吳晶洋，白艷潔，王稚英

（1.錦州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院口腔種植中心，遼寧 錦州 121001；2.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院集團撫順醫(yī)院口腔科，遼寧 撫順113000）

富血小板纖維蛋白和濃縮生長因子對施萬細胞影響的比較

吳晶洋1，2，白艷潔2，王稚英1

（1.錦州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院口腔種植中心，遼寧 錦州 121001；2.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院集團撫順醫(yī)院口腔科，遼寧 撫順113000）

目的以施萬細胞作為周圍神經模型，比較富血小板纖維蛋白（PRF）與濃縮生長因子（CGF）對其的影響。方法隨機選取18～55歲身體健康志愿者10人，無菌條件下采集靜脈血10 mL，制備PRF和CGF。將細胞隨機分為對照組、PRF組和CGF組。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)；MTT比色法測定細胞增殖能力；酶聯免疫吸附法檢測細胞上清液中神經生長因子的分泌量；流式細胞儀檢測細胞周期。結果倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)無明顯差異；MTT結果顯示PRF組和CGF組與對照組相比光密度值明顯升高（P＜0.05），細胞上清液中神經生長因子分泌量均明顯升高（P＜0.05），處于S+G2M期的細胞數明顯增多（P＜0.01），而PRF組與CGF組相比各項指標的差異無統計學意義。結論PRF和CGF均可以促進施萬細胞增殖并增加神經生長因子的分泌量，但就改善細胞增殖能力、促進神經生長因子分泌來看，二者無明顯差異。

富血小板纖維蛋白；濃縮生長因子；施萬細胞；神經生長因子；細胞周期

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口腔種植技術正處于飛速發(fā)展與日益完善的黃金時期，越來越多的牙齒缺失患者放棄了傳統鑲牙而選擇口腔種植修復，后者無論是在美觀還是實用性上與傳統鑲牙相比都有較大優(yōu)勢。牙周膜組織中含有大量魯菲尼小體，它們是天然牙的機械感受器，對于牙齒缺失的患者來說，牙周膜組織也遭到了不同程度的破壞，這導致了種植體對機械刺激的感受閾值要比天然牙高出許多倍，當種植體所受外力較大時就會造成其周圍骨吸收，最終導致種植失敗，如何刺激種植體周圍神經再生以達到保護種植體免受過度受力所造成的損傷成為解決這一問題的關鍵［1］。

施萬細胞是神經嵴的衍生物，形成了周圍神經髓磷脂軸突的髓鞘。每個施萬細胞包繞在一個軸突上，沿著軸突節(jié)形成一層髓磷脂髓鞘，當一個軸突死亡時，環(huán)繞在其周圍的多個施萬細胞與其基底膜管一起形成一個生長通道，在其尾端形成新的軸突。許多研究［2］證明，施萬細胞在周圍神經的形成、分化和再生等方面扮演了非常重要的角色。富血小板纖維蛋白（platelet rich fibrin，PRF）和濃縮生長因子（concentrated growth factor，CGF）屬于第2代血漿制品，它們在繼承了第1代血漿濃縮物富血小板血漿優(yōu)點的基礎上，還表現出了許多令人欣喜的特點。進入21世紀，國內外開始研究PRF在創(chuàng)傷外科、美容外科、口腔種植科以及顱頜面外科等多個醫(yī)療再生領域的治療效果。實驗［3］證實PRF可以促進成骨細胞的增殖及分化，加速骨組織愈合，減輕周圍組織的炎性反應。研究［4］證明，CGF具有改善并增強組織再生的獨特性質，有利于所有再生組織的恢復，是再生醫(yī)療領域中組織刺激的新技術。近年來CGF對于神經細胞的作用受到廣泛關注。本研究將PRF和CGF作用于施萬細胞，比較PRF和CGF對施萬細胞的影響，為臨床在種植窩預備中下齒槽神經損傷時加快受損傷的神經恢復功能提供思路。

1　材料與方法

1.1細胞、試劑及儀器

施萬細胞、施萬細胞培養(yǎng)基購自上海中禾新舟生物科技有限公司；多聚?L?賴氨酸購自上海士鋒生物科技有限公司；MTT細胞增殖檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；人神經生長因子ELI?SA試劑盒購自上海邦奕生物科技有限公司；Annex?in V?FITC流式檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；胰蛋白酶購自美國Sigma公司；流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；DNM?9602G型酶標分析儀購自北京普朗新技術有限公司；Medifuge離心機購自意大利Silfradent公司；倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司；高速離心機購自德國Ep?pendorf公司。

1.2細胞培養(yǎng)

