于紫燕，王春霞，孫琦，趙江月，張勁松

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科，遼寧省晶狀體學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110005）

3種小鼠晶狀體組織石蠟切片固定液的比較

于紫燕，王春霞，孫琦，趙江月，張勁松

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科，遼寧省晶狀體學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110005）

目的比較3種固定液對(duì)小鼠晶狀體組織石蠟切片的影響，優(yōu)化小鼠晶狀體組織石蠟切片固定方法。方法選取3種常用固定液（改良Davison’s固定液、傳統(tǒng)Davison’s固定液和10%中性甲醛固定液），固定小鼠晶狀體組織，并制成石蠟切片，經(jīng)HE染色后在顯微鏡下觀察。結(jié)果傳統(tǒng)Davison’s固定液固定的晶狀體組織切片無(wú)碎裂，改良Davison’s固定液固定的晶狀體組織中央?yún)^(qū)碎裂。改良Davison’s固定液和傳統(tǒng)Davison’s固定液固定的小鼠眼球外形均無(wú)明顯變形和收縮，未見(jiàn)明顯的視網(wǎng)膜脫離，鏡下視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)完整清晰，各層細(xì)胞排列緊密，無(wú)明顯裂隙，染色鮮艷。采用10%中性甲醛固定液固定的小鼠眼球壁組織發(fā)生嚴(yán)重皺縮，晶狀體組織皺縮，空隙和空泡形成。結(jié)論傳統(tǒng)Davison’s固定液固定的小鼠眼球晶狀體組織石蠟切片質(zhì)量效果優(yōu)于改良Davison’s固定液和10%中性甲醛固定液。

小鼠眼球；石蠟切片；固定液；晶狀體

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小鼠晶狀體由晶狀體囊、晶狀體上皮、晶狀體纖維和懸韌帶組成，各結(jié)構(gòu)軟硬度不同。在小鼠晶狀體的石蠟切片標(biāo)本制作過(guò)程中極易發(fā)生組織碎裂、細(xì)胞變形、組織皺縮以及脫水不完全，甚至出現(xiàn)裂隙、空泡，導(dǎo)致晶狀體石蠟切片質(zhì)量欠佳，不利于后期的組織學(xué)研究［1］。小鼠及胚鼠眼球組織體積小，傳統(tǒng)“開(kāi)窗”方法不適用，人為操作易引起眼內(nèi)結(jié)構(gòu)破壞。由于眼球組織結(jié)構(gòu)的特殊性，在石蠟切片制作過(guò)程中，需要選擇合適的固定液并做特殊處理。因此，本研究選擇了3種不同的固定液，對(duì)比觀察其對(duì)小鼠眼球晶狀體組織石蠟切片質(zhì)量的影響，旨在尋找合適種類的固定液，以提高小鼠眼球晶狀體標(biāo)本的切片質(zhì)量。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

健康C57BL/6 SPF級(jí)21日齡（P21）小鼠6只（12個(gè)眼球），由美國(guó)南加州大學(xué)Doheny眼科研究所提供，常規(guī)處死。

1.2固定液配制及固定方法

1.2.13種固定液：（1）傳統(tǒng)Davison’s固定液（A）由2%甲醛，35%無(wú)水乙醇，10%冰乙酸，53%蒸餾水按比例配制。（2）改良Davison’s固定液（B）由30%甲醛，15%無(wú)水乙醇，5%冰乙酸，50%蒸餾水按比例配制。（3）10%中性甲醛固定液（C）。

1.2.2固定方法：取C57BL/6背景P21小鼠眼球，保留約1 mm視神經(jīng)，生理鹽水清洗后，立刻分別投入3種固定液中，每種固定液各4個(gè)小鼠眼球標(biāo)本。室溫下充分固定1 h，置換同類固定液室溫固定23 h，置入70%乙醇中保存。

1.2.3組織脫水及透明：用70%、80%、95%乙醇Ⅰ，95%乙醇Ⅱ，95%乙醇Ⅲ，無(wú)水乙醇Ⅰ，無(wú)水乙醇Ⅱ各1 h行組織乙醇脫水。二甲苯Ⅰ及二甲苯Ⅱ各1 h透明。浸蠟65℃2 h。

