張凱莉　高小妹(綜述)　欽倫秀1,2,△(審校)

(1復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院普外科　上?！?00040; 2復(fù)旦大學(xué)腫瘤轉(zhuǎn)移研究所　上?！?00040; 3復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院　上?！?00032)

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循環(huán)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性及其意義

張凱莉3高小妹3(綜述)欽倫秀1,2,3△(審校)

(1復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院普外科上海200040;2復(fù)旦大學(xué)腫瘤轉(zhuǎn)移研究所上海200040;3復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院上海200032)

【摘要】循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (circulating tumor cells,CTCs)是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要因素。近10年隨著CTCs檢測技術(shù)的進(jìn)步,發(fā)現(xiàn)CTCs的數(shù)目與患者預(yù)后密切相關(guān);根據(jù)CTCs的生物學(xué)特性進(jìn)行亞群分型能夠更合理地指導(dǎo)個(gè)體化治療方案的選擇。

【關(guān)鍵詞】循環(huán)腫瘤細(xì)胞;腫瘤轉(zhuǎn)移;腫瘤治療

腫瘤細(xì)胞的播散是腫瘤發(fā)展進(jìn)程中的重要特征[1],腫瘤細(xì)胞從原發(fā)病灶脫落,浸潤基底膜,穿過血管壁進(jìn)入血液循環(huán)形成循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (circulating tumor cells,CTCs),隨著血液循環(huán)到達(dá)并定植在遠(yuǎn)端器官或重新定植到原發(fā)病灶,導(dǎo)致原位復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)端器官轉(zhuǎn)移病灶的形成[2-3]。早在1869年Thomas Ashworth首次發(fā)現(xiàn)腫瘤患者外周血中存在CTCs[4]。CTCs作為轉(zhuǎn)移病灶的種子前體,在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中扮演了十分重要的作用。近10年,由于其分離和鑒定技術(shù)的發(fā)展,CTCs再次成為腫瘤轉(zhuǎn)移研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。2015年至今關(guān)于CTCs的研究平均以每周25篇的速度呈現(xiàn)在PubMed,同時(shí)ClinicalTrials.gov上顯示近720項(xiàng)以CTCs作為腫瘤生物學(xué)標(biāo)記物的臨床試驗(yàn)。越來越多的研究結(jié)果表明CTCs數(shù)目和其生物學(xué)特性與腫瘤轉(zhuǎn)移緊密相關(guān),且具有極為重要的臨床指導(dǎo)意義。本文就CTCs的富集分離檢測技術(shù)、生物學(xué)特征及潛在的臨床應(yīng)用這三方面對CTCs的研究現(xiàn)狀作一綜述。

CTCs的富集分離及鑒定的方法

CTCs的富集分離的方法主要基于CTCs不同于血細(xì)胞的生物學(xué)和物理學(xué)的特征。

基于生物學(xué)的分離方法在免疫磁珠富集分離方法問世之前,最常用的CTCs檢測方法是基于CTCs表面標(biāo)記物的流式細(xì)胞分選技術(shù) (FACS),然而流式細(xì)胞分選技術(shù)靈敏度低、假陽性高,成為CTCs后續(xù)分析的一大障礙。之后免疫磁珠富集分離法是根據(jù)CTCs和血細(xì)胞差異表達(dá)的蛋白標(biāo)志物進(jìn)行陽性富集和陰性富集。首先根據(jù)CTCs和血細(xì)胞在胚胎發(fā)育過程中來源于不同的胚層。CTCs來源內(nèi)胚層具有上皮樣特性,高表達(dá)表皮標(biāo)志物,如胞質(zhì)上皮細(xì)胞角蛋白家族 (cytokeratins,CKs)和上皮細(xì)胞黏附分子 (epithelial cell adhesion molecule,EpCAM),其中EpCAM在CTCs中特異性高表達(dá)而在血細(xì)胞中不表達(dá),能夠有效地將完整的CTCs從血細(xì)胞中分離出來?；谶@一原理將抗EpCAM抗體偶聯(lián)到磁珠上,在磁場力的作用下將EpCAM高表達(dá)的CTCs從血細(xì)胞中分離出來。2004年研發(fā)的CellSearch system (Veridex)運(yùn)用這一原理富集晚期乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌患者外周血中的CTCs,然后用CK8、CK18、CK19的混合抗體進(jìn)行熒光染色鑒定,同時(shí)對僅在白細(xì)胞中高表達(dá)的CD45熒光染色,排除白細(xì)胞對CTCs判定的干擾。但CellSearch system (Veridex)檢測到CTCs的數(shù)量極少,最近基于陽性選擇而研發(fā)的MagSweeper[5],IsoFlux[6],VerIFAST[7]這3項(xiàng)技術(shù)極大地提高了CTCs的檢測速度和效率。

