質(zhì)酸含量較瓊玉膏中劑量組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說(shuō)明瓊玉膏可以劑量提高老化皮膚組織膠原蛋白和透明質(zhì)酸的表達(dá)。

VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，具有維持血管正常形態(tài)和完整性、提高血管通透性、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖等作用，還可誘導(dǎo)多種組織蛋白酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)以利于血管生成。BFGF是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族原型，可刺激成纖維細(xì)胞增殖和遷移、誘導(dǎo)或促進(jìn)膠原的形成，增加膠原酶及纖維蛋白酶原激活劑的產(chǎn)生釋放等作用[3]。本研究結(jié)果顯示，瓊玉膏中劑量組大鼠皮膚組織VEGF和BFGF蛋白含量較瓊玉膏小劑量組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，并且瓊玉膏大劑量組大鼠皮膚組織VEGF和BFGF蛋白含量較瓊玉膏中劑量組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說(shuō)明瓊玉膏可以劑量依賴性增加大鼠老化皮膚組織VEGF和BFGF蛋白的表達(dá)。

[1] 劉甜甜，張微，彭金娥，等.延壽液對(duì)大鼠吸人臭氧誘導(dǎo)皮膚衰老的延緩作用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21 (7):142～145.

[2] 夏錦明，張穎，康廷國(guó)，等.活性磷脂抗皮膚老化的實(shí)驗(yàn)研究[J].實(shí)用藥物與臨床，2007，10(1):7～8.

[3] 農(nóng)曉琳，鄧凌，李佳荃，等.bFGF、TGFt3，在人皮膚病理性瘢痕不同時(shí)期的表達(dá)及意義[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，27(2):180～183.

1006－6233(2016)11－1888－04

A 【doi】10.3969/j.issn.1006－6233.2016.11.058

江蘇省中醫(yī)藥局科技項(xiàng)目，(編號(hào):LZ11180)

魏躍鋼