陳 娜，方成武，程 磊，于 嬌

(1.安徽中醫(yī)藥科學(xué)院 亳州中醫(yī)藥研究所，安徽 亳州 236800；2.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 亳州 236800)

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白及人工種子制作與煉苗移栽研究

陳 娜，方成武，程 磊，于 嬌

(1.安徽中醫(yī)藥科學(xué)院 亳州中醫(yī)藥研究所，安徽 亳州 236800；2.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 亳州 236800)

為了建立白及人工種子制作方法，考查相關(guān)因素的影響，摸索煉苗移栽的關(guān)鍵技術(shù)，為白及繁育提供一條新途徑。以不同萌發(fā)時(shí)期的白及種子作為包埋材料，考查包埋時(shí)期、人工胚乳、種皮組分對(duì)人工種子萌發(fā)和成苗及苗重的影響。試驗(yàn)采用L9(34)進(jìn)行正交篩選出最佳的人工胚乳：MS+6-BA(2.0mg/L)+NAA(0.25mg/L)+30g/L土豆汁。同時(shí)得出：所選配方的胚乳中，白及均能萌發(fā)，但添加30g/L的土豆汁能顯著提高成苗率。較好的人工種皮組分為：3%海藻酸鈉+ 0.4mol/LCacl2+ 10g/L納米SiO2。白及試管苗移栽基質(zhì)以碎木屑與土壤按1:2的比例，成活率最高。結(jié)論 優(yōu)化了野生白及人工種子制備的基本方法，制定煉苗的標(biāo)準(zhǔn)，提高了煉苗的成活率，同時(shí)得出白及有無假鱗莖及假鱗莖的大小是決定移栽能否成活的關(guān)鍵條件。

白及；人工種子；試管苗；煉苗移栽

白及Bletillastriata(Thunb.exA.Murray)Rchb.f為蘭科Orchidaceae白及屬多年生藥用草本植物[1]白及的干燥塊莖入藥，具有收斂止血，消腫生肌的作用。用于咯血止血，外傷出血，瘡瘍腫毒，皮膚皸裂；肺結(jié)核咯血，潰瘍病出血[2]。通過走訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)：由于白及市場(chǎng)需求的擴(kuò)大，安徽亳州藥材市場(chǎng)白及價(jià)格目前為900元/公斤。我國大部分地區(qū)的野生白及遭到過度采挖，瀕臨滅絕。但白及種子細(xì)小如粉塵，無胚乳，自然狀況下很難萌發(fā)，繁殖困難。為此，人工快繁白及種苗已成為解決白及資源匱乏的主要途徑。鑒于亳州本地已有部分企業(yè)開始白及的規(guī)模生產(chǎn)，白及種苗的需求量猛增。本研究的目的在于建立一套白及種苗快繁技術(shù)及易于推廣的移栽技術(shù)。

1 試驗(yàn)材料

成熟未開裂的白及蒴果(圖1)由全國第四次中藥資源普查岳西縣普查隊(duì)由安徽岳西縣采回，經(jīng)亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院方成武教授鑒定為蘭科(Orchidaceae)白及屬白及Bletillastriata(Thunb.exA.Murray)Rchb.f.

2 試驗(yàn)方法

2.1 白及蒴果的無菌處理與萌發(fā)

將采回的成熟未開裂的果莢流水下沖洗5 min，在無菌超凈工作臺(tái)上用75%酒精擦拭干凈后，用0.1%的升汞溶液浸泡8 min，無菌水沖洗干凈，滅菌的濾紙吸取多余水分，將蒴果前后兩端切去，從中間切開，用接種勺將種子均勻的播撒于未添加激素的MS液體(蔗糖25 g/L)和未加激素的MS固體(蔗糖25 g/L)培養(yǎng)基上。在溫度為25±2 ℃，光照強(qiáng)度2 500 lx，光照時(shí)間為12 h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

