趙拴平,賈玉堂,徐 磊,阮永明

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,安徽 合肥230031)

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安徽東流水牛線粒體D-Loop區(qū)遺傳多樣性與系統(tǒng)進化分析

趙拴平,賈玉堂,徐 磊,阮永明

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,安徽 合肥230031)

【目的】 分析安徽東流水牛群體的分子遺傳特性，為今后開展我國地方水牛品種研究提供科學(xué)依據(jù)。【方法】 采用測序技術(shù)測定安徽東至縣31頭東流水牛線粒體DNA(mtDNA) D-Loop序列，結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫中已報道的22個群體的471條中國水牛D-Loop序列進行聯(lián)合分析，利用DnaSP 5.1軟件統(tǒng)計核苷酸多樣性和單倍型多樣性，利用MEGA 5.10軟件構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)生樹，利用Network 4.60軟件構(gòu)建單倍型的media-joining網(wǎng)絡(luò)。【結(jié)果】 在22個中國水牛群體中發(fā)現(xiàn)163個變異位點，180個單倍型，其核苷酸多樣性為0.018 23±0.002 21，單倍型多樣性為0.877 40±0.013 80，其中在東流水牛D-Loop序列中發(fā)現(xiàn)70個變異位點，構(gòu)成35種單倍型，其核苷酸多樣性為0.013 31±0.002 08，單倍型多樣性為0.944 00±0.023 00，群體變異性水平與中國其他水牛群體接近。N-J系統(tǒng)發(fā)生樹和media-joining進化網(wǎng)絡(luò)顯示，中國水牛分為沼澤型和江河型，前者又分為A和B支系，B支系包括b1和b2 2個亞支系，東流水牛分布于A和B支系中?！窘Y(jié)論】 東流水牛群體遺傳多樣性豐富，且線粒體具有2個母系來源。

水牛;線粒體DNA;遺傳多樣性;單倍型

水牛是我國南方的傳統(tǒng)家畜，主要分布于北緯36°以南，東經(jīng)97°以東的廣大地區(qū)[1]，是我國熱帶、亞熱帶水稻區(qū)的主要役畜，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和畜牧業(yè)生產(chǎn)中具有重要的經(jīng)濟價值。據(jù)2013年聯(lián)合國糧農(nóng)組織FAO統(tǒng)計(http://faostat.fao.org)，我國水牛存欄數(shù)2 300多萬頭，居世界第3位。在系統(tǒng)分類學(xué)中，水牛分為亞洲水牛和非洲水牛2個屬，亞洲水牛根據(jù)其外貌、習(xí)性、生產(chǎn)性能、生物學(xué)特征以及染色體數(shù)目不同，進一步分為沼澤型水牛和江河型水牛。由于中國水牛長期以來以使役為主，肉、乳生產(chǎn)性能不高，隨著近年來農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，農(nóng)村勞動力的轉(zhuǎn)移，以及飼養(yǎng)水牛效益的下降，水牛的使用價值降低。東流水牛主要分布于安徽省沿江丘陵湖區(qū)的東至縣、望江縣、宿松縣和貴池區(qū)等地，中心產(chǎn)區(qū)東至縣位于長江中下游南岸，屬于濱湖地區(qū)。東至縣2002年以前東流水牛飼養(yǎng)量達到3.8萬頭，年出欄量達10 000頭以上，2013年調(diào)查發(fā)現(xiàn)東流水牛存欄僅6 000多頭，其中純種東流水牛母牛存欄不足1 000頭[2]，亟需加以保護。

