陳 庭 家， 田 景 玉， 丁 月， 隋 凌 云， 宋 亮,2

( 1.大連工業(yè)大學 食品學院， 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學 國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034 )

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刺參體腔細胞類型及其死亡率與溫度的關(guān)系

陳 庭 家1， 田 景 玉1， 丁 月1， 隋 凌 云1， 宋 亮1,2

( 1.大連工業(yè)大學 食品學院， 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學 國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034 )

應(yīng)用光鏡和透射電鏡技術(shù)研究了刺參體腔細胞的類型，結(jié)合流式細胞術(shù)分析了刺參體腔細胞的亞群。光學顯微鏡下，根據(jù)細胞形態(tài)將體腔細胞分為球型細胞、變形細胞、淋巴樣細胞和紡錘細胞；透射電鏡下，根據(jù)細胞結(jié)構(gòu)將體腔細胞分為顆粒細胞和無顆粒細胞。利用流式細胞儀通過測試前向角散射光(FSC)和側(cè)向角散射光(SSC)兩個參數(shù)，分別代表細胞的大小和細胞的顆粒度，繪制雙參數(shù)(SSC×FSC)散點圖和等高圖，得出刺參體腔細胞可以分為顆粒細胞和無顆粒細胞兩大群，其中無顆粒細胞是主要細胞類群，占體腔細胞總數(shù)的65%，而顆粒細胞占31%。采用流式細胞儀研究了刺參體腔細胞死亡率與溫度的關(guān)系。結(jié)果表明，在0～20 ℃下海參體腔細胞死亡率變化不大，在高溫條件下(20～30 ℃)，細胞破裂解體速度加快，細胞存活時間較短。

刺參；體腔細胞；分類；溫度；死亡率

0 引 言

刺參(Apostichopusjaponicus)是溫帶區(qū)海參主要種類，是一種自降解能力極強的海洋生物，在受到光照、溫度等刺激后，經(jīng)過表皮破壞、吐腸、溶解等過程[1]。水溫作為重要的生態(tài)因子之一，對海參的生長以及其生理活動等都具有極其重要的作用。大部分棘皮動物如海參、海膽體腔內(nèi)充滿了體腔液，體腔液中懸浮著多種類型與紅細胞相似的體腔細胞[2]。在刺參的生長過程中，病原體能夠直接進入到海參的體腔中與其接觸，其體腔細胞在抵御外來物質(zhì)中發(fā)揮著重要的作用，因此刺參體腔細胞的功能研究一直是海洋無脊椎動物免疫學研究的熱點問題。

本研究基于流式細胞檢測技術(shù)并結(jié)合光鏡和透射電鏡技術(shù)對刺參體腔細胞進行分類；同時通過流式細胞儀測定刺參體腔細胞在不同溫度下的死亡率，初步探討了溫度對刺參體腔細胞功能的影響，以期探索溫度對刺參體腔細胞的免疫特性的影響，為解決刺參養(yǎng)殖水溫控制及其保活、保鮮貯運過程中溫度調(diào)控提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

刺參，產(chǎn)自大連金州周邊海域。

流式細胞儀，BD FACSVerseTM；透射電子顯微鏡，日本電子株式會社；多功能光學顯微鏡，OLYMPUS 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 刺參體腔細胞的光鏡觀察

取鮮活刺參50 μL體腔液注入培養(yǎng)皿，通過光學顯微鏡觀察刺參體腔細胞，放大1 000倍。

1.2.2 刺參體腔細胞的透射電鏡觀察

取鮮活刺參體腔液800 μL，2 700 r/min離心5 min，棄去上清液，向沉淀中加2.5%戊二醛，固定，用0.1 mol/L，pH 7.5磷酸緩沖溶液漂洗待測樣品。用1%鋨酸溶液固定，梯度濃度乙醇對待測樣品進行脫水、包埋，超薄切片，鈾鉛雙染觀測。

1.2.3 流式細胞儀分析

取鮮活刺參體腔液500 μL經(jīng)300目濾布過濾，加入上樣管。檢測前向角散射光(FSC)和側(cè)向角散射光(SSC)。結(jié)果用雙參數(shù)(SSC×FSC)點圖和等高圖、FSC和SSC單參數(shù)直方圖表達。每個樣本取10 000個細胞。

1.2.4 刺參體腔細胞死亡率試驗

取鮮活刺參體腔液，離心后去除上清液，磷酸鹽緩沖溶液重懸，經(jīng)300目濾布過濾后分裝于1.5 mL離心管；置于不同溫度(0、10、20、30、35、40 ℃)，孵育2、4 h，經(jīng)PI試劑染色，測定死亡率。

2 結(jié)果與討論

2.1 基于光鏡觀測技術(shù)的刺參體腔細胞類型及形態(tài)

