霍孔林，李 昀，王曉曄，胡 浩，李建華，李 珣，2

(1 廣西大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2 廣西理工科學(xué)實驗中心，廣西 南寧 530004)

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GnIH在陸川仔公豬泌尿生殖系統(tǒng)及內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)中的分布

霍孔林1，李 昀1，王曉曄1，胡 浩1，李建華1，李 珣1，2

(1 廣西大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2 廣西理工科學(xué)實驗中心，廣西 南寧 530004)

【目的】 從形態(tài)學(xué)水平和分子水平探究促性腺激素抑制激素(GnIH)在陸川仔公豬泌尿生殖系統(tǒng)和內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)中的分布情況?！痉椒ā?采集30日齡健康陸川仔公豬的睪丸、附睪、附睪管、腎、腎上腺、甲狀腺、腭扁桃體、脾、淋巴結(jié)、胸腺，采用免疫組織化學(xué)和半定量RT-PCR的方法檢測GnIH在其泌尿生殖系統(tǒng)和內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)的分布情況?！窘Y(jié)果】 免疫組織化學(xué)分析結(jié)果顯示，在睪丸、附睪、附睪管、腎、腎上腺、甲狀腺、腭扁桃體、脾、淋巴結(jié)、胸腺均有不同數(shù)量的GnIH免疫陽性細(xì)胞分布。半定量RT-PCR的檢測顯示，GnIHmRNA 除了在甲狀腺、脾和淋巴結(jié)無表達(dá)外，在其余組織均有不同程度的表達(dá)?！窘Y(jié)論】 GnIH在泌尿生殖系統(tǒng)和內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)分布廣泛，提示GnIH在生殖、免疫和內(nèi)分泌等生理過程中可能有重要作用。

GnIH；陸川仔公豬；免疫組織化學(xué)；半定量RT-PCR

日本科學(xué)家Tsutsui等[1]2000年發(fā)現(xiàn)，在鵪鶉的下丘腦中有一種能控制促性腺激素釋放的物質(zhì)，這一物質(zhì)被命名為促性腺激素抑制激素(Gonadotropin-inhibitory hormone，GnIH)，其由GnIH前體肽裂解產(chǎn)生，是一種C末端具有LPXRF(X=L或R)酰胺的結(jié)構(gòu)。目前已經(jīng)證明，GnIH存在于多種動物，如鳥類[1-4]、哺乳類[5-7]、兩棲類[8]和魚類[9]中。GnIH除了參與生殖調(diào)控外，還具有調(diào)節(jié)動物攝食、性行為及影響內(nèi)分泌、應(yīng)激等廣泛的生物學(xué)作用[10-11]。陸川豬是全國八大地方優(yōu)良豬品種之一，具有成熟早、遺傳力穩(wěn)定和繁殖力高等諸多優(yōu)點。GnIH作為動物生殖調(diào)控的關(guān)鍵因子，研究其對陸川豬有何種生理功能具有非常重要的生產(chǎn)應(yīng)用和理論研究價值。本試驗采用免疫組織化學(xué)和半定量RT-PCR的方法，研究了GnIH在陸川仔公豬泌尿生殖系統(tǒng)和內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)中的分布定位，以期為全面深入研究GnIH調(diào)控動物生殖、內(nèi)分泌等生理功能提供形態(tài)學(xué)資料和分子理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要試劑 即用型SABC免疫組化染色試劑盒(羊抗兔)和DAB顯色試劑盒，均購于武漢博士德生物工程有限公司；兔抗豬GnIH，廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實驗室自備抗體；瓊脂糖，購于南京生興生物技術(shù)有限公司；Trizol、RNA反轉(zhuǎn)錄酶、DNA Marker(DL2000)和Golden View核酸染料，均購于南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.1.2 供試動物 6頭30日齡健康陸川仔公豬由廣西畜牧研究所地方豬種活體基因庫贈送，其中3頭頸動脈放血致死后，迅速取出睪丸、附睪、附睪管、腎、腎上腺、甲狀腺、腭扁桃體、脾、淋巴結(jié)、胸腺放入液氮中速凍后轉(zhuǎn)入-70 ℃保存，用于半定量RT-PCR。另外3頭用速眠新麻醉后切開頸部皮膚，分離兩側(cè)頸動脈和頸靜脈，將一側(cè)頸動脈切開，從另一側(cè)頸靜脈灌注生理鹽水，待動脈側(cè)流出液體較清亮?xí)r，開始灌注體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液至全身肌肉僵硬，取與半定量RT-PCR相同的組織，放入體積分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)脫水透明，石蠟包埋，切片(厚5 μm)，貼附于玻片，常溫干燥過夜后置于-20 ℃保存，用于免疫組織化學(xué)分析。