美國麻省總院Toner教授等聯(lián)合CTCs的生物學(xué)特性和物理學(xué)特性建立一個(gè)微流控裝置平臺CTC-chip,如抗原依賴性的免疫磁珠分離的Herringbone-chip[8]。然而,大量的研究證明腫瘤在發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的過程中會(huì)發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (epithelial mesenchymal-transition,EMT),即上皮樣標(biāo)志物如EpCAM、E-cadherin的下調(diào),N-cadherin的上調(diào)?；贓pCAM的富集方法在檢測CTCs可能存在細(xì)胞群體的限制,所以還有學(xué)者用器官特異性的細(xì)胞表面標(biāo)志物或干細(xì)胞標(biāo)志物來富集CTCs,如在乳腺癌中,除了通用的EpCAM,常用的標(biāo)記物還有CK19、HER2、ER、PR和MUC1等,前列腺癌的標(biāo)志物有AR、EGR和PTEN。肝細(xì)胞癌的常用標(biāo)記物有Cytokeratins、EpCAM、ASGPR1、N-cadherin、Vimentin、Gpc3、AFP和albumin等[9]。此外,Toner組根據(jù)流體確定的側(cè)向位移,慣性聚焦和磁導(dǎo)入研發(fā)的CTC-iChip[10],可直接從全血中分離出具有活性的CTCs,回收效率較CellSearch system (Veridex)由1/107顯著提高到1/105。最近,這個(gè)研究團(tuán)隊(duì)又研發(fā)出用于分離CTCs團(tuán)簇的的微流控裝置[11]。對于CTCs的富集分離不僅吸引生物學(xué)家和物理學(xué)家的興趣,同時(shí)材料科學(xué)家也積極參與CTCs富集分離的研究中。值得一提的是Tseng HR課題組研發(fā)的系列NanoVelcro chips,可通過改變反應(yīng)溫度收集芯片中捕獲的CTCs[12]。

基于物理學(xué)的富集分離的方法依據(jù)CTCs不同于血細(xì)胞的物理特性如細(xì)胞大小[13]、密度、形變性[14]及載電量進(jìn)行富集分離。

Vona等[15]根據(jù)HepG2、Hep3B、MCF7、HeLa和LNCaP的大小參數(shù)設(shè)計(jì)了ISET (isolation by size of epithelial tumor cells),可對1 mL全血中的CTCs進(jìn)行計(jì)數(shù),免疫形態(tài)學(xué)鑒定和分子表征的分析。根據(jù)腫瘤細(xì)胞與白細(xì)胞的密度差異,可進(jìn)行密度梯度離心法進(jìn)行分離,主要用試劑盒OncoQuick plus和Ficoll。這兩種方法要求的血量比較大,一般需要15～30 mL,CTC團(tuán)簇在該方法中可能沉降入紅細(xì)胞層而丟失。物理學(xué)方法分離獲得的CTCs通常會(huì)存在較大的白細(xì)胞污染,直接影響對CTCs的分子生物學(xué)特性的分析。

