鄭保婷 田勝慧 柯軍 廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所 （廣州 510663）

關(guān)節(jié)軟骨再生支架的生物相容性探討

鄭保婷 田勝慧 柯軍 廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所 （廣州 510663）

目的：研究復(fù)合支架材料——關(guān)節(jié)軟骨再生支架的生物安全性。方法：采用細(xì)胞毒性、皮膚致敏性、皮內(nèi)反應(yīng)、急性全身毒性、溶血、遺傳毒性、植入試驗(yàn)和亞慢毒性試驗(yàn)對(duì)復(fù)合材料制備的關(guān)節(jié)軟骨支架樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：關(guān)節(jié)軟骨再生支架在細(xì)胞毒性、皮膚致敏性、皮內(nèi)反應(yīng)、急性全身毒性、溶血、遺傳毒性、植入試驗(yàn)和亞慢毒性試驗(yàn)均符合規(guī)定。結(jié)論：復(fù)合材料制備的關(guān)節(jié)軟骨再生支架樣品具有良好的生物安全性。

關(guān)節(jié)軟骨再生支架 生物安全性 毒理學(xué)試驗(yàn)

廣東省醫(yī)療產(chǎn)品

生物安全評(píng)價(jià)

科技服務(wù)平臺(tái)

（2012B011000003）

0.引言

一直以來(lái)，人體關(guān)節(jié)軟骨損傷及缺損后的修復(fù)是運(yùn)動(dòng)臨床康復(fù)及醫(yī)學(xué)臨床康復(fù)重要的研究課題。關(guān)節(jié)軟骨缺少血管、淋巴管及神經(jīng)，其再生能力有限，一經(jīng)損害再生十分困難。因此，組織工程軟骨修復(fù)軟骨損傷是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)方向之一。組織工程支架材料的目的是為構(gòu)建組織細(xì)胞提供一個(gè)三維支架，有利于細(xì)胞的黏附、增殖乃至分化，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供合適的外環(huán)境[1]。理想支架材料必須具備良好的生物相容性：無(wú)毒性、無(wú)刺激性、有利于種子細(xì)胞黏附、增殖，降解產(chǎn)物對(duì)機(jī)體不產(chǎn)生任何影響。目前常用的支架材料按其來(lái)源可分為天然生物材料、人工合成高分子材料和復(fù)合材料。其中，復(fù)合支架是兩種或兩種以上具有互補(bǔ)特征的生物相容性可降解材料，按一定比例和方式組合，可設(shè)計(jì)出結(jié)構(gòu)與性能優(yōu)化的三維材料，因其解決了生物材料疏水性、相容性差，影響軟骨細(xì)胞增殖和細(xì)胞的黏附性等問(wèn)題，而得到廣泛應(yīng)用，具有廣闊的市場(chǎng)前景[2～3]。復(fù)合支架使生物材料具有互補(bǔ)特性，一定程度上滿足了理想生物材料支架應(yīng)具有的綜合特點(diǎn)，但不同材料的復(fù)合比例和復(fù)合工藝是否成熟以及合成的支架產(chǎn)品生物安全性如何還不確定[4～6]。目前，我國(guó)關(guān)于復(fù)合支架材料的生物安全性研究也很少，根據(jù)《國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局令第15號(hào) 醫(yī)療器械分類規(guī)則》，關(guān)節(jié)軟骨再生支架屬于長(zhǎng)期組織接觸類植入器械，對(duì)其安全性、有效性必須嚴(yán)格控制。因此，本研究按照 GB/T 16886《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》的要求，對(duì)其中一種代表性的復(fù)合支架——關(guān)節(jié)軟骨再生支架，進(jìn)行了系統(tǒng)全面的生物安全性研究，包括短期毒性、刺激性、全身毒性以及遺傳毒性，為國(guó)家監(jiān)督監(jiān)管支架材料市場(chǎng)，并為復(fù)合支架材料的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