1.3包埋與切片

1.3.1包埋：將小鼠眼球標(biāo)本轉(zhuǎn)移到預(yù)熱的包埋框中，按照眼球前后徑方向調(diào)整位置，放底板，倒入適量熔蠟，室溫放置，使石蠟?zāi)獭?/p>

1.3.2切片：用石蠟切片機(jī)切取石蠟切片，厚度為5μm，室溫干燥過(guò)夜。

1.4HE染色

蘇木精5 min，水洗去浮色；1%鹽酸乙醇分色；伊紅5 min。用70%、80%、95%乙醇，100%乙醇Ⅰ，100%乙醇Ⅱ進(jìn)行梯度脫水各1min。二甲苯Ⅰ及二甲苯Ⅱ各5 min，封片，顯微鏡下觀察。

2　結(jié)果

2.13種固定液固定后的小鼠眼球標(biāo)本大體觀察

肉眼觀察：12個(gè)小鼠眼球標(biāo)本經(jīng)過(guò)固定后，A組和B組外觀和顏色均無(wú)明顯變化，能保持原有的形態(tài)，無(wú)皺縮和凹陷；C組外觀和顏色無(wú)明顯變化，眼球局部皺縮凹陷變形。

2.23種固定液處理后小鼠眼球晶狀體組織石蠟切片HE染色結(jié)果

3種固定方法制備的小鼠晶狀體組織石蠟切片標(biāo)本進(jìn)行HE染色后，差異如下：A組標(biāo)本鏡下見(jiàn)眼內(nèi)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)正常，晶狀體組織結(jié)構(gòu)完整清晰，中央?yún)^(qū)無(wú)破碎，細(xì)胞排列整齊有序，對(duì)比度好，染色鮮艷（圖1A）。B組標(biāo)本鏡下見(jiàn)眼內(nèi)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)正常，晶狀體組織結(jié)構(gòu)基本完整清晰，中央?yún)^(qū)有不同程度破碎、脫片、染色不連續(xù)（圖1B）。A組標(biāo)本和B組標(biāo)本視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)均精細(xì)清晰、細(xì)胞排列緊密整齊，視網(wǎng)膜細(xì)胞和各層核膜清晰，細(xì)胞無(wú)收縮、膨脹、自溶（圖1A、1B）。C組標(biāo)本鏡下見(jiàn)晶狀體和視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)基本完整，染色鮮艷，但晶狀體中央?yún)^(qū)內(nèi)出現(xiàn)組織破裂，細(xì)胞可見(jiàn)收縮變形以及排列亂序，眼球壁出現(xiàn)皺縮，視網(wǎng)膜組織可見(jiàn)脫落、變薄，視網(wǎng)膜細(xì)胞，尤其是視錐細(xì)胞、視桿細(xì)胞和雙極細(xì)胞皺縮明顯，各層細(xì)胞不清晰（圖1C、1D）。

圖1　不同固定液固定的小鼠眼球石蠟切片HE染色Fig.1　HE staining of mice eyeball tissues fixed with three different fixatives

3　討論

影響石蠟組織切片質(zhì)量的因素很多，固定液是關(guān)鍵的影響因素之一［2］?；瘜W(xué)成分的滲透力、pH值、固定時(shí)間等諸多因素都可影響固定效果［3］。在晶狀體發(fā)育生物學(xué)研究中需要觀察晶狀體、視網(wǎng)膜及眼內(nèi)其他組織形態(tài)學(xué)變化，而小鼠晶狀體組織包括晶狀體囊膜、皮質(zhì)和核3種結(jié)構(gòu)，各結(jié)構(gòu)硬度不同，對(duì)不同固定液反應(yīng)不同，組織間相互作用能導(dǎo)致晶狀體組織切片破碎，甚至脫片。因此，在針對(duì)小鼠眼球進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究中，需要一種能夠取得較好固定效果的固定液，而且固定液和固定時(shí)間的選擇尤為重要［4］。