富集分離之后的CTCs的鑒定方法主要根據(jù)腫瘤細(xì)胞基因組的異倍性、轉(zhuǎn)錄組的特異性及標(biāo)志性的蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行最終確定。經(jīng)典的方法集中在染色體的比較基因組雜交 (comparative genomic hybrid,CGH)/DNA或RNA熒光原位雜交 (fluorescenceinsituhybridization,FISH)、實(shí)時(shí)定量PCR (Real-time PCR,RT-PCR),以及CTCs在蛋白質(zhì)水平通過免疫熒光進(jìn)行亞群的分子分型。目前比較成熟的體外CTC富集檢測系統(tǒng)有CellSearch?system、MagSweeperTM、EPHESIA CTC-chip、CTC-chip、Velcro-like device;體內(nèi)CTC富集系統(tǒng)有CellCollector?、Photoacoustic和Nanodetector。

CTCs的臨床應(yīng)用及其潛在應(yīng)用價(jià)值2004年,經(jīng)美國FDA認(rèn)證的CellSearch system (Veridex)系統(tǒng)對轉(zhuǎn)移性乳腺癌[16]、前列腺癌[17]和結(jié)直腸癌[18]患者7.5 mL血樣中進(jìn)行CTCs檢測計(jì)數(shù),并與患者預(yù)后作相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)治療之前的CTCs可作為預(yù)測患者預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。此后,在小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肝癌和肝膽管癌中[19-22],以CellSearch system (Veridex)系統(tǒng)為平臺檢測治療前CTCs數(shù)目并分析與患者的預(yù)后相關(guān)性,進(jìn)一步證明CTCs可作為腫瘤預(yù)測患者預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。同時(shí),對外周血單核細(xì)胞通過RT-PCR分析CTCs特異性的EpCAM[23]、Snail[24]的mRNA表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),EpCAM或Snail的mRNA豐度也可以作為預(yù)測肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。同時(shí)作為患者預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志的血清蛋白標(biāo)志物和CTCs之間是否具有相關(guān)性呢？在前列腺癌中發(fā)現(xiàn),基線CTCs數(shù)目與腫瘤大小,常規(guī)的血清蛋白質(zhì)標(biāo)志物如PSA沒有明顯的相關(guān)性[25-26]。在患者體內(nèi),CTCs不斷從原發(fā)病灶或者是轉(zhuǎn)移病灶進(jìn)入血液循環(huán)[27],所以CTCs的數(shù)目存在時(shí)空的異質(zhì)性。目前,CTCs的數(shù)目被認(rèn)為在治療期間的變化有可能作為評判治療效果的指標(biāo)。Bidard等[28]開展關(guān)于CTCs在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者臨床應(yīng)用中的有效性的多中心研究再次證實(shí)治療前CTCs大于5的患者比小于5的患者具有更短的無進(jìn)展生存期和總體生存期,開展治療后,對患者CTCs實(shí)時(shí)監(jiān)測,相較于治療前的CTCs數(shù)目,在3～5周時(shí)CTCs數(shù)目增加的患者比6～8周CTCs數(shù)目增加的患者的預(yù)后要差,而同一時(shí)間點(diǎn)癌胚抗原和腫瘤抗原濃度變化與患者臨床預(yù)后的相關(guān)性不如CTCs數(shù)目的變化理想。綜上,CTCs數(shù)目的多少及其在治療中數(shù)目的k變化可用于判斷患者的預(yù)后生存情況和治療方案的有效性,但CTCs數(shù)目并不能精準(zhǔn)地指導(dǎo)治療方案的選擇,故在CTCs計(jì)數(shù)的臨床意義研究之后,科學(xué)家將研究方向轉(zhuǎn)向CTCs的生物學(xué)特性研究。