關(guān)節(jié)軟骨再生支架。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

采用浸提液法。按照標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16886.12-2005[7]的規(guī)定，無(wú)菌操作，待樣品吸收培養(yǎng)基至飽和后，按樣品干重0.1g/mL的比例加入含血清培養(yǎng)基，37?C下浸提24h。陰性對(duì)照品為高密度聚乙烯瓶。陽(yáng)性對(duì)照品5g/L苯酚溶液。培養(yǎng)72h后觀察結(jié)果。

1.2.2 皮膚致敏試驗(yàn)

挑選普通級(jí)Hartly白化豚鼠30只（來(lái)源：廣東省廣州市花都花東信華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)），雌雄均可，每只約300g。試驗(yàn)組各10只，陰性對(duì)照組各5只，進(jìn)行第1d、7d、21d誘導(dǎo)。并于試驗(yàn)結(jié)束后24h和48h觀察動(dòng)物激發(fā)部位情況和計(jì)分。

1.2.3 皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)

挑選健康新西蘭白兔2只（來(lái)源：廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），體重2.0kg。試驗(yàn)前12h將試驗(yàn)用兔背部脊柱兩側(cè)被毛去除干凈。在每只兔脊柱左側(cè)上部5個(gè)點(diǎn)每點(diǎn)皮內(nèi)注射0.2mL0.9%氯化鈉注射液制備的浸提液，同側(cè)下部5個(gè)點(diǎn)每點(diǎn)皮內(nèi)注射0.2mL對(duì)照液。同樣方法注射玉米油浸提液及對(duì)照組，于注射后即刻、24h、48h和72h觀察記錄各注射部位的狀況并記分。

1.2.4 急性全身毒性試驗(yàn)

SPF級(jí)KM小鼠（來(lái)源：于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），取20只小鼠，每種浸提液10只，隨機(jī)分為供試品和對(duì)照兩組，每組5只。腹腔注射劑量50mL/kg。注射完畢即時(shí)觀察小白鼠反應(yīng)，并于4h、24h、48h和72h觀察動(dòng)物的一般狀態(tài)、毒性表現(xiàn)和死亡數(shù)，并于72h時(shí)稱量動(dòng)物體重。

1.2.5 溶血試驗(yàn)

普通級(jí)新西蘭白兔，體重3.4kg（來(lái)源：于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。將供試品管、陰性管、陽(yáng)性管放入37?C水浴中保溫30min。分別加入0.2mL稀釋抗凝兔血，輕輕混勻，繼續(xù)在37?C恒溫水浴中保溫60min。陽(yáng)性對(duì)照組為純化水。800g離心力離心5min。取上清液置于紫外分光光度計(jì)比色皿中，在545nm處測(cè)量吸光度。

1.2.6 遺傳毒性試驗(yàn)

1.2.6.1 細(xì)菌基因突變?cè)囼?yàn)

鼠傷寒沙門(mén)氏菌組氨酸缺陷性菌株TA97、TA98、TA100、TA102（上海復(fù)祥生物科技有限公司）。取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5mL，加入無(wú)菌小三角瓶振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，融化頂層培養(yǎng)基分裝于無(wú)菌小試管，每管2ml，在45?C水浴中保溫。

在保溫的頂層培養(yǎng)基中依次加入樣品液0.1ml、新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物0.1ml和10%S9混合物0.5ml。無(wú)活化組加入0.2mol/L磷酸鹽緩沖液0.5ml。試管的內(nèi)容物混合后鋪至最低瓊脂營(yíng)養(yǎng)平板的表面。在培養(yǎng)前待頂層瓊脂固化。72h培養(yǎng)結(jié)束后，取出平皿，墊黑紙觀察，計(jì)算樣品組各劑量組、陰性對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組平行皿菌落數(shù)。

1.2.6.2 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)

L5178Y 小鼠淋巴瘤細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞與生物化學(xué)研究所）取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，調(diào)整密度為5×105/mL，按1%體積加入受試物，37?C震搖處理3小時(shí)后離心棄上清液，用PBS洗滌細(xì)胞，重新懸浮細(xì)胞于培養(yǎng)液中，調(diào)整密度為2×105/ mL。