1.2 免疫組織化學(xué)分析

采用常規(guī)方法對切片進(jìn)行脫蠟后，置微波爐中進(jìn)行抗原熱修復(fù)；浸泡于體積分?jǐn)?shù)3% H2O230 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水洗3次；滴加正常兔血清封閉液，室溫30 min，甩去多余液體；滴加一抗GnIH(稀釋度1∶200)，4 ℃過夜，37 ℃復(fù)溫1 h，PBS洗3次，每次5 min；滴加二抗(生物素化羊抗兔IgG)，37 ℃ 30 min；PBS洗3次，每次5 min；滴加DAB，室溫顯色5 min；蒸餾水使反應(yīng)終止；蘇木精復(fù)染15 s，封片。陰性對照：用PBS代替一抗，其他步驟不變。在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，選取背景清晰、細(xì)胞胞體呈棕黃色-棕褐色顆粒且具有典型代表性的免疫陽性細(xì)胞進(jìn)行拍照分析。

1.3 半定量RT-PCR擴(kuò)增

在無RNA酶的環(huán)境中按照Trizol試劑的說明書提取總RNA。cDNA的合成采用vazyme試劑盒一步反轉(zhuǎn)錄法進(jìn)行，20 μL的RT反應(yīng)體系包括2×RT Mix 10 μL、HiScript 2 μL、Oligo dT181 μL、總RNA 7 μL；混合后置于50 ℃水浴45 min，RT產(chǎn)物置-20 ℃保存待用。選取GAPDH為內(nèi)源性參照基因，檢測豬GnIHmRNA在不同組織中的表達(dá)情況。根據(jù)NCBI已登錄的牛、羊GnIH序列(牛、羊的GnIHGenBank ID分別為EF494241、NM174168.1)中同源性較高的部分設(shè)計引物,其序列如下：GnIH-1.5′-TAA CAT CCA ACA TCT- TTT GTA CAG-3′，GnIH-2.5′-CGG GTG ATG- GAG TAA AGT AAC-3′,擴(kuò)增GnIH基因的片段長度為442 bp；GAPDH-1.5′-AGG TCG GAG- TGA ACG GAT TTG-3′,GAPDH-2.5′-CAG- TCT TCT GGG TGG CAG TGA T-3′,擴(kuò)增GAPDH基因的片段長度為549 bp。PCR程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，退火30 s(GnIH退火溫度56 ℃，GAPDH退火溫度57 ℃)，72 ℃延伸30 s，適當(dāng)循環(huán)(GnIH48個循環(huán)，GAPDH42個循環(huán))；72 ℃延伸10 min后終止反應(yīng)。PCR完成后，用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 GnIH免疫組織化學(xué)結(jié)果

2.1.1 在生殖系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)的分布定位 在睪丸的生精小管內(nèi)，GnIH陽性細(xì)胞多且排列緊密，多數(shù)圍繞在生精小管邊緣部，睪丸間質(zhì)也有數(shù)量較多的GnIH免疫陽性細(xì)胞，呈簇狀分布(圖1-A)。在附睪中，GnIH免疫陽性細(xì)胞分布于結(jié)締組織部、輸出小管及附睪管，結(jié)締組織中GnIH免疫陽性細(xì)胞數(shù)量不多，呈團(tuán)狀分布，輸出小管邊緣GnIH免疫陽性細(xì)胞分布較多且排列緊密(圖1-B)；在附睪管中，GnIH免疫陽性細(xì)胞緊密排列在附睪管外周，發(fā)育后期附睪管上GnIH免疫陽性反應(yīng)較發(fā)育前期弱，其間質(zhì)也有數(shù)量較多的GnIH免疫陽性細(xì)胞，呈梭狀，緊密圍繞附睪管(圖1-C)。在腎中，腎小體、腎放線和皮質(zhì)迷路均呈中等GnIH免疫陽性反應(yīng)(圖1-D)。在對照組試驗中，睪丸、附睪、附睪管和腎中均無棕黃色-棕褐色顆粒，呈陰性(圖1-A1～D1)。