CTCs的生物學(xué)特性研究在CTC富集分離的技術(shù)日漸成熟后,隨著單細(xì)胞研究技術(shù)的不斷革新,關(guān)于CTC 的研究逐步由探尋某種實(shí)體瘤中CTC數(shù)目與患者預(yù)后的關(guān)系以及藥物療效的監(jiān)測方面轉(zhuǎn)向CTC的生物學(xué)特征與腫瘤轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞離開原發(fā)瘤,進(jìn)入血液循環(huán),成為單個(gè)細(xì)胞,失去細(xì)胞間相互作用而發(fā)生失巢凋亡。最近在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中發(fā)現(xiàn)抗凋亡蛋白BCL-2在CTCs中高表達(dá),但結(jié)果與預(yù)期相反,具有高表達(dá)BCL-2的CTCs的患者預(yù)后好[29],這一現(xiàn)象需要進(jìn)一步的研究結(jié)果來解釋。

現(xiàn)有的研究表明腫瘤具有極大的異質(zhì)性。在其發(fā)生發(fā)展過程中,腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)是腫瘤持續(xù)生長的主要原因。而EMT與腫瘤轉(zhuǎn)移緊密相關(guān),科學(xué)家大膽猜測并驗(yàn)證原發(fā)瘤來源的CTCs是一個(gè)異質(zhì)性極高的群體,該群體中可能包含不同表型的亞群。不同亞群的CTCs可能具有不同的生物學(xué)特征,如EMT樣CTCs、CSCs樣CTCs和轉(zhuǎn)移起始細(xì)胞(metastasis initiate cells,MIC)樣CTCs。器官靶向性轉(zhuǎn)移的CTCs和耐藥相關(guān)CTCs直接與腫瘤轉(zhuǎn)移及耐藥相關(guān)。

2012年,關(guān)于胰腺癌的研究發(fā)現(xiàn),在胰腺原位癌形成之前,腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT進(jìn)入血液循環(huán),定植在肝臟中,最終形成轉(zhuǎn)移灶[30],說明EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用。對EMT的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),間質(zhì)型的腫瘤細(xì)胞容易進(jìn)入血管但是不易發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[31-32],大家逐漸認(rèn)為介于上皮性和間質(zhì)型的腫瘤細(xì)胞可能具有腫瘤干細(xì)胞樣的特征[33]。那么,是否可以根據(jù)E型或M型標(biāo)記物來鑒定CTCs亞群呢？2013年Yu等[34]對11個(gè)乳腺癌患者CTCs進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)很少有細(xì)胞同時(shí)表達(dá)E-M型,在跟蹤一例患者治療過程中CTC表型的動(dòng)態(tài)變化時(shí),發(fā)現(xiàn)E-M表型的比例隨著患者疾病狀態(tài)發(fā)生改變。其中間質(zhì)型CTCs在患者疾病進(jìn)展期比例明顯增高,在間質(zhì)細(xì)胞團(tuán)簇中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的TGF-β,血小板分泌TGF-β促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向間質(zhì)型轉(zhuǎn)變,而血小板在腫瘤的著床黏附的過程中發(fā)揮重要的作用; 這提示在腫瘤進(jìn)展中M-型的CTCs可作為耐藥標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)。Baccelli等[35]發(fā)現(xiàn)在與乳腺癌患者預(yù)后更具相關(guān)性的是EpCAM+CD44+CD47+MET+CTCs,而不是所有的EpCAM+CTCs,同時(shí)在小鼠模型中證實(shí)EpCAM+CD44+CD47+MET+CTCs具有更強(qiáng)的腫瘤形成能力和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移能力。前期研究表明,腫瘤的轉(zhuǎn)移具有器官偏好性,CTCs的分群將來可用于轉(zhuǎn)移病灶的確定。2013年,Zhang[36]從乳腺癌患者的CTCs中鑒定出EpCAM-HER2+/EGFR+/HPSE+/Notch1+CTCs具有特異性腦部轉(zhuǎn)移。2015年,在結(jié)直腸癌中,發(fā)現(xiàn)CD110+的腸癌干細(xì)胞有非常強(qiáng)的靶向轉(zhuǎn)移到肝臟的潛能[37]。