PE0測(cè)定：取適量細(xì)胞懸液，作梯度稀釋至8個(gè)細(xì)胞/mL接種96孔板，培養(yǎng)12d，計(jì)數(shù)每塊平板有集落生長(zhǎng)的孔數(shù)。PE2平板：第2d表達(dá)培養(yǎng)結(jié)束后，按PE0接種每天計(jì)數(shù)細(xì)胞密度并保持密度在106/mL以下。

TEF拮抗平板：第2d表達(dá)培養(yǎng)結(jié)束后，取適量細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/mL，加入TFT，接種96孔板，每孔加0.2mL，培養(yǎng)12d后計(jì)數(shù)有突變集落生長(zhǎng)的孔數(shù)。陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組同法制備。

1.2.7 亞慢毒性試驗(yàn)

SD大鼠，體重120～300g（來(lái)源：廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），取SD大鼠，隨機(jī)分成對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組20只，雌雄各半。尾靜脈注射方法連續(xù)接觸14天，注射量為10mL/kg。空白對(duì)照組給予試驗(yàn)組相同體積的浸提介質(zhì)。試驗(yàn)結(jié)束后從腹主動(dòng)脈抽取血液進(jìn)行血液學(xué)、血液生化等檢測(cè)。全部動(dòng)物均進(jìn)行完整的大體尸檢。需要進(jìn)行組織學(xué)檢查的器官（組織）及時(shí)投入10%中性福爾馬林固定液中固定。

1.2.8 肌肉植入試驗(yàn)

新西蘭兔9只，體重2kg（來(lái)源：廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。檢品處理：裁剪成長(zhǎng)約10mm，寬約1～3mm小段，陰性對(duì)照品為PE管路裁剪成同樣大小。

使用戊巴比妥鈉，腹腔注射麻醉動(dòng)物，手術(shù)部位剃毛，消毒脊柱旁肌，將試驗(yàn)材料沿肌纖維長(zhǎng)軸平行植入肌內(nèi)，平行于脊柱，離中線50mm，植入物之間間隔25mm。同法在脊柱另一側(cè)植入對(duì)照樣品，手術(shù)后涂抹碘酒消毒。分別于觀察1w、4w和12w后，無(wú)痛處死動(dòng)物，對(duì)組織進(jìn)行肉眼觀察，切取包括植入物及其周圍足夠多未受影響的組織制作組織切片標(biāo)本，進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。

2.結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性

按照GB/T 16886.5-2005[8]的規(guī)定，表1中試驗(yàn)結(jié)果表明，關(guān)節(jié)軟骨再生支架的浸提液，與陰性對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，表明關(guān)節(jié)軟骨再生支架對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)抑制作用，細(xì)胞毒性計(jì)分為0分，無(wú)細(xì)胞毒性反應(yīng)。

2.2 皮膚致敏試驗(yàn)

表2試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)組豚鼠激發(fā)部位反應(yīng)未大于陰性對(duì)照組，試驗(yàn)組豚鼠反應(yīng)等級(jí)未大于陰性對(duì)照組，且陰性對(duì)照組反應(yīng)等級(jí)小于1。試驗(yàn)過(guò)程中樣品組和陰性對(duì)照組均未出現(xiàn)紅斑、水腫和組織壞死，關(guān)節(jié)軟骨再生支架的皮膚致敏試驗(yàn)為陰性。

2.3 皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)

參照標(biāo)準(zhǔn) GB/T 16886.10-2005[9]，試驗(yàn)組浸提液反應(yīng)程度未大于對(duì)照組，且供試品浸提液與對(duì)照平均記分之差為為0分，試驗(yàn)過(guò)程中并未出現(xiàn)紅斑、水腫和組織壞死，結(jié)果表明關(guān)節(jié)軟骨再生支架的皮內(nèi)反應(yīng)結(jié)果為無(wú)皮內(nèi)反應(yīng)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表2. 皮膚致敏試驗(yàn)結(jié)果

表3. 皮內(nèi)反應(yīng)結(jié)果

表4. 急性全身毒性試驗(yàn)結(jié)果

表5. 溶血試驗(yàn)結(jié)果

2.4 急性全身毒性試驗(yàn)