2.2 白及種胚包埋時(shí)期的篩選

用上述條件下培養(yǎng)萌發(fā)7 d、14 d、21 d、28 d的種胚作為包埋材料，考察包埋時(shí)期對(duì)人工種子的影響。

2.3 白及人工胚乳和種皮的篩選

2.3.1 人工胚乳的篩選

圖1 白及果莢

以萌發(fā)21 d的白及種子為材料，3%的海藻酸鈉溶液+0.4 mol/L Cacl2+10 g/L納米SiO2作為人工種皮，考察最佳人工胚乳的組成。在無菌超凈工作臺(tái)上，將萌發(fā)的白及種子浸泡在含3%的海藻酸鈉的胚乳溶液中。浸泡時(shí)間：5 min。采用吸管輕輕汲取包有白及種子的半凝膠狀態(tài)的海藻酸鈉注入含0.4 mol/L 的Cacl2+10 g/L納米SiO2的混合溶液中，確保每顆人工種子只包裹一個(gè)原球莖，15 min后，將形成的人工種子用無菌水沖洗2～3次，置于無菌紙上吸去人工種子表面水分。將制作好的人工種子置于未加激素的MS培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度(25±2) ℃ ，光照時(shí)間12 h/d，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx，21 d后觀察萌發(fā)率、45 d后觀察成苗率。每瓶接種8～10粒人工種子，每三瓶為一組，每組處理重復(fù)3 次。另一部分人工種子播種于滅菌后的基質(zhì)中，觀察萌發(fā)及生長發(fā)育的過程。

萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)為包埋在人工基質(zhì)中的白及原球莖能分化出葉片，突破種皮，并能繼續(xù)生長，萌發(fā)率= 萌發(fā)種子數(shù)/播種數(shù)×100%。以第一片真葉突破種皮為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，萌發(fā)的整株幼苗完全突破種皮，苗的根部稍膨大和1～2條較小的根為成苗標(biāo)準(zhǔn)，成苗率= 苗數(shù)/播種數(shù)×100%。人工胚乳以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)定NAA(0.125、0.25、0.5 mg/L)， 6-BA(1.0、2.0、3.0 mg/L)，土豆汁(20、25、30 g/L)根據(jù)上述3因素3水平，不考慮交互作用，利用正交表L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3.2 種皮的篩選

按2.3.1的方法，將萌發(fā)21 d的白及種胚浸泡于上述試驗(yàn)篩選的最佳人工胚乳中，考察不同種皮對(duì)白及人工種子形成和生長發(fā)育的影響。通過查閱文獻(xiàn)資料[3-4]，種皮配方分別設(shè)為：(1)海藻酸鈉3%+Cacl20.2 mol/L+納米SiO210g/L；(2)海藻酸鈉4%+Cacl20.2 mol/L+納米SiO210 g/L；(3)海藻酸鈉3%+Cacl20.4 mol/L+納米SiO210 g/L；(4)海藻酸鈉4%+Cacl20.4 mol/L+納米SiO210 g/L。每組處理8～10粒人工種子，每處理重復(fù)3次。成苗后，測(cè)量90 d時(shí)的單株苗重。

2.4 白及試管苗的移栽

當(dāng)白及試管苗株高5～7 cm，假鱗莖直徑約0.5 cm并有2～3條較長的根時(shí)，將試管苗從培養(yǎng)瓶中用鑷子輕輕取出，流水下洗去培養(yǎng)基，用吸水濾紙吸取植株表面水分，稱重后，移栽到經(jīng)滅菌的基質(zhì)中，采用碎木屑、土壤、珍珠巖三種基質(zhì)按不同比例(表1)配比，進(jìn)行移栽煉苗，保持基質(zhì)濕潤，空氣濕度在80%左右，每天噴水4～5次，進(jìn)行室內(nèi)煉苗移栽。室內(nèi)煉苗20 d后，再移栽到室外進(jìn)行種植。30 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

3 結(jié)果與分析

3.1 白及蒴果的無菌處理與萌發(fā)