由于線粒體DNA(mtDNA)D-Loop序列變異速率為其他片段的5～10倍，在世代傳遞過程中沒有重組，已被廣泛應(yīng)用于家畜起源進化、親緣關(guān)系和群體遺傳結(jié)構(gòu)研究。在水牛研究方面，Lei等[3-4]通過對中國興隆、福安、溫州、漢中、信陽、濱湖和江漢7個地方水牛群體119個水牛個體線粒體D-Loop區(qū)序列研究發(fā)現(xiàn)，中國水牛遺傳多樣性豐富，遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)中國水牛分為A、B 2個支系，表明其有2個母系起源，并證明沼澤型水牛是在中國馴化而成的。亐開興等[5]研究了滇東南水牛D-Loop區(qū)序列多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)滇東南水牛遺傳多樣性較為豐富，屬于沼澤型水牛。張自芳等[6]通過研究滇東南水牛D-Loop區(qū)，發(fā)現(xiàn)其存在2個母系血統(tǒng)來源，受河流型水?；驖B入較小。張瑞光等[7]通過研究福安水牛線粒體D-Loop區(qū)，發(fā)現(xiàn)福安水牛遺傳多樣性豐富，系統(tǒng)發(fā)育揭示福安水牛存在2個母系血統(tǒng)來源。盧永芳等[8]研究了安徽江淮水牛D-Loop區(qū)序列多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)江淮水牛具有豐富的遺傳多樣性，群體變異性水平與中國其他水牛群體接近。Yue等[9]通過研究我國22個沼澤型水牛群體線粒體DNA的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)支系A(chǔ)水牛很可能在我國西南地區(qū)馴化而成。本研究通過測定31頭安徽東流水牛線粒體DNA D-Loop序列，結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫中已報道的471條中國水牛D-Loop序列，研究分析東流水牛線粒體D-Loop區(qū)遺傳多態(tài)性和系統(tǒng)進化關(guān)系，以期為地方水牛品種資源保護和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

東流水牛血樣取自安徽省池州市東至縣的水牛群體，樣本間無親緣關(guān)系，頸靜脈采血法采集31頭水牛血液10 mL/頭，ACD抗凝，低溫帶回實驗室，凍存于-80 ℃冰箱中。

為與東流水牛進行比較，從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載了來源于22個群體471條已報道的中國水牛D-Loop序列[4,9]。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取及mtDNA D-Loop區(qū)序列的PCR擴增和測序 利用DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)對31份血液樣品進行基因組提取，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并利用核酸分析儀測定DNA的濃度和純度。利用引物CB1：5′-TAGTGCTAATACCAACGGCC-3′和CB2：5′-AGGCATTTTCAGTGCCTTGC-3′[10]擴增,獲得915 bp的水牛線粒體D-Loop全序列。PCR反應(yīng)體系：2 μL DNA,5 μL 10× PCR緩沖液, 4 μL 2.5 mmol/L dNTP混合物,正反向引物各1 μL (100 ng/μL),0.5 μL 5 U r-TaqDNA 聚合酶，去離子水補充至50 μL；擴增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32個循環(huán)；72 ℃總延伸5 min。擴增產(chǎn)物利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠回收試劑盒進行產(chǎn)物純化與回收, 委托上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 利用DNASTAR 5.0軟件對水牛線粒體DNA D-Loop區(qū)測序序列進行校對，利用ClustalX進行序列比對，利用MEGA 5.10[11]查找序列的多態(tài)位點，利用DnaSP 5.1軟件[12]統(tǒng)計核苷酸多樣性(Nucleotide diversity)和單倍型多樣性(Haplotype diversity)，利用MEGA 5.10軟件構(gòu)建N-J(Neighbor-joining)系統(tǒng)發(fā)生樹，分析不同單倍型間的進化關(guān)系，利用Network 4.60軟件[13]構(gòu)建單倍型的media-joining網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 東流水牛mtDNA D-Loop區(qū)的核苷酸變異和單倍型多樣性