在CTC的基因水平上,對轉(zhuǎn)移性前列腺癌的CTCs進(jìn)行全外顯子測序發(fā)現(xiàn)CTCs中僅70%的突變發(fā)生在原發(fā)瘤和淋巴轉(zhuǎn)移樣本,而在CTCs中可發(fā)現(xiàn)原發(fā)瘤和淋巴轉(zhuǎn)移樣本中90%的驅(qū)動(dòng)突變和轉(zhuǎn)移相關(guān)突變,提示CTCs可能作為新的治療靶點(diǎn)[38]。同年Yu等[39]在乳腺癌中也發(fā)現(xiàn)CTCs比原發(fā)腫瘤具有更多的新增突變,根據(jù)突變結(jié)果進(jìn)行藥物敏感測試發(fā)現(xiàn),CTCs細(xì)胞系的藥物敏感程度與患者一致,不同的突變特征對同一治療方案的敏感程度不同,提示CTCs的基因突變信息可指導(dǎo)腫瘤患者的治療方案的選擇。在非小細(xì)胞肺癌和轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中均發(fā)現(xiàn)CTCs的突變位點(diǎn)能夠很大程度上覆蓋原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移病灶的突變。

根據(jù)患者CTCs的DNA信息可以指導(dǎo)精準(zhǔn)醫(yī)療,那么根據(jù)RNA的信息是否能起到相同的作用?2012年在小鼠胰腺癌模型的外周血CTCs中發(fā)現(xiàn)Wnt2高表達(dá),抑制細(xì)胞的失巢凋亡,促進(jìn)細(xì)胞的非依賴性增長[40]。最近Miyamoto等[41]通過對前列腺癌患者CTCs單細(xì)胞RNA測序發(fā)現(xiàn),Wnt5a異常高表達(dá)減弱了AR抑制劑的抗增殖效應(yīng),從而引發(fā)AR陽性細(xì)胞耐藥,導(dǎo)致患者治療失敗。

結(jié)語綜上,相較于常規(guī)的腫瘤診斷途徑包括組織病理學(xué)分析和高分辨率在體成像技術(shù),CTCs的檢測可無創(chuàng)取樣,并可實(shí)時(shí)監(jiān)測患者病情。目前除了對CTCs的檢測技術(shù)和生物學(xué)特性的研究外,還有體外創(chuàng)建CTCs細(xì)胞系[42],利用CTCs來源的小鼠腫瘤模型和類器官模型[43]進(jìn)行藥物敏感性的預(yù)臨床試驗(yàn)和藥物敏感性分析[44]的探索。對CTCs的檢測與生物學(xué)特性的分析將有助于腫瘤患者早期轉(zhuǎn)移的診斷、輔助精確臨床分期、實(shí)時(shí)監(jiān)測術(shù)后患者腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移、評估預(yù)后及合理地選擇個(gè)體化的治療策略。

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The biological characteristics and significance of circulating tumor cells in patients with solid malignancies

ZHANG Kai-li2,GAO Xiao-mei2,QIN Lun-xiu1,2,3△

(1DepartmentofGeneralSurgery,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China;2CancerMetastasisInstitute,FudanUniversity,Shanghai200040,China；3InstituteofBiomedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

【Abstract】Circulating tumor cells (CTCs) are necessary for tumor recurrence and distal metastasis.With the development and progress in the detection technologies of CTCs,more and more attentions have been focused on the biological characteristics and their potential clinical application of CTCs.Cumulating evidence suggests that CTCs are closely related to the prognosis of cancer patients,and may be used in personized cancer treatment.

【Key words】circulating tumor cell;tumor metastasis;cancer therapy

【中圖分類號】R 730

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.01.017

(收稿日期:2015-11-06;編輯:張秀峰)

△Corresponding authorE-mail:qinlx@fudan.edu.cn