為了獲得無菌培養(yǎng)體系，選擇滅菌效果好，對(duì)試驗(yàn)材料殺傷力盡可能小的藥劑和方法尤為重要。滅菌蒴果時(shí)注意浸泡時(shí)間不可過長，否則易導(dǎo)致蒴果開裂，開裂后滅菌困難，種子萌發(fā)率降低。而且開裂后種子粘在一起，不易控制播種密度，繼代培養(yǎng)時(shí)難以保證每粒人工種子包含一個(gè)擬原球莖。不同培養(yǎng)基中獲得的擬原球莖的狀態(tài)有一定的區(qū)別，MS液體中形成的擬原球莖分布均勻，顆粒較小，不易操作，色澤較暗，包埋后分化困難。MS固體培養(yǎng)基中形成的擬原球莖部分有粘成團(tuán)塊，顆粒較大，但色澤鮮綠，包埋后易分化成苗。王增利在鐵皮石斛原球莖懸浮培養(yǎng)技術(shù)研究中也有類似報(bào)道[5]。最終選擇固體MS中萌發(fā)的單個(gè)鮮綠色原球莖進(jìn)行包埋。

3.2 白及種胚包埋時(shí)期篩選結(jié)果

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)種子萌發(fā)21 d后，是種胚包埋的最佳時(shí)期。萌發(fā)7 d的種子，種子由黃褐色變成綠色，進(jìn)行了吸水膨脹，但種胚過小，包埋時(shí)操作困難。萌發(fā)14 d的已經(jīng)有了初步的分化，包埋后逐漸變褐色，死亡較多。對(duì)萌發(fā)21 d的種胚進(jìn)行包埋，種胚綠色，呈現(xiàn)一定的極性，大小適宜，易形成規(guī)則的球體。萌發(fā)28 d的種子已經(jīng)分化出第一片葉，浸在海藻酸鈉溶液中體積過大，不易形成規(guī)則的球體。選擇萌發(fā)21 d的種胚作為包埋材料最適宜。

3.3 白及人工胚乳及種皮的篩選結(jié)果

通過正交試驗(yàn)篩選白及人工胚乳配方，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

在各種配方的胚乳中，萌發(fā)率都達(dá)到85%以上。3號(hào)、5號(hào)、6號(hào)三個(gè)配方中，萌發(fā)率均超過90%，其中3號(hào)胚乳配方中萌發(fā)率最高達(dá)93.1%。從成苗情況看，配方3號(hào)、5號(hào)、7號(hào)的成苗率分別為68.9%，77.4%，71.8%。

通過正交試驗(yàn)的直觀分析表，三種因素對(duì)白及人工種子萌發(fā)的影響以6-BA和土豆汁為主，NAA的影響較小。經(jīng)方差分析：不同組合的胚乳配方對(duì)白及種子萌發(fā)率無顯著影響。從成苗情況看，土豆汁是成苗的主要影響因素，6-BA次之，而NAA的影響最不明顯。從直觀分析表的均值分析：A2B2C3是成苗的最佳組合，這與本組實(shí)驗(yàn)的實(shí)際成苗率最高的數(shù)據(jù)是一致的。綜合萌發(fā)率和成苗率的情況以及三種因素對(duì)成苗的影響，最終確定A2B2C3是白及人工種子的最佳胚乳配方并以海藻酸鈉3%+ Cacl20.4 mol/L+納米SiO210 g/L作為種皮配方，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，將形成的白及人工種子(圖2)直播于MS和MS+30%土豆汁的培養(yǎng)基上，都能萌發(fā)，生長速度較快，不用繼代轉(zhuǎn)接，可一步成苗(圖3)，且試管苗粗壯，假鱗莖較大而均勻，在添加土豆汁的培養(yǎng)基中的種苗長勢(shì)更好，單株苗平均重最高達(dá)0.630 7 g，移栽后成活率可達(dá)到90%以上(圖4、5)。但在有菌的環(huán)境下進(jìn)行直播，萌發(fā)率不到30%，且生長發(fā)育緩慢。

表1 不同影響因素的L9 (34)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖2 白及人工種子

圖3 人工種子45 d成苗情況

圖4 90 d的試管苗

圖5 試管苗移栽

采用4種配方的種皮接種人工種子后，90 d時(shí)統(tǒng)計(jì)試管苗發(fā)育狀況及試管苗單株苗平均重如表2所示。

表2 90 d試管苗發(fā)育狀況統(tǒng)計(jì)