刺參體腔細胞的形態(tài)變化較大，形狀不固定，其分類與其采用的觀測方法緊密相關(guān)，因此，對海參體腔細胞的分類存在多種觀點尚未統(tǒng)一。Canicatti[3]最早在海參體內(nèi)觀察發(fā)現(xiàn)了3種細胞； 廖玉麟[4]把海參的體腔細胞分為6種細胞。利用光鏡觀察參考廖玉麟[4]、Eliseikina等[5]的研究結(jié)果，本實驗將刺參體腔細胞分為4類：球形細胞、變形細胞、淋巴樣細胞、紡錘細胞，如圖1所示。其中球形細胞與其他細胞區(qū)別較大，形態(tài)呈球形且內(nèi)部含有大量的小顆粒，細胞核被胞質(zhì)中大量的顆粒遮住，大小為6～12 μm；變形細胞形狀不定，大小為6～8 μm。細胞核呈球形，活體從細胞外質(zhì)伸出多個葉狀絲狀或花瓣狀的偽足，胞質(zhì)內(nèi)含有一定量的顆粒；淋巴樣細胞相對于其他體腔細胞較小，大小為4～5 μm，呈球形或卵圓形，帶有1～3個長3～6 μm的絲狀偽足；紡錘細胞兩端尖，呈紡錘形，大小5～7 μm，細胞核圓形，胞質(zhì)內(nèi)偶有少量顆粒。

a) 球形細胞

(b) 變形細胞

c) 淋巴樣細胞

(d) 紡錘細胞

圖1 光鏡下不同的刺參體腔細胞

Fig.1 Different coelomocytes from sea cucumberA.japonicasobserved by light microscopy

2.2 基于透射電鏡觀測技術(shù)的刺參體腔細胞類型

利用透射電鏡觀察刺參體腔細胞有兩大類，如圖2所示。一類是細胞質(zhì)內(nèi)基本沒有或有少量顆粒的無顆粒細胞(圖2(a))；另一類是細胞質(zhì)內(nèi)充滿較多的顆粒的顆粒細胞(圖2(b))。無顆粒細胞的形狀不規(guī)則，常有各種形狀的細胞突起，直徑4～6 μm。胞質(zhì)內(nèi)含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、高爾基器和液泡等細胞器，細胞核大。顆粒細胞的直徑6～10 μm，胞內(nèi)充滿1.5～3 μm 的顆粒，由高電子密度的微粒組成。顆粒之間的胞質(zhì)中有少量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體細胞器，其他細胞器較少。由于細胞的顆粒較多，容易遮掩細胞核，通常難以觀察到細胞核。透射電鏡觀察的是細胞的內(nèi)部形態(tài)，推測可能是淋巴樣細胞、紡錘細胞和變形細胞的體積和顆粒度大小相近，在透射電鏡下表現(xiàn)為相似的內(nèi)部形態(tài)。參考劉曉云等[6]的研究結(jié)合光學顯微鏡觀察結(jié)果，球形細胞的大小與其他種類細胞差別較大，且內(nèi)部存在較多的電子云顆粒，因此將該類細胞歸類為顆粒細胞；淋巴樣細胞、紡錘細胞和變形細胞歸類為無顆粒細胞。

圖2 透射電鏡下不同的刺參體腔細胞

Fig.2 Different coelomocytes from sea cucumber A. japonicas observed by transmission electron microscopic

2.3 基于流式細胞檢測技術(shù)的刺參體腔細胞類型

目前有關(guān)海參體腔細胞的研究主要集中在形態(tài)和分類方面，且多是利用光鏡和電鏡技術(shù)對其進行形態(tài)學分類，有其局限性。流式細胞檢測技術(shù)能夠迅速精確地對細胞的大小和顆粒度進行定量定性分析。應(yīng)用流式細胞術(shù)于水生生物的研究中，大部分是研究其細胞的分類[7]，且多集中在甲殼類[8]和貝類[9]。孫敬峰等[10]發(fā)現(xiàn)蝦的血細胞可分為顆粒細胞與透明細胞兩個亞群，許秀芹等[11]研究了4種雙殼貝類的血細胞也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果。本實驗通過流式細胞儀測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)刺參的體腔細胞明顯地分成兩個細胞群體，如圖3所示，P1細胞群的FSC和SSC信號都較強，表明細胞較大，細胞顆粒度較高，結(jié)合透射電鏡觀察結(jié)果歸為顆粒細胞；P2細胞群的FSC和SSC信號相對較弱，表明細胞較小，細胞顆粒度較低，結(jié)合透射電鏡觀察結(jié)果歸為無顆粒細胞。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，刺參體腔細胞中無顆粒細胞群為主要類型的細胞，所占比例較大，為65%；顆粒細胞所占比例為31%。

圖3 流式細胞儀分析刺參體腔細胞的類群

Fig.3 Population of coelomocytes in sea cucumber A. japonicas by flow cytometric analysis

2.4 溫度對刺參體腔細胞死亡率的影響

刺參生長的環(huán)境溫度過高會抑制其生長，使發(fā)病率上升。特別是夏季，水溫升高，刺參為適應(yīng)高溫，會進入夏眠狀態(tài)，停止攝食，體重減輕，自身生長發(fā)育緩慢且與生理免疫相關(guān)刺參體液的免疫因子也會發(fā)生變化[12]。溫度作為海參生長過程中最為重要的環(huán)境因子，與海參細胞的免疫功能關(guān)系密切。