參照GB/T 16886.11-2011[10]標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)期間，小鼠并未出現(xiàn)毒性癥狀（無(wú)腹部刺激癥狀、呼吸困難、運(yùn)動(dòng)減少、眼瞼下垂或腹瀉等癥狀），無(wú)動(dòng)物死亡，體重?zé)o異常變化，且試驗(yàn)組小鼠反應(yīng)未大于對(duì)照組小鼠，關(guān)節(jié)軟骨再生支架的急性全身毒性試驗(yàn)結(jié)果為無(wú)急性全身毒性反應(yīng)。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.5 溶血試驗(yàn)

參照標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16886.4-2003[11]，試驗(yàn)組溶血率為0.7%（-），低于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定5%溶血率，無(wú)明顯溶血現(xiàn)象，結(jié)果表明，關(guān)節(jié)軟骨再生支架無(wú)溶血反應(yīng)。結(jié)果見(jiàn)表5。

2.6 遺傳毒性試驗(yàn)

2.6.1 細(xì)菌基因回復(fù)突變?cè)囼?yàn)

選擇鼠傷寒沙門(mén)氏組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，關(guān)節(jié)軟骨再生支架沒(méi)有致突變性，不會(huì)使缺陷型細(xì)菌回復(fù)突變至野生型，即在無(wú)組氨酸的培養(yǎng)基中，不能形成大量菌落。培養(yǎng)72h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，試驗(yàn)組對(duì)TA97、TA98、TA100和TA102回變菌落數(shù)，在加與不加MS9條件下，均不超過(guò)其自發(fā)回變數(shù)1倍以上，參照標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16886.3-2008[12]，關(guān)節(jié)軟骨再生支架細(xì)菌基因突變?cè)囼?yàn)為陰性。

2.6.2 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)

試驗(yàn)中選擇TK位點(diǎn)突變的小鼠淋巴瘤細(xì)胞株（L5178Y），胸苷激酶正常的細(xì)胞株對(duì)三氟胸苷TFT敏感，在TFT的選擇培養(yǎng)基中不能增值，但是突變的細(xì)胞則不敏感，能繼續(xù)分裂形成集落。試驗(yàn)結(jié)果表明，關(guān)節(jié)軟骨再生支架的TFT抗性突變頻率與陰性對(duì)照組無(wú)顯著性差異，均小于240×10-6，且小集落突變百分率在30%～60%范圍內(nèi)，關(guān)節(jié)軟骨再生支架的體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)為陰性。

2.7 亞慢毒性試驗(yàn)

參照標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16886.11-2011，結(jié)果表明，在試驗(yàn)1d、7d和14d分別進(jìn)行稱重和毒性癥狀觀察，未觀察到供試品對(duì)SD大鼠明顯的毒性作用。尾靜脈注射途徑優(yōu)于腹腔注射或肌肉植入途徑，樣品浸提液直接與血液接觸，更直接反應(yīng)產(chǎn)品的生物安全性。

2.7.1 試驗(yàn)動(dòng)物均未觀察到毒性癥狀，對(duì)照組和試驗(yàn)平均體重變化之間的差異和主要臟器體重比之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.7.2 血液學(xué)檢測(cè)的9個(gè)指標(biāo)中，試驗(yàn)組和對(duì)照組相比，各指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表6。

2.7.3 血液生化檢測(cè)的14個(gè)指標(biāo)中，試驗(yàn)組和對(duì)照組相比，各指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表7

2.7.4 大體解剖觀察，試驗(yàn)組和對(duì)照組的心、肝、脾、肺、腎等組織、臟器均未見(jiàn)病理學(xué)改變。

2.8 肌肉植入試驗(yàn)

表6. 試驗(yàn)組動(dòng)物血液學(xué)檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，對(duì)照組n =20 ，試驗(yàn)組n =20 )

表7. 血液生化檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)結(jié)果(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，對(duì)照組n =20 ，試驗(yàn)組n =20 )

