鄭瑞豐 趙博文 葉 融 張文彪 王華芳

(1. 北京林業(yè)大學林木育種國家工程實驗室, 生物科學與技術學院，北京 100083；2. 北京市延慶區(qū)第一職業(yè)學校，北京 102100)

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雜種白楊717-1B4組培技術研究

鄭瑞豐1趙博文1葉 融1張文彪2王華芳1

(1. 北京林業(yè)大學林木育種國家工程實驗室, 生物科學與技術學院，北京 100083；2. 北京市延慶區(qū)第一職業(yè)學校，北京 102100)

為保持雜種白楊717-1B4的優(yōu)良性狀，解決生根困難瓶頸，建立了生理年齡一致性和容器化生根煉苗的組織培養(yǎng)繁育技術。結(jié)果表明：外植體為母株根蘗的根際萌芽，以有效氯1.0%的乙氰脲酸鈉溶液滅菌25 min，接種在MS培養(yǎng)基上效果最好，再生不定芽達75.91%；以再生不定芽3個以上的外植體進行繼代培養(yǎng)，繼代周期為30 d，平均再生不定芽12.2個；外植體再生的不定芽擴繁1次轉(zhuǎn)移至營養(yǎng)缽基質(zhì)上生根和練苗，增殖系數(shù)達3.73，增殖培養(yǎng)基為MS + 6-BA 0.5 mg/L+ NAA 0.2 mg/L；生根培養(yǎng)基中IBA為2.0 mg/L生根最好，生根率達98.89%；揭開培養(yǎng)瓶蓋馴化小植株容器苗，使之適應自然環(huán)境，馴化成活率達92.5%。

雜種；白楊717-1B4；組織培養(yǎng)；不定芽；生根；煉苗

雜種白楊717-1B4(Populustremula×Populusalba) (以下簡稱717-1B4楊) 屬白楊派落葉喬木[1]，整合了歐洲山楊 (Populustremula) 速生、干形通直、材質(zhì)優(yōu)良、樹形美觀等速生優(yōu)質(zhì)特性，以及銀白楊耐干旱、貧瘠、寒冷和輕度堿土等抗逆優(yōu)勢，成為歐美楊育種最成功的典范。717-1B4楊被廣泛用于研究楊樹雜交育種機制和抗旱、耐鹽、凈化重金屬污染等抗逆機制；用于城鄉(xiāng)行道樹和群體綠化，防風固沙、保持水土、護岸固坡以及荒山荒地生態(tài)建設和商品林生產(chǎn)。

我國學者曾多次進行717-1B4楊引種，由于其白楊派樹種難生根的特性[2]，插穗繁殖難以成活[3]。組織培養(yǎng)成為多數(shù)植物快速繁殖的有效手段[4]。雜種銀中楊[5]、山新楊[6]、三倍體毛白楊[7]、三倍體山楊[8]、銀河 Ⅰ 號[9]、箭胡毛楊[10]、84 K楊[11]等已進行了相關研究，雜種白楊葉柄[12]、嫩葉[13]、新稍[14]、莖段[15]等已作為外植體探索組織培養(yǎng)繁殖體系。外植體取材部位的生理年齡、愈傷組織誘導及植株再生、組織培養(yǎng)不定芽繼代培養(yǎng)的生理年齡積累等都能導致植株變異[16]和無性系退化。但是選擇和采集母株生理年齡最年輕的根莖起源部位的萌芽作為外植體再生植株，其生理年齡與母株基本保持一致，從而保持其性狀的基本穩(wěn)定[17]。本研究從美國引進717-1B4楊繁殖材料，以根蘗植株的根際萌芽建立生理年齡一致性容器化生根煉苗組織培養(yǎng)育苗技術，提出并探討遏制組織培養(yǎng)無性系退化的原理和方法，建立717-1B4楊保持母株性狀和安全馴化成活的組織培養(yǎng)育苗技術體系，對其他樹種的同類問題解決有一定參考價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2010年從美國引進717-1B4楊繁殖材料，在溫室條件下從根孽獲得植株，春季種植于北京延慶試驗基地 (東經(jīng)110.97°，北緯40.47°)，作為選擇和采集外植體的母株。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌培養(yǎng)試驗