通過分析安徽東流水牛mtDNA D-Loop區(qū)完整序列，發(fā)現(xiàn)其序列長度為911～ 915 bp, 核苷酸變異存在轉(zhuǎn)換和顛換，轉(zhuǎn)換中AG為 2.62% (24/915),TC為3.93%(36/915)，顛換為1.42% (13/915) 。聯(lián)合分析31條安徽東流水牛mtDNA D-Loop測序序列和23條GenBank數(shù)據(jù)庫中已報道的東流水牛mtDNA D-Loop序列，結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn),54個東流水牛群體中共存在70個變異位點，構(gòu)成35種單倍型，其中6種單倍型(Hap10、Hap12、Hap14、Hap16、Hap18和Hap29)為共有單倍型，單倍型Hap16頻率最大，為22.2%(12/54)，其他單倍型均為不同個體所特有。東流水牛mtDNA D-Loop區(qū)核苷酸多樣性為0.013 31±0.002 08，單倍型多樣性為0.944 00±0.023 00，說明其具有豐富的遺傳多樣性。東流水牛突變位點和單倍型頻率見圖1。

N.單倍型頻數(shù) The frequency of haplotypes

圖 1 安徽東流水牛35個線粒體DNA D-Loop單倍型的變異位點

Fig.1 Polymorphic sites of haplotype of 35 mitochondrial D-Loop region detected in 54 Dongliu buffaloes

對中國地方水牛22個群體共502條水牛mtDNA D-Loop序列進行聯(lián)合分析，結(jié)果(表1)發(fā)現(xiàn)，共存在163個變異位點，構(gòu)成180個單倍型，核苷酸多樣性為0.018 23±0.002 21，單倍型多樣性為0.877 40±0.013 80，其中19個是在安徽東流水牛中新發(fā)現(xiàn)的單倍型。廣西水牛群體中共有29個個體，其中16個個體(9種單倍型)具有江河型水牛的血統(tǒng)，可能是引種引發(fā)的基因滲入。如表1所示，安徽東流水牛單倍型多樣性和核苷酸多樣性與其他水牛群體相差無幾，說明其群體遺傳多樣性與其他水牛群體接近。各個水牛群體所對應(yīng)的核苷酸多樣性和單倍型多樣性見表1。

表 1 中國水牛22個群體線粒體DNA D-Loop區(qū)的遺傳多樣性

注：n.樣本數(shù)；k.單倍型數(shù)。

Note:n.Number of samples;k.Number of haplotypes.

2.2 中國地方水牛群體mtDNA D-Loop區(qū)的系統(tǒng)發(fā)生樹和進化網(wǎng)絡(luò)

利用東流水牛mtDNA D-Loop區(qū)35個單倍型構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn)，35個單倍型明顯分為A、B 2個大的支系，A支系包括28個單倍型，代表46個水牛個體，占總水牛群體的85.2%(46/54)；B支系包含7個單倍型，代表8個水牛個體，說明東流水牛具有2個母系來源，即A和B支系，但B支系的單倍型變異程度(87.5%，7/8)比A支系(60.9%，28/46)高。

利用獲得的180個中國水牛mtDNA D-Loop序列單倍型構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)生樹，以牛(Bostaurus)(登錄號NC_006853)作為構(gòu)建系統(tǒng)進化樹的外群體參照，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，180個水牛單倍型分為沼澤型(Ⅰ)和江河型(Ⅱ)兩個水牛群體，其中江河型水牛群體包含9個單倍型，代表廣西水牛群體中16個個體，說明廣西水牛在長期培育過程中，可能是引種引發(fā)的基因滲入；沼澤型水牛群體中有171個單倍型，代表486個個體，分為A、B 2個支系。

進化網(wǎng)絡(luò)(Network)是一種可以客觀描述物種內(nèi)不同單倍型間遺傳進化關(guān)系的方法，其中media-joining進化網(wǎng)絡(luò)可以快速地進行大量單倍型數(shù)據(jù)分析[14]。本研究利用Network 4.60軟件構(gòu)建了沼澤型水牛171個mtDNA D-Loop單倍型間的media-joining進化網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖4。由圖4可看出，A支系呈現(xiàn)以單倍型Hap55為中心，周圍116個單倍型環(huán)繞的星狀輻射結(jié)構(gòu)，它們與中心單倍型有1～6個核苷酸的差異；B支系與A支系之間存在32個核苷酸的差異，包含b1和b2兩個亞支系，其中b1與b2存在12個核苷酸差異；b1支系也呈現(xiàn)星狀輻射結(jié)構(gòu)，b2支系中部分單倍型與中心單倍型間變異性較大。