10%中性甲醛對(duì)大多數(shù)抗原保存較好，是免疫組織化學(xué)最常用的固定液，10%中性甲醛溶液具有滲透性較強(qiáng)，固定均勻，收縮性小，利于組織硬化、保持彈性等優(yōu)點(diǎn)［5］。但傳統(tǒng)的10%中性甲醛含有較多磷酸鹽，滲透壓較高，經(jīng)乙醇脫水后收縮較大，眼內(nèi)外各組織所受壓力不同，容易引起眼球變形。由于眼球組織的特殊結(jié)構(gòu)，10%中性甲醛固定液很難有效、快速地滲透入堅(jiān)硬的晶狀體組織內(nèi)部，導(dǎo)致晶狀體組織固定不佳，出現(xiàn)碎片或脫片。10%中性甲醛固定液作為晶狀體石蠟切片標(biāo)本固定液，效果并不理想，因此，為了獲得適應(yīng)組織學(xué)和多種免疫組化要求的小鼠眼球標(biāo)本，需要優(yōu)選1種可保持眼內(nèi)組織結(jié)構(gòu)完整及較好的抗原免疫原性的固定方法［6?7］。

Davidson’s固定液中加入了冰乙酸，能快速地滲透入堅(jiān)硬的晶狀體組織，加快晶狀體組織固定的速度，固定效果更好［8］。冰醋酸對(duì)組織有膨脹作用，甲醛對(duì)組織有收縮作用［8］，2種試劑混合使用，可以相互作用，避免組織膨脹和收縮。乙醇也可用于固定組織，有收縮和硬化組織的作用，濃度越大，組織收縮硬化作用越明顯［9?10］，75%的乙醇比95%的乙醇能更好地抵消冰醋酸對(duì)組織的膨脹。所以，傳統(tǒng)的Davidson’s固定液乙醇和冰乙酸濃度高，甲醛濃度低［11］，晶狀體軟化效果好，小鼠晶狀體組織固定效果好；改良的Davidson’s固定液能使眼球鞏膜軟化，易于脫水、浸蠟和切片，降低視網(wǎng)膜與球壁分離的概率［12?13］，固定小鼠視網(wǎng)膜標(biāo)本效果好。

綜上所述，改良的和傳統(tǒng)的Davidson’s固定液都是優(yōu)良的小鼠眼球標(biāo)本石蠟切片固定液，固定效果優(yōu)于10%中性甲醛。傳統(tǒng)Davison’s固定液對(duì)小鼠眼球晶狀體組織軟化及固定效果好，改良的Da?vidson’s能降低小鼠視網(wǎng)膜與球壁分離的概率，對(duì)小鼠視網(wǎng)膜標(biāo)本固定效果好。因此，傳統(tǒng)Davison’s固定液是小鼠晶狀體組織的首選固定液，而改良Davison’s固定液是小鼠眼球視網(wǎng)膜組織的首選固定液。

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（編輯王又冬）

Comparison of Fixation Effects of Three Different Complex Fixatives on Mouse Lens Tissue

YU Ziyan，WANG Chunxia，SUN Qi，ZHAO Jiangyue，ZHANG Jinsong
（Department of Ophthalmology，The Fourth Affiliated Hospital，China Medical University，Lens Science Research Key Laboratory of Liaoning Province，Shenyang 110005，China）

ObjectiveTo compare the effects of three kinds of fixative solutions on paraffin section of mouse lens tissue and optimize the fixing?method of paraffin section in mouse lens tissue.MethodsThree kinds of conventional fixatives were selected for the test，including the conven?tional Davison’s solution，modified Davison’s solution and 10%neutral buffered formalin.Mice eyeball tissues were fixed with three different fixa?tives，embedded，sliced and then stained with HE method.The paraffin slices were observed under the light microscope.ResultsThe structures of lens and retina fixed in conventional Davison’s fixative solutions were clear and intact，and the cells were arranged regularly and compactly. There was no eyeball distortion，contraction and retinal detachment in the eyeballs fixed in modified and conventional Davison’s fixative solution. However，the ones fixed in 10%neutral buffered formalin showed eyeball distortion and contraction，space and spherules.ConclusionThe mice lens slides made from tissues fixed by conventional Davison’s fixative solution are better than fixed by modified Davison’s fixative solution and the 10%neutral buffered formalin fixed ones.

mouse eyeball；paraffin slice；fixative solution；lens

R36

B

0258-4646（2016）12-1063-03

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.12.002

遼寧省自然科學(xué)基金（201602872）；沈陽(yáng)市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（F13?318?1?09）

于紫燕（1981-），女，主治醫(yī)師，博士.

趙江月，E-mail：zhaojiangyue@hotmail.com

2016-04-27

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