春季選擇田間生長的健康無病蟲害的717-1B4楊植株，采集根際萌芽作為外植體，以軟毛刷清潔表面，蘸少許對氯間二甲苯酚溶液 (商品名為滴露，Dettol) 表面清洗，剪取長1.5～2.0 cm具1～2個休眠芽的莖段，用自來水沖洗20 min；在無菌條件下以70%乙醇表面處理30 s，置入消毒劑中表面滅菌。消毒劑濃度分別為0.5%、1.0%、1.5%的乙氰脲酸鈉 (NaDCC) 溶液 (水100 mL，NaDCC 0.65 g片劑2、4、6片，吐溫-80 0.4 mL)，滅菌時間為20、25、30 min，共9個處理 (表1)，無菌水沖洗5次，每次3 min，在滅菌濾紙上瀝干水分，接種于MS培養(yǎng)基上；每處理30個外植體，在組織培養(yǎng)條件下 (光照強度36 μmol/(m2·s)，光/暗節(jié)律16 h/8 h，溫度 (25 ± 1) ℃，下同) 培養(yǎng)15 d，統(tǒng)計外植體去污染率、存活率，篩選外植體表面滅菌最適合的消毒劑濃度和滅菌時間。

表1 不同處理有效氯濃度及消毒時間

1.2.2 生理年齡一致性不定芽再生試驗

將去污染的無菌外植體分別轉(zhuǎn)移到1/2MS (B1)、MS (B2)、WPM (B3) 培養(yǎng)基上，每處理22個外植體，3個重復。在組織培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計每外植體再生不定芽數(shù)量，篩選外植體最適培養(yǎng)基。

選擇外植體再生不定芽3個以上的接種在上述篩選培養(yǎng)基上，在相同條件下繼代培養(yǎng)，每30 d繼代1次，采集并統(tǒng)計每外植體再生的不定芽數(shù)量，測量其長度并觀察生長狀況。

1.2.3 不定芽擴繁試驗

外植體再生的不定芽修剪成1.5～2.0 cm長，接種在增殖培養(yǎng)基上擴繁1次以迅速擴增其數(shù)量。增殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，分別添加植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA 0.5、1.0、1.5 mg/L和NAA 0.1、0.2、0.3 mg/L，組合成9個處理 (表2)，每處理接種外植體30個。在組織培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計分析不定芽擴繁數(shù)量、長度及其生長狀況，篩選最適擴繁培養(yǎng)基。

表2 不同處理2種生長調(diào)節(jié)劑的濃度 (mg·L-1)

1.2.4 容器化生根和煉苗試驗

不定芽在營養(yǎng)缽基質(zhì)中生根和煉苗[18]，以避免717-1B4楊小植株移栽損傷根系難以緩苗恢復致死。1) 容器化生根，上述擴繁1次的不定芽生長至4～5 cm高時轉(zhuǎn)移至聚乙烯營養(yǎng)缽基質(zhì)中誘導生根形成容器苗。生根基質(zhì)為草炭土與珍珠巖的混合物 (1∶1,v/v)，虹吸生根培養(yǎng)基溶液至飽和，置入組織培養(yǎng)瓶中滅菌 (121 ℃, 0.11 MPa, 15 min) 備用。生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA，IBA濃度分別為1.0 (D1)、1.5 (D2)、2.0 (D3)、2.5 (D4) mg/L。不定芽在操作工作臺上接種，每處理30株；在組織培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30 d形成生根的小植株容器苗；統(tǒng)計生根率，篩選最適生根培養(yǎng)基。2) 容器化煉苗，載有小植株容器苗的培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至過渡室，逐漸打開培養(yǎng)瓶蓋，1/4、2/4、3/4和4/4，持續(xù)時間依據(jù)小植株葉片萎蔫情況逐漸延長，直至小植株葉片不萎蔫，容器苗從培養(yǎng)瓶中取出正常田間養(yǎng)護管理，統(tǒng)計植株馴化成活率。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以Excel 2007處理圖表，并進行SPSS方差分析、多重比較 (Duncan法) 及相關性分析，百分數(shù)經(jīng)反正弦 (y=arcsinx) 轉(zhuǎn)換處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理外植體表面滅菌的效果

717-1B4楊根際萌芽外植體表面滅菌效果見表3。處理A1去污染率最低，但去污染外植體全部成活；處理A9去污染率最高，但去污染外植體60%死亡。相關性分析 (表4) 表明，消毒劑濃度與外植體去污染數(shù)呈極顯著正相關，消毒時間無顯著相關。但隨著消毒劑濃度升高和消毒時間延長，外植體死亡數(shù)隨之增加及成活率降低。綜合考慮外植體表面滅菌去污染率及成活率，處理A5最優(yōu)，即效氯濃度1.0%的乙氰脲酸鈉溶液滅菌25 min，外植體去污染率及成活率都較高。

表3 不同處理717-1B4楊根際萌芽外植體表面滅菌的效果

表4 消毒劑濃度、消毒時間與外植體去污染數(shù)、成活數(shù)相關性

2.2 外植體再生不定芽的培養(yǎng)基

由表5可知，外植體在MS培養(yǎng)基上再生不定芽的數(shù)量高達75.91%，在1/2MS、WPM上分別為16.81%和10.45%，差異極顯著。因此，以外植體在MS培養(yǎng)基上再生不定芽進行后面的試驗。