種皮配方篩選的試驗(yàn)結(jié)果顯示：設(shè)計(jì)的四種種皮配方中，種胚均能萌發(fā)，表明在本試驗(yàn)所設(shè)置濃度范圍內(nèi)，這些因子不會(huì)或很少會(huì)影響白及人工種子的萌發(fā)。但以海藻酸鈉3%+Cacl20.4 mol/L+納米SiO210 g/L萌發(fā)較快，形成的試管苗整齊一致，假鱗莖大小、根長、根數(shù)符合成苗標(biāo)準(zhǔn)。平均單株苗重高于其他三組，故選擇海藻酸鈉3%+Cacl20.4 mol/L +納米SiO210 g/L為種皮配方。

3.4 白及試管苗的移栽成活率結(jié)果統(tǒng)計(jì)

采用不同配比的基質(zhì)對(duì)野生白及試管苗進(jìn)行煉苗移栽，先在室內(nèi)煉苗，然后移栽到室外，30 d后的成活率統(tǒng)計(jì)如表3所示。

表3 不同基質(zhì)移栽試管苗后的成活率統(tǒng)計(jì)

結(jié)果表明：具有假鱗莖的白及試管苗(圖4)移栽成活率均在86%以上，而碎木屑和土壤按1∶2混合時(shí)，成活率最高，可能是由于碎木屑腐爛過程中通過微生物分解產(chǎn)生大量的有機(jī)物質(zhì)，為白及生長提供營養(yǎng)和適于白及生長的酸性環(huán)境；另外，此種混合的基質(zhì)疏松，透氣性和透水性能比其他組合高。土壤與珍珠巖及碎木屑與珍珠巖混合都存在澆水時(shí)珍珠巖易浮在基質(zhì)表層的現(xiàn)象。

4 討論

白及種子細(xì)如粉塵(圖6)，自然狀況下很難萌發(fā)，但通過組織培養(yǎng)技術(shù)萌發(fā)率可達(dá)到95%以上。蘭科白及屬和石斛屬植物的蒴果一旦開裂，種子裸露，易受微生物侵染，表面滅菌處理時(shí)效果有限，而且滅菌劑直接接觸種子，對(duì)種子具有一定殺傷作用，影響種胚的萌發(fā)；再者，微生物的代謝產(chǎn)物亦對(duì)種子的萌發(fā)產(chǎn)生負(fù)面影響[6]。優(yōu)先選用成熟為未開裂的白及蒴果，將種子播種到MS固體培養(yǎng)基上后，吸水膨脹，21 d后可形成原球莖，成熟度較高的金黃色種子萌發(fā)率最高，將形成的擬原球莖進(jìn)行包埋。包埋時(shí)間的選擇對(duì)白及人工種子的萌發(fā)有很大的影響。包埋時(shí)間太早，人工種子萌發(fā)較慢，且不易成活。包埋時(shí)間太遲，原球莖已分化出葉片，制成的人工種子比較容易萌發(fā)，但制作時(shí)操作困難，很難固化成規(guī)則的球形。白及種子本身發(fā)育不完全，缺少胚乳，自然狀況下萌發(fā)率極低，在MS培養(yǎng)基中進(jìn)行萌發(fā)后，選擇擬原球莖階段進(jìn)行包埋，為后期人工種子的制作提供條件。