圖 2 35個安徽東流水牛線粒體DNA D-Loop區(qū)單倍型的N-J系統(tǒng)發(fā)生樹

3 討 論

本研究通過分析安徽東流水牛mtDNA D-Loop區(qū)核苷酸變異，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)換中AG為 2.62% (24/915),TC為3.93%(36/915)，顛換為1.42% (13/915),與Kierstein等[10]在沼澤型水牛和江河型水牛線粒體D-Loop區(qū)多態(tài)性分析中發(fā)現(xiàn)的3個顛換相比，東流水牛的遺傳變異率較高。本研究發(fā)現(xiàn)，東流水牛具有2個母系來源(即A和B支系)，研究結(jié)果與Lei等[3-4]所發(fā)現(xiàn)的中國水牛群體2個母系遺傳起源的觀點一致。對中國22個地方水牛群體進行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)東流水牛的單倍型多樣性(0.944 00±0.023 00)較西林水牛(0.963 00±0.028 00)和德昌水牛(0.970 00±0.044 00)稍低，比其他水牛群體(群體數(shù)量>10)均高，說明東流水牛的遺傳多樣性豐富。而且，盡管A支系為東流水牛的主要支系，B為次要支系，但B支系的單倍型變異程度(87.5%)比支系A(chǔ)(60.9%)高,且與其他地方品種牛研究結(jié)果一致，說明在水牛群體A支系中基因交流較為頻繁。本研究通過對東流水牛mtDNA D-Loop區(qū)全序列的測定分析,發(fā)現(xiàn)其具有豐富的遺傳多樣性,且具有2個母系起源。同時，22個地方水牛群體進化網(wǎng)絡(luò)顯示，支系A(chǔ)呈現(xiàn)以單倍型Hap55為中心向外擴展的星狀結(jié)構(gòu)，b1和b2支系也具有星狀結(jié)構(gòu)的特征，預(yù)示著中國水牛經(jīng)歷了群體的擴張。

Ⅰ.沼澤型水牛群體 Swamp buffalo；Ⅱ.江河型水牛群體 River buffalo

圖 3 180個中國地方水牛線粒體DNA D-Loop區(qū)單倍型的N-J系統(tǒng)發(fā)生樹

Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree of 180 Chinese buffaloes mtDNA D-Loop haplotypes

圓圈代表單倍型，其大小代表單倍型出現(xiàn)的相對頻率，連線表示進化距離

圖 4 中國沼澤型水牛線粒體DNA D-Loop單倍型間的media-joining進化網(wǎng)絡(luò)圖

Fig.4 Media-joining network showing genetic relationships among mtDNA D-Loop halotypes of Chinese swamp buffaloes