表5 3種培養(yǎng)基對717-1B4楊外植體再生不定芽的影響

2.3 外植體繼代次數(shù)對再生不定芽品質(zhì)的影響

717-1B4楊外植體再生不定芽較多者 (3個以上) 在相同條件下繼代培養(yǎng)6次，再生的不定芽除個別葉片出現(xiàn)邊緣卷曲、變黃 (表6)，生長狀況隨繼代次數(shù)增加無明顯差異。每外植體繼代1～6次的再生不定芽數(shù)量平均為 (12.2 ± 0.95)個，其變化范圍為11.0～13.5個；不定芽高生長、葉片大小等變化均不顯著。

表6 717-1B4楊外植體繼代次數(shù)對再生不定芽生長的影響

2.4 植物生長調(diào)節(jié)劑對不定芽增殖的影響

植物生長調(diào)節(jié)劑細胞分裂素 (6-BA) 和生長素 (NAA) 的濃度和比例對717-1B4楊不定芽增殖的效果見表7。增殖系數(shù)為1.23～3.73，其中處理C2不定芽增殖系數(shù)最大，達3.73。相關性分析 (表8) 表明，6-BA濃度與不定芽增殖系數(shù)呈極顯著負相關，隨著6-BA濃度增大不定芽增殖系數(shù)降低。NAA濃度與不定芽增殖無顯著相關性，但NAA濃度為0.2 mg/L的增殖系數(shù)大于0.1 mg/L和0.3 mg/L。綜合分析結(jié)果表明， 6-BA 0.5 mg/L、NAA 0.2 mg/L組合處理的不定芽增殖效果最好。

表7 植物生長調(diào)節(jié)劑對717-1B4楊不定芽增殖的影響

表8 植物生長調(diào)節(jié)劑濃度與717-1B4楊不定芽增殖系數(shù)的相關性

2.5 IBA濃度對717-1B4楊不定芽容器化生根的影響

717-1B4楊不定芽容器化生根形成小植株容器苗，不定芽在添加5種濃度的IBA生根培養(yǎng)基上，生根率均比對照提高40%以上 (表9)。IBA濃度與生根率的相關性顯著 (表10)，1.0～2.0 mg/L的IBA不定芽生根率隨其濃度升高而提高；IBA 濃度為2.0 mg/L (D3) 時，生根率最高，達98.89%。因此，IBA促進717-1B4楊不定芽生根的最適濃度在2.0～2.5 mg/L (D4) 范圍內(nèi)。

表9 不同IBA濃度處理717-1B4楊不定芽容器化生根的影響

表10 IBA濃度與717-1B4楊不定芽容器化生根率的相關性

717-1B4楊小植株容器化煉苗，簡化了移栽和緩苗程序。在過渡室內(nèi)逐漸打開組織培養(yǎng)瓶蓋至使容器苗小植株葉片不萎蔫時，從培養(yǎng)瓶中取出煉苗使之形成適應自然環(huán)境的組織培養(yǎng)容器苗，146株容器苗經(jīng)過容器化煉苗馴化成活135株，馴化成活率達92.5%。

3 結(jié)論與討論

本研究基于植物具有不同生理年齡的細胞和組織，選擇717-1B4楊根蘗植株的根際萌芽作為外植體，以保持外植體生理年齡與母株一致；以外植體再生不定芽保持了繁殖后代生理年齡與外植體亦即與母株一致，從而保持了組織培養(yǎng)無性系與母株性狀的一致性；基于白楊派樹種難生根特性，容器化生根和煉苗避免了717-1B4楊組織培養(yǎng)小植株移栽馴化階段因須根受到損傷難以緩苗恢復而死亡，基本實現(xiàn)安全渡過煉苗階段馴化成活。本研究涉及717-1B4楊無性繁殖的2個關鍵問題。

1) 保持母株優(yōu)良性狀，遏制無性系退化。植物無性繁殖的優(yōu)勢在于保持母株遺傳性狀。在實際操作中由于母株各部位生理年齡的差異性，從母株上采集的繁殖材料種類、部位、繁殖方式或途徑等均可能導致無性系退化。毛白楊扦插繁殖為遏制其無性系退化創(chuàng)建了多圃系育苗技術[25]，其根繁圃、采穗圃、繁殖圃等基于植物組織培養(yǎng)的理論和過程。而植物組織培養(yǎng)仍然存在無性系退化，在母株和外植體選擇、無菌培養(yǎng)體系建立、不定芽擴繁、不定根發(fā)生、小植株移栽馴化5個階段中母株和外植體生理年齡差異同樣會導致無性系變異；外植體誘導愈傷組織再生植株對環(huán)境敏感容易發(fā)生變異[19]；不定芽繼代培養(yǎng)的生理年齡積累同樣會發(fā)生退化變異[20]，組織培養(yǎng)不定芽途徑較穩(wěn)定地保持母株的遺傳性狀[21]，其繁殖后代最大程度地與母株保持一致。毛白楊×響葉楊莖段為外植體誘導再生的不定芽系數(shù)為6.38[22]。本研究每外植體平均再生不定芽12.2個，且根際萌芽再生植株的生理年齡與外植體和母株一致；外植體分化的不定芽擴繁1次的生理年齡相對于多次繼代擴繁的積累，其數(shù)量因此迅速擴大。