圖6 白及種子

白及的種胚包埋在所選配方的人工胚乳中均能萌發(fā)，但不同胚乳對(duì)人工種子的成苗和90 d時(shí)的單株苗的平均重有很大的影響。尤其是土豆汁對(duì)成苗的影響最為顯著。土豆汁是植物組織培養(yǎng)中常用的天然添加物，含有豐富的維生素、氨基酸及各種酶，營養(yǎng)豐富，為植物生長提供一些生理活性物質(zhì)，補(bǔ)充一些未知的微量成分，故能很好地促進(jìn)植物的生長發(fā)育[7]。謝寅峰等也發(fā)現(xiàn)土豆汁、香蕉泥等對(duì)霍山石斛組培苗的生長發(fā)育有很好的促進(jìn)作用[8]。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)人工胚乳中添加30 g/L的土豆汁，胚狀體容易分化，形成的試管苗假鱗莖大，葉色深綠，生長健壯。6-BA是植物組培中最常使用人工合成的細(xì)胞分裂素，主要作用是促進(jìn)芽的形成，也可以誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生。在人工胚乳中添加適量6-BA，有利于人工種子萌發(fā)形成試管苗。種皮的成分對(duì)人工種子的形成和試管苗的發(fā)育狀況都有一定的影響。海藻酸鈉包埋的人工種子，形成的膠體表面粘滯，當(dāng)濃度過低時(shí)，人工種子極易失水，隨著濃度的升高，凝膠不易形成球體，而且萌發(fā)較慢，試管苗葉子顏色變淡，較少部分出現(xiàn)失綠。根據(jù)設(shè)計(jì)的四種配方中，以單株苗平均重作為考察依據(jù)，配方3是最好的人工種皮。但白及人工種皮配方的優(yōu)化還有待進(jìn)一步的研究和提高。

保溫保濕是白及煉苗移栽成功的重要因素。這與白及喜溫暖、陰涼和較陰濕的環(huán)境是一致的。但是試管苗有無假鱗莖及假鱗莖的大小是移栽能否成活的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)通過正交法建立了白及人工種子制備體系，進(jìn)行了移栽煉苗研究，得出白及有無假鱗莖及假鱗莖的大小是決定移栽能否成活的關(guān)鍵條件。同時(shí)對(duì)幾種不同基質(zhì)中的試管苗的成活率和生長發(fā)育進(jìn)行了研究。

[1]中科院中國植物志編輯委員會(huì).中國植物志[S].科學(xué)出版社，1999(18)：50.

[2]國家藥典委員會(huì).中國藥典2015版一部[S].中國醫(yī)藥科技出版社，2015：103.

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Research onDomestication Transplanting and Artificial Seeds Production of Bletilla Striata

CHEN Na, FANG Chengwu, CHENG Lei, YU Jiao

(1.InstituteofBozhouTraditionalChineseMedicine,SchoolofAnhuiTraditionalChineseMedicine,Bozhou236800,China;2.BozhouVocationalandTechnicalCollege,Bozhou236800,China)

Objective: To provide a new manufacturing method for the artificial seeds ofBletillastriata, the impact of relevant factors was examined, the key technologies of domestication and transplanting were explored. Methods: The artificial seeds ofBletillastriatawere manufactured by different time germination as the embedding materials, with consideration of the effects of entrapped period, artificial endosperm and testa components on the germination, seedling and seedling weight of the artificial seeds. Results: The best artificial endosperm made by MS+6-BA(2.0 mg/L)+NAA(0.25 mg/L)+30 g/L potato juice has been selected by Orthogonal test designed L9(34). At the same time,Bletillastriatacould germinate in different formulations of the endosperm, but for the higher seedling rate, 30 g/L potato juice can be added into the artificial endosperm. 3% sodium alginate +0.4 mol/L Cacl2+10 g/L nano-SiO2are the better artificial testa components. The highest survival rate was obtained by broken sawdust and soil according to the proportion of 1∶2. Conclusion: A basic method of artificial seeds preparation of wildBletillastriatahas been optimized for the domestication standards and higher survival rate of domestication. Meanwhile, the key condition for transplant survival is the size and presence of theBletillastriatawith fake bulb.

Bletillastriata; artificial seeds; test-tube plantlet; domestication and transplanting

2016-09-06

亳州市創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)領(lǐng)軍人才“中藥栽培與產(chǎn)地加工科研團(tuán)隊(duì)(亳組)”(2014(21))；安徽省質(zhì)量工程項(xiàng)目(2014jyxm530)。

陳娜(1982-)，女，安徽淮北人，講師，碩士研究生，研究方向：藥用植物發(fā)育學(xué)。

R282.5

A

1009-9735(2016)05-0063-05