A～J.分別為試驗組睪丸、附睪、附睪管、腎、腎上腺、甲狀腺、腭扁桃體、脾、淋巴結(jié)、胸腺;A1～J1.分別為對照組睪丸、附睪、附睪管、腎、腎上腺、甲狀腺、腭扁桃體、脾、淋巴結(jié)、胸腺；箭頭所示為GnIH免疫陽性細(xì)胞。

圖 1 GnIH在陸川仔公豬泌尿生殖系統(tǒng)及內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)中的分布定位

Fig.1 Distribution of GnIH in urinary,reproductive,endocrine and immune systems of the Luchuan male piglets

2.1.2 在內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的分布定位 GnIH免疫陽性反應(yīng)細(xì)胞在腎上腺、甲狀腺、腭扁桃體、脾、淋巴結(jié)和胸腺中均有分布。腎上腺皮質(zhì)和髓質(zhì)均有中等程度GnIH免疫陽性反應(yīng)細(xì)胞(圖1-E)。甲狀腺濾泡旁細(xì)胞呈中等GnIH免疫陽性反應(yīng)，而濾泡細(xì)胞呈GnIH免疫反應(yīng)強陽性(圖1-F)。腭扁桃體復(fù)層扁平上皮、彌散籬笆組織及淋巴小結(jié)均呈較強的GnIH免疫陽性反應(yīng)(圖1-G)。脾臟紅髓和白髓均有較強的GnIH免疫陽性反應(yīng)，紅髓中GnIH免疫陽性細(xì)胞呈團(tuán)塊狀分布，白髓中GnIH免疫陽性細(xì)胞主要分布于動脈周圍淋巴鞘(圖1-H)。在淋巴結(jié)中，淺層皮質(zhì)里的小結(jié)間彌散淋巴組織和副皮質(zhì)區(qū)均呈現(xiàn)中等GnIH免疫陽性反應(yīng)(圖1-I)。胸腺的髓質(zhì)中有數(shù)量較多的GnIH免疫反應(yīng)強陽性細(xì)胞(圖1-J)。在對照組試驗中，腎上腺、甲狀腺、腭扁桃體、脾、淋巴結(jié)和胸腺中均無棕黃色-棕褐色顆粒，呈陰性(圖1-E1～J1)。

2.2GnIHmRNA表達(dá)情況

半定量RT-PCR結(jié)果(圖2)顯示，GnIHmRNA在睪丸、腎、腎上腺的表達(dá)量較高，附睪、腭扁桃體、胸腺呈中等程度表達(dá)，在甲狀腺、脾和淋巴結(jié)幾乎無表達(dá)。

A.GAPDH mRNA半定量RT-PCR電泳圖；B.GnIH mRNA半定量RT-PCR電泳圖。

圖 2GnIHmRNA在陸川仔公豬泌尿生殖系統(tǒng)和內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)中的表達(dá)情況

Fig.2 Statistical analysis ofGnIHmRNA expression in urinary,reproductive,endocrine and immune systems of Luchuan male piglets

3 討 論

在動物生產(chǎn)的過程中，繁殖能力的高低是決定其經(jīng)濟(jì)效益的重要因素。而越來越多的試驗結(jié)果表明，GnIH作為生殖調(diào)控的關(guān)鍵因子，對調(diào)節(jié)促性腺激素的分泌和合成有重要的作用[12-13]，所以深入研究其生理功能是很有必要的。在禽類中，GnIH和GnIH-R在睪丸中都有表達(dá)[14]，提示在禽類生殖細(xì)胞的分化過程中有GnIH的參與。筆者曾研究了GnIH在母豬HPG軸中的分布和生理周期變化，發(fā)現(xiàn)GnIH及其受體GPR147在HPG軸均有分布，且在生殖周期中的表達(dá)呈現(xiàn)規(guī)律性的波動[15]。有研究表明，GnIH可能是以負(fù)反饋調(diào)節(jié)機制影響了生殖系統(tǒng)中性激素的分泌[16-17]，也有研究表明GnIH有可能是通過旁分泌或自分泌進(jìn)而影響了HPG軸中性激素的分泌[18]。Zhao等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，在敘利亞倉鼠的睪丸間質(zhì)細(xì)胞、精原細(xì)胞和精母細(xì)胞中均有GnIH的分布，這與本研究的結(jié)果一致。鄭路程等[20]研究發(fā)現(xiàn)，不同日齡的公豬其GnIH免疫陽性神經(jīng)元的數(shù)量和GnIHmRNA的表達(dá)量在HPG軸呈規(guī)律性的變化，表明GnIH可能對豬的性行為會產(chǎn)生重要的影響。本研究除印證了GnIH在睪丸的分布外，還發(fā)現(xiàn)在發(fā)育后期附睪管上GnIH免疫陽性反應(yīng)較發(fā)育前期弱，提示GnIH對附睪管的生長發(fā)育或者對其營養(yǎng)精子的功能起到了關(guān)鍵的作用。