在T?75培養(yǎng)瓶中加入10 mL三蒸水和15 μL的聚?L?賴氨酸，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜。24 h后用三蒸水沖洗包被了聚?L?賴氨酸的培養(yǎng)瓶2次，加入15 mL施萬細胞培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基，將施萬細胞凍存管置于37℃水浴箱中，輕輕旋轉凍存管至內容物完全溶解后，迅速將凍存管中的液體移入聚?L?賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選取對數生長期細胞，換用無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，待細胞生長周期同步化后進行實驗。

1.3PRF和CGF的制備

1.3.1PRF的制備：血液采集自10名健康志愿者，告知實驗內容并取得同意后，一次性采集10 mL靜脈血置于無添加抗凝劑的真空離心管中，立即放入數字離心機中3 000 r/min離心10 min后，可見血液分為3層，由上到下依次為無細胞血漿層、PRF凝塊、紅細胞層。在超凈工作臺中，將PRF凝塊放入無菌離心管中，-80℃冰凍1 h，4℃解凍后230g離心10 min，加入5 mL施萬細胞培養(yǎng)基，37℃孵育24 h后3 000 r/min離心5min，取上清5 mL即為PRF，0.22 μm濾器過濾后加入5 mL施萬細胞培養(yǎng)基，得到10 mL含PRF的培養(yǎng)液［5］。

1.3.2CGF的制備：血液采集自10名健康志愿者，告知實驗內容并取得同意后，一次性采集10 mL靜脈血置于無添加抗凝劑的真空離心管中，立即放入Medifuge離心機中，設定制備CGF程序，離心10 min后可見血液分為3層，由上到下依次為無細胞血漿層、CGF纖維蛋白層、紅細胞層。在超凈工作臺中，將CGF凝塊放入無菌離心管中，-80℃冰凍1 h，4℃解凍后230g離心10 min，加入5 mL施萬細胞培養(yǎng)基，37℃孵育24 h后400g離心5 min，取上清5 mL即為CGF，0.22 μm濾器過濾后加入5 mL施萬細胞培養(yǎng)基，得到10 mL含CGF的培養(yǎng)液［6］。

1.4實驗分組

對照組：用施萬細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)；PRF組：用含PRF的施萬細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)；CGF組：用含CGF的施萬細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.5倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)

將施萬細胞以上述方法吹打收集制成單細胞懸液，并以1×106/孔的密度接種于6孔板中，根據各組要求，分別加入相應的培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h后，置于倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)。

1.6MTT法檢測細胞增殖率

用施萬細胞培養(yǎng)基將施萬細胞制成單細胞懸液，調整細胞密度，按照5×104/孔將細胞接種到96孔板中，每孔體積100 μL，培養(yǎng)板的邊緣孔加入等量無水PBS，設置空白對照孔。將96孔板置于恒溫37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后去除舊的培養(yǎng)液，按照實驗分組，每孔更換對應培養(yǎng)液100μL置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，各組細胞處理結束前4 h每孔加入5 mg/mL的MTT 10 μL，水平搖床上低速混勻1 min繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸掉培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，搖床上避光振蕩10 min。用酶標分析儀檢測570 nm波長處各組細胞的吸光度［7］。

1.7酶聯免疫吸附法檢測細胞上清液中神經生長因子的分泌量

將施萬細胞以上述方法吹打收集制成單細胞懸液，并以1×106/孔的密度接種于6孔板中，根據各組要求，分別加入相應的培養(yǎng)基培養(yǎng)3和5 d后，吸取每孔細胞上清液，2 000g離心20 min，提取上清液，按照試劑盒說明書進行操作。以神經生長因子含量為縱坐標，450 nm處的光密度（optical density，OD）值為橫坐標，繪制標準品的標準曲線，根據標準曲線計算各組樣品中神經生長因子的含量［8］。

1.8流式細胞術分析細胞周期

將施萬細胞以上述方法吹打收集制成單細胞懸液，并以1×106/孔的密度接種于6孔板中，根據各組要求，分別加入相應的培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h后，按照試劑盒說明書進行操作，1 h內上流式細胞儀分析細胞DNA含量分布［9］。

1.9統計學分析

2　結果

2.1倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)

各組細胞貼壁緊密，突觸形成并相互連接，細胞生長狀態(tài)良好。各組間細胞形態(tài)無明顯差異。見圖1。

2.2MTT法檢測細胞增殖能力

圖1　相差顯微鏡下對照組、PRF組和CGF組的細胞形態(tài)學改變 ×400Fig.1　Cell morphology observed under inverted phase contrast microscope×400