目前關(guān)于沼澤型水牛的起源問題，主要有2種觀點，Lau等[15]通過分析研究亞洲水牛線粒體D-Loop區(qū)和細胞色素b基因(Cytb)，發(fā)現(xiàn)亞洲水?？赡芷鹪从谝粋€類沼澤型野水牛，可能是現(xiàn)存的亞洲野水牛；提出沼澤型水牛和江河型水牛約在28 000到87 000年前分化形成；并假設(shè)亞洲野水牛起源于東南亞大陸，向北傳播到中國，向西傳播到印度次大陸，經(jīng)過進化和馴化形成江河型水牛；沼澤型水牛在中國大陸馴化后，通過中國臺灣和菲律賓傳向婆羅洲和蘇拉威西島東部島嶼，或者通過東南亞大陸向南傳向印度尼西亞西部群島。Kierstein等[10]通過分析卡拉保水牛(Carabao)、摩拉水牛(Murrah)、賈法拉巴迪水牛(Jafarabadi)和地中海水牛(Mediterranean)線粒體DNA D-Loop區(qū),提出沼澤型水牛和江河型水?？赡軄碜杂谟《却未箨懙耐粋€馴化事件。然而，由于Kierstein等[10]和Lau等[15]在分析亞洲水牛的起源進化時缺乏中國水牛的數(shù)據(jù)資料,其結(jié)論難免有失偏頗。Lei等[4]通過分析中國7個水牛群體和東南亞水牛線粒體DNA D-Loop區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)沼澤型水?？赡苁窃谥袊鴨为汃Z化而成。Yue等[9]通過對中國22個地方水牛品種線粒體DNA D-Loop區(qū)序列進行分析，證明中國西南地區(qū)是本地水牛的發(fā)源地，證明A支系水牛是在中國西南地區(qū)馴化而成的。Kumar等[16-17]通過對印度江河型水牛線粒體DNA的分析，推測江河型水?？赡苁窃谟《任鞑狂Z化而成的。Mishra等[18]通過分析印度東北部、中國、地中海和東南亞水牛mtDNA，證明部分水牛在印度東北部地區(qū)馴化形成，而后傳播到東南亞?？傊?，要徹底探明中國水牛的起源進化關(guān)系，尚需進一步深入研究。

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Genetic variation and phylogeny of Dongliu Buffalo based on mitochondrial DNA D-Loop

ZHAO Shuanping,JIA Yutang,XU Lei,RUAN Yongming

(Institute of Animal Husbandry and Veterinary Research,Anhui Academy of Agricultural Sciences,Hefei,Anhui 230031,China)

【Objective】 This study investigated molecular genetic characteristics of Dongliu Buffalo from Anhui to provide scientific basis for further study of Chinese Buffalo.【Method】 A total of 31 Dongliu buffaloes from Anhui were sampled and their mtDNA D-Loop sequences were obtained,which were analyzed together with the published D-Loop sequences of 471 Chinese buffaloes in GenBank.The nucleotide diversity and haplotype diversity were found using DnaSP 5.1,the Neighbor-Joining tree were constructed with MEGA 5.10,and the media-joining network were constructed with Network 4.60.【Result】 A total of 163 nucleotide polymorphic sites and 180 haplotypes were identified in 22 Chinese buffaloes,and only 70 nucleotide polymorphic sites and 35 haplotypes were identified in Dongliu population.The estimated overall nucleotide diversity and haplotype diversity were (0.018 23±0.002 21) and (0.877 40±0.013 80),respectively.The genetic variability of Dongliu buffalo was similar with those of other Chinese buffalo populations,with nucleotide diversity of (0.013 31±0.002 08) and haplotype diversity of (0.944 00±0.023 00).The Neighbor-Joining tree and the media-joining network indicated that the mtDNA were divided into two lineages,the A and B lines of swamp buffaloes,and the B line could be further divided into sub-lineages of b1 and b2.The Dongliu buffaloes were distributed into A and B lines.【Conclusion】 The mitochondrial genetic diversity in Dongliu buffalo was rich,and originated from two maternal sources.

buffalo;mitochondrial DNA;genetic diversity;haplotype

時間:2016-10-20 16:36

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.12.004

2015-07-22

國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目-合肥綜合試驗站(CARS-38)；安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長青年創(chuàng)新基金項目(14B0428)

趙拴平(1984-)，女，山西長治人，助理研究員，博士，主要從事肉牛分子育種工作。E-mail:zhaoshuanping@163.com

賈玉堂(1962-)，男，安徽阜陽人，副研究員，主要從事草食動物遺傳育種工作。E-mail:yutang2018@163.com

S823.8+32

A

1671-9387(2016)12-0021-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20161020.1636.008.html