此外筆者發(fā)現(xiàn)，在腎上腺的皮質(zhì)和髓質(zhì)部位有GnIH的分布，提示它可能參與了激素生成和分泌的生理過程；在甲狀腺中，其濾泡旁細(xì)胞和濾泡細(xì)胞有GnIH免疫陽性反應(yīng)，而GnIHmRNA無表達(dá)，這提示GnIH是通過旁分泌進(jìn)而影響甲狀腺的生成或分泌的；在免疫系統(tǒng)中，GnIH免疫陽性細(xì)胞在脾(紅髓、白髓)，腭扁桃體(復(fù)層扁平上皮、彌散籬笆組織及淋巴小結(jié))，淋巴結(jié)(淺層皮質(zhì)里的小結(jié)間彌散淋巴組織和副皮質(zhì)區(qū))均有分布，提示GnIH同時也參與了免疫生理過程。在腎中，腎小體、腎放線和皮質(zhì)迷路有GnIH免疫陽性反應(yīng)，且GnIHmRNA的表達(dá)量較高,則提示GnIH可能在參與維持體液和電解質(zhì)的平衡中起到了重要作用。

本研究結(jié)果為GnIH在泌尿生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)的分布定位提供了直觀的形態(tài)學(xué)資料和分子理論依據(jù)，但其具體的生理調(diào)控機制仍需做更深入的研究。

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Distribution of gonadotropin-inhibitory hormone (GnIH) in urinary,reproductive,endocrine and immune systems of Luchuan male piglets

HUO Konglin1,LI Yun1,WANG Xiaoye1,HU Hao1,LI Jianhua1,LI Xun1，2

(1 College of Animal Science and Technology,Guangxi University,Nanning,Guangxi 530004,China；2GuangxiExperimentCentreofScienceandTechnology，Nanning,Guangxi530004,China)

【Objective】 This study analyzed the distribution of GnIH in urinary,reproductive,endocrine and immune systems of the Luchuan male piglets from the morphology and molecular levels.【Method】 Testis,epididymis,ductus epididymis,kidney,adrenal gland,thyroid gland,palatine tonsil,spleen,lymph gland and thymus tissue of 30 d old healthy male piglets were collected,and immuhischemistry (IHC) and semi-quantitative RT-PCR were used to study the distribution and expression of GnIH in urinary,reproductive,endocrine and immune systems.【Result】 IHC results showed that GnIH immune positive cells distributed in testis,epididymis,ductus epididymis,kidney,adrenal gland, thyroid gland,palatine tonsil,spleen,lymph node,and thymus.The results of semi-quantitative RT-PCR suggested that GnIH mRNA expression in all tissues except for thyroid gland,spleen and lymph node.【Conclusion】 GnIH widely distributes in urinary,reproductive,endocrine and immune systems,indicating that GnIH may play an important role in many physiological processes,such as reproduction,immune and endocrine.

GnIH;Luchuan male piglets;IHC;semi-quantitative RT-PCR

時間:2016-10-20 16:36

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.12.003

2015-07-06

“大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃”國家級創(chuàng)新訓(xùn)練項目(141059332)；廣西大學(xué)基金項目(XJZ14307)；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(31402151)；廣西理工科學(xué)實驗中心項目(KTYX2014007)

霍孔林(1993-)男，廣西藤縣人，本科在讀，主要從事動物神經(jīng)內(nèi)分泌研究。E-mail:429871905@qq.com

李 珣(1985-),女，廣西桂林人，講師，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事動物神經(jīng)內(nèi)分泌研究。 E-mail:lixun198@163.com

S828.1

A

1671-9387(2016)12-0016-05

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