2) 提高難生根樹種717-1B4楊小植株移栽煉苗的成活率。白楊派樹種難生根的特性限制其無性快速繁殖，組織培養(yǎng)依據(jù)植物細胞全能性在試管內(nèi)誘導生根是解決其繁殖困難的有效途徑。但不定芽通常在以瓊脂為半凝固物的培養(yǎng)基上生根[23]，移栽馴化階段小植株根系從瓊脂轉(zhuǎn)移至栽培基質(zhì)的過程中雖然以溫水融解瓊脂，在整個過程中根系必然造成損傷，不得不緩苗恢復重建。在這種情況下難生根樹種雖然不定芽生根率高，根系難以通過緩苗恢復其結(jié)構(gòu)和功能，致使移栽成活率很低[24]，本研究以容器化生根和煉苗方式避免717-1B4楊組織培養(yǎng)植株因移栽大量死亡。以營養(yǎng)缽置入培養(yǎng)瓶，以栽培基質(zhì)替代瓊脂，以基質(zhì)虹吸替代瓊脂和生根培養(yǎng)基 (1/2MS + IBA 2.0 mg/L) 加熱溶解，不定芽生根率達98.89%，為容器化煉苗提供了必要基礎；小植株馴化過程的移栽、緩苗、煉苗等程序轉(zhuǎn)變?yōu)榻议_培養(yǎng)瓶蓋使容器苗適應自然環(huán)境，整個過程不損傷而是完整保護根系；92%以上小植株安全渡過煉苗階段，馴化成為適應自然環(huán)境的容器苗。

本研究以根際萌芽再生不定芽保持母株生理年齡一致和以容器化生根-煉苗保持難生根樹種717-1B4楊組織培養(yǎng)小植株安全煉苗及馴化成活的思路和方法，也為解決林業(yè)的同類問題提供啟示。

致謝：本項研究材料由美國康涅狄格大學李義教授提供，試驗過程中北京八達嶺林場趙廣亮先生給予了幫助，在此一并致謝!

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(責任編輯 韓明躍)

Micropropagation Techniques of Hybrid Aspen Clone 717-1B4

Zheng Ruifeng1, Zhao Bowen1, Ye Rong1, Zhang Wenbiao2, Wang Huafang1

(1. National Engineering Laboratory for Tree Breeding, College of Biological Sciences and Biotechnology,Beijing Forestry University, Beijing 100083, China;2. First Vocational School of Yanqing District, Beijing 102100, China)

In order to maintain the maternal excellent features in offspring and refrain from difficult rooting in vegetative propagation of hybrid aspen, established a juvenility and container rooting-hardening micropropagation system in the present work. The result showed that explants taken from the sprouting between root-shoot junctions of maternal plants, sterilized by soaked 1.0% effective chlorine of sodium dichloroisocyanurate (NaDCC) solution for 25 min, cultured on MS medium, 75.91% of them regenerated juvenile shoots. The explants regenerated more than 3 juvenile shoots were selected and sub-cultured on the same fresh medium in each 30 days, each explant produced 12.2 shoots on average. The shoots from explants multiplicated one time before did container rooting and hardening. The shoots increased 3.73 times on MS medium containing 6-BA 0.5 mg/L and NAA 0.2 mg/L, respectively. The rooting rate reached the highest at 98.89% when IBA was 2.0 mg/L in rooting medium. The container plantlets hardened in reversion and acclimatization by shifting and opening gradually the tissue culture bottles. The container rooted aspen plants survived at 92.5% in the acclimatization stage.

hybrid, aspen 717-1B4, micropropagation, adventitious bud, rooting, plantlets hardening

10. 11929/j. issn. 2095-1914. 2016. 06. 007

2016-06-08

國家自然科學基金 (3370598)；國家自然科學基金 (J1103516)。

王華芳 (1956—)，男，教授，博士生導師。主要研究領域為植物生物技術 (生物工程)。Email: hfwang.163@163.com。

S718.46

A

2095-1914(2016)06-0041-06

第1作者：鄭瑞豐 (1989—)，男，碩士生。研究方向：植物生物技術。Email: zhengruigeng@126.com。