與對照組相比，PRF組和CGF組的OD值在第1、3、5天均明顯升高（P＜0.05），PRF組和CGF組的OD值在第1、3、5天相比差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2　MTT法檢測不同時間段3組的細胞增殖情況Fig.2　Cell proliferation in 3 groups at different time points de?tected by MTT method

2.3酶聯免疫吸附法檢測細胞上清液中神經生長因子的分泌量

檢測標準品的OD值，得出回歸方程，將各實驗組的OD值代入回歸方程中。與對照組相比，PRF組和CGF組細胞上清液中的神經生長因子分泌量明顯升高（P＜0.05），PRF組與CGF組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3。

2.4流式細胞術分析細胞周期

與對照組相比，PRF組和CGF組處于S+G2M期的細胞明顯增多（P＜0.01），但PRF組與CGF組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖4。

3　討論

圖3　3 d和5 d時血清中3組的神經生長因子分泌情況Fig.3　Secretion of nerve growth factor in supernatant in 3 groups on 3 d and 5 d

周圍神經損傷后遠端髓鞘崩解，施萬細胞和軸突間的聯系消失，大量增殖的施萬細胞吞噬損傷末端的髓鞘碎片后形成細胞索，使軸突能夠沿其生長并分泌神經生長因子，誘導損傷的神經元分泌相應蛋白使軸突進一步延長；在此過程中施萬細胞包裹軸突形成髓鞘，傳遞神經沖動。由此可見，施萬細胞在周圍神經損傷后的修復過程中起著非常重要的作用［10］。

圖4　3組流式細胞檢測結果Fig.4　Cell cycle detected by flow cytometry in 3 groups

PRF屬于第2代血小板濃縮制品，制備過程簡單，含有大量的纖維蛋白原、高濃縮血小板及多種生長因子。PRF中的生長因子在其降解過程中逐步緩慢釋放，具有相對長效的特點。KUMAR等［11］的研究指出，PRF能夠明顯改善軟骨組織的愈合。還有報道［12］指出，PRF在兒童牙髓再生治療中發(fā)揮了很好的療效。CGF是由SACCO首先研發(fā)出來的，CGF的制備過程與PRF略有不同，CGF的生物學作用主要依賴其含有的各種生長因子與纖維蛋白原形成的纖維網狀支架。CGF與PRF的不同主要在于其變速制備過程中血小板α顆粒釋放出的各種生長因子。CGF可以促進施萬細胞的增殖以及神經生長因子的分泌［13］，HONDA等［14］的研究指出，CGF提取物可以促進成骨細胞的增殖和成熟。

本研究通過MTT檢測細胞增殖能力發(fā)現，PRF組和CGF組均可以提高施萬細胞的增殖能力，但2組間的差異不明顯。而用ELISA法檢測神經生長因子分泌量時，PRF組和CGF組細胞上清液中神經生長因子的分泌量均高于對照組，但2組間的差異不明顯。在流式細胞術檢測細胞周期的實驗中，PRF組和CGF組處于S+G2M期的細胞數較對照組明顯增多，但2組間的差異不明顯。

總之，PRF和CGF均可以促進施萬細胞增殖并增加神經生長因子的分泌量，但就改善細胞增殖能力、促進神經生長因子分泌來看，二者無明顯差異。

［1］YAN C，YE L，ZHEN J，et al.Neuroplasticity of edentulous patients with implant?supported full dentures［J］.Eur J Oral Sci，2008，116（5）：387-393.DOI：10.1111/j.1600?0722.2008.00557.x.

［2］QIN J，WANG L，ZHENG L，et al.Concentrated growth factor pro?motes Schwann cell migration partly through the integrin β1?mediat?ed activation of the focal adhesion kinase pathway［J］.Int J Mol Med，2016，37（5）：1363-1370.DOI：10.3892/ijmm.2016.2520.

［3］WOO SM，KIM WJ，LIM HS，et al.Combination of mineral trioxide aggregate and platelet?rich fibrin promotes the sdontoblastic differ?entiation and mineralization of human dental pulp cells via BMP/ Smad signaling pathway［J］.J Endod，2016，42（1）：82-88.DOI：10.1016/j.joen.2015.06.019.

［4］QIN J，WANG L，SUN Y，et al.Concentrated growth factor increases Schwann cell proliferation and neurotrophic factor secretion and pro?motes functional nerve recovery in vivo［J］.Int J Mol Med，2016，37（2）：493-500.DOI：10.3892/ijmm.2015.2438.

［5］MORASCHINI V，BARBOZA EDOS S.Use of platelet?rich fibrin membrane in the treatment of gingival recession：a systematic re?view and meta?analysis［J］.J Periodontol，2016，87（3）：281-290.DOI：10.1902/jop.2015.150420.