植入后1d、3d和5d觀察植入點(diǎn)的皮膚反應(yīng)，未出現(xiàn)出血、紅腫和試樣排除等異?，F(xiàn)象。解剖時(shí)肉眼觀察植入部位組織無(wú)異常病變，切取包裹試樣周圍約0.5cm～1.0cm的組織，進(jìn)行切片制備。參照標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16886.6-1997[13]，關(guān)節(jié)軟骨再生支架于植入后1w、4w、12w，組織學(xué)表現(xiàn)與對(duì)照組無(wú)明顯差異，樣品在新西蘭兔肌肉內(nèi)植入狀況從1w的炎癥細(xì)胞存在和囊腔纖維母細(xì)胞生成，至12w，確認(rèn)囊腔基本形成并在樣品間隙長(zhǎng)入纖維細(xì)胞，纖維周邊可見(jiàn)膠原纖維增生。結(jié)果表明，關(guān)節(jié)軟骨再生支架在肌肉中具有良好的生物相容性，見(jiàn)表8。

表8. 組織學(xué)評(píng)價(jià)

表8各項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果表明，關(guān)節(jié)軟骨再生支架無(wú)短期和長(zhǎng)期毒性，無(wú)刺激性，無(wú)遺傳毒性，符合GB/T16886《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)》的要求，具有良好的生物安全性。

3.討論

GB/T16886《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)》是我國(guó)進(jìn)行醫(yī)療器械生物安全性評(píng)價(jià)的主要指導(dǎo)性標(biāo)準(zhǔn)。為了更系統(tǒng)全面的研究復(fù)合支架材料的生物安全性，在本研究中，我們不僅研究了其短期毒性（包括細(xì)胞毒性，急性全身毒性以及刺激性），因再生支架為長(zhǎng)期植入類產(chǎn)品，著重研究了其長(zhǎng)期毒性包括亞慢性全身毒性，植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)，并對(duì)其遺傳毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。短期毒性試驗(yàn)和刺激性試驗(yàn)可以方便快捷的檢測(cè)材料浸出物對(duì)細(xì)胞和機(jī)體的毒性作用，以及刺激作用，試驗(yàn)結(jié)果表明，關(guān)節(jié)軟骨再生支架無(wú)細(xì)胞毒性，無(wú)急性全身毒性，無(wú)皮內(nèi)反應(yīng)，無(wú)致敏性。此外，通過(guò)溶血試驗(yàn)檢測(cè)了關(guān)節(jié)軟骨再生支架是否會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生溶血作用，結(jié)果顯示為陰性。亞慢性全身毒性試驗(yàn)，植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)以及遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果均顯示為陰性，表明關(guān)節(jié)軟骨再生支架無(wú)長(zhǎng)期毒性和遺傳毒性，具有良好的生物相容性。

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[7] GB/T 16886.12-2005 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)[12].第十二部分：樣品制備與參照樣品

[8] GB/T 16886.5-2003 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)[S]. 第五部分：細(xì)胞毒性試驗(yàn)：體外法

[9] GB/T16886.10-2005醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第10部分：刺激與遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)

[10] GB/T16886.11-2011 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第 11 部分：全身毒性試驗(yàn)

[11] GB/T16886.4-2003 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第4部分：與血液相互作用試驗(yàn)選擇

[12] GB/T16886.3-2008 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第 3 部分：遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗(yàn)

[13] GB/T16886.6-1997醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第6部分：植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)

Study on the Biosafety of Articular Cartilage Regeneration Scaffold

ZHENG Bao-ting TIAN Sheng-hui KE Jun Guangzhou Medical Instruments Quality Surveillance and Inspection Center of State Food and Drug Administration (Guangzhou 510663)

To evaluate biosafety of articular cartilage regeneration scaffold. Methods: To evaluate the in vitro cytotoxicity test, skin sensitization test, intradermal reaction test, acute systemic toxicity test, haemolysis test, genotoxicity test, test for local effects after implantation and subchronic systemic toxicity of the articular cartilage regeneration scaffold prepared by composite materials. All the results were within the rules. Conclusion: the articular cartilage regeneration scaffold prepared by composite materials has good biosafety.

articular cartilage regeneration scaffold, biosafety, toxicity test

1006-6586(2016)05-0039-06

R318.08

A

2016-03-29

鄭保婷，助理工程師