［6］DOGAN ?B，DEDE F?，BALLI U，et al.Concentrated growth factor in the treatment of adjacent multiple gingival recessions：a split?mouth randomized clinical trial［J］.J Clin Periodontol，2015，42（9）：868-875.DOI：10.1111/jcpe.12444.

［7］杜莉莉，呂潤瀟，楊曉漪，等.胎盤間充質干細胞低氧培養(yǎng)液對腸黏膜上皮細胞氧化應激損傷的保護作用［J］.中國醫(yī)科大學學報，2016，45（2）：131-135.DOI：10.12007/j.issn.0258?4646.2016. 02.008

［8］趙富生，武庚，武楊，等.瓦勒變性坐骨神經段對大鼠BMSCs向SCs分化的影響［J］.中國病理生理雜志，2014，30（11）：1946-1953.

［9］單廣夷，付成，陳昂，等.雷帕霉素對膀胱癌5637細胞增殖及細胞周期的影響［J］.中國醫(yī)科大學學報，2015，44（3）：230-233.

［10］CHWALEK K，DENING Y，HINUBER C，et al.Providing the right cues in nerve guidance conduits：biofunctionalization versus fiber profile to facilitate oriented neuronal outgrowth［J］.Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2016，61（1）：466-472.DOI：10.1016/j.msec. 2015.12.059.

［11］KUMAR YR，MOHANTY S，VERMA M，et al.Platelet?rich fibrin：the benefits［J］.Br J Oral Maxillofac Surg，2016，54（1）：57-61. DOI：10.1016/j.bjoms.2015.10.015.

［12］NAGAVENI NB，PATHAK S，POORNIMA P，et al.Revasculariza?tion induced maturogenesis of non?vital immature permanent tooth using platelet?rich?fibrin：a case report［J］.J Clin Pediatr Dent，2016，40（1）：26-30.DOI：10.17796/1053?4628?40.1.26.

［13］QIN J，WANG L，SUN Y，et al.Concentrated growth factor increas?es Schwann cell proliferation and neurotrophic factor secretion and promotes functional nerve recovery in vivo［J］.Int J Mol Med，2016，37（2）：493-500.DOI：10.3892/ijmm.2015.2438.

［14］HONDA H，TAMAI N，NAKA N，et al.Bone tissue engineering with bone marrow?derived stromal cells integrated with concentrat?ed growth factor in Rattus norvegicus calvaria defect model［J］.J Artif Organs，2013，16（3）：305-315.DOI：10.1007/s10047?013?0711?7.

（編輯陳姜）

Comparison of Effects of Platelet Rich Fibrin and Concentrated Growth Factor on Schwann Cells

WU Jingyang1，2，BAI Yanjie2，WANG Zhiying1
（1.Center of Dental Implant，The Second Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University，Jinzhou 121001，China；2.Department of Stomatology，Fushun Hospital，Shengjing Hospital Group of China Medical University，Fushun 113000，China）

ObjectiveTo compare the effects of platelet rich fibrin（PRF）and concentrated growth factors（CGF）using Schwann cells as a pe?ripheral nerve model.MethodsA total of 10 healthy volunteers aged 18 to 55 were randomly selected，and 10 mL venous blood was collected un?der aseptic conditions to prepare PRF and CGF.The cells were randomly divided into three groups，control group，PRF group and CGF group.The cell morphology was observed by inverted phase contrast microscope.The cell proliferation was analyzed by MTT assay.The secretion of nerve growth factor in supernatant was detected by enzyme?linked immunosorbent assay.Cell cycle was detected by flow cytometry.ResultsThere was no significant difference of the morphology of cells in each group as observed under inverted phase contrast microscope.MTT results showed that the absorbance values of PRF group and CGF group were significantly higher than those of the control group（P＜0.05）.The secretion of nerve growth factor in the supernatant were significantly increased（P＜0.05）.The number of cells in S+G2M phase was significantly increased（P＜0.01），but there was no significant difference between PRF group and CGF group.ConclusionBoth PRF and CGF can promote proliferation of Schwann cells and increased the amount of nerve growth factor secretion，but there is no significant difference between PRF and CGF in terms of improving cell proliferation and promoting nerve growth factor secretion.

platelet rich fibrin；concentrated growth factor；Schwann cells；nerve growth factor；cell cycle

R782.12

A

0258-4646（2016）12-1089-05

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.12.008

遼寧省科技廳優(yōu)秀人才培育項目（2014022025）

吳晶洋（1983-）女，碩士研究生.

王稚英，E-mail：bdwzy@126.com

2016-04-15

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