利用流式細胞儀測試溫度對體腔細胞死亡率的影響，與傳統(tǒng)的臺盤藍染色顯微鏡人工計數(shù)相比，統(tǒng)計速度快、樣本量大且結(jié)果準確客觀。根據(jù)PI染劑的激發(fā)波長和發(fā)射波長選擇PE熒光通道，如圖4所示。在圖4(a)中，左側(cè)的峰為活細胞的吸收峰，右側(cè)為死細胞的吸收峰；在圖4(b)中，位于UL象限內(nèi)的細胞為死細胞，位于LL為活細胞，統(tǒng)計死細胞數(shù)量占總細胞數(shù)量的百分比為細胞死亡率。

由圖5可以看出，刺參體腔細胞的死亡率在不同溫度下存在較為明顯的差異。在0～20 ℃下孵育2和4h，刺參體腔細胞的死亡率無明顯差異(P>0.05)；溫度為30 ℃時，其死亡率急劇增加(P<0.05)，細胞死亡率超過30%。隨著孵育時間的延長，體腔細胞的死亡率也明顯增加(P<0.05)。結(jié)果與文獻[13]報道的刺參自然生長溫度條件相符。刺參正常生長水溫約為0～30 ℃，但是其生長最適溫度為15～18 ℃。不適宜的生長水溫可能導致刺參體內(nèi)的自由基代謝紊亂，而自由基在刺參體內(nèi)大量的沉積，使刺參體內(nèi)免疫系統(tǒng)的防御功能下降，進而影響刺參的生長及發(fā)育。刺參生長的環(huán)境溫度過高，體腔細胞會發(fā)生大面積死亡，使其停止生長，發(fā)育延緩，發(fā)病率上升。

圖4 流式細胞儀測定死亡率結(jié)果

字母表示數(shù)據(jù)間具有顯著性差異(P<0.05)

3 結(jié) 論

流式細胞術(shù)能快速地分辨刺參體腔液細胞的大小和顆粒性。本實驗基于流式細胞術(shù)將刺參體腔細胞進行類群分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)刺參體腔細胞可以明顯地分為兩大類群，即細胞體積和顆粒度較小的一群為無顆粒細胞(占65%)，而細胞體積和顆粒度較大的一群為顆粒細胞(占31%)。

本實驗結(jié)果證實了刺參體腔細胞的死亡率在不同溫度下存在較為明顯的差異。在低溫條件下(0～20 ℃)，刺參體腔細胞的死亡率無明顯變化；但當溫度升至30 ℃時，其死亡率急劇增加。表明溫度對刺參體腔細胞具有較強的免疫應(yīng)激作用。其原因可歸結(jié)為：低溫條件下，刺參體腔細胞活力較高，免疫防御能力較高，其死亡率較低；在高溫條件下，細胞破裂解體速度加快，細胞存活時間較短，高溫對刺參體腔細胞產(chǎn)生了應(yīng)激性刺激。

[1] 姜健,楊寶靈,邰陽.海參資源及其生物活性物質(zhì)的研究[J].生物技術(shù)通訊,2004,15(5):537-540.

[2] 王淑嫻,葉海斌,于曉清,等.海參的免疫機制研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2012,40(25):12553-12555.

[3]CANICCATTIC,MIGLIETTAA.Arylsulphataseinechinodermimmunocompetentcells[J].HistochemicalJournal, 1989, 21(7): 419-424.

[4] 廖玉麟.中國動物志(一卷)[M].北京:科學出版社,1997.

[5]ELISEIKINAMG,MAGARLAMOYTY.CoelomocytemorphologyintheHolothuriansApostichopus japonicus (Aspidochirota:Stichopodidae)andCucumaria japonica (Dendrochirota:Cucumariidae)[J].RussianJournalofMarineBiology, 2002, 28(3): 197-202.

[6] 劉曉云,譚金山,包振民,等.刺參體腔細胞的超微結(jié)構(gòu)觀察[J].電子顯微學報,2005,24(6):613-615.

[7]DONAGHYL,KIMBK,HONGHK,etal.FlowcytometrystudiesonthepopulationsandimmuneparametersofthehemocytesoftheSuminoeoyster, Crassostrea ariakensis[J].FishandShellfishImmunology, 2009, 27(2): 296-301.

[8] 徐海圣,徐步進.甲殼動物細胞及體液免疫機理的研究進展[J].大連海洋大學學報,2001,16(1):49-56.

[9] 周永燦,潘金培.貝類細胞和體液的防御機制研究進展[J].水產(chǎn)學報,1997,12(4):449-454.

[10] 孫敬鋒,冼健安,張鐵軍,等.流式細胞術(shù)比較研究三種對蝦血細胞的分群[J].淡水漁業(yè),2008,38(3):18-22.

[11] 許秀芹,王宜艷,孫虎山.流式細胞術(shù)比較研究4種雙殼貝類血細胞的分群[J].海洋湖沼通報,2006(1):46-50.

[12] 陳勇,高峰,劉國山,等.溫度、鹽度和光照周期對刺身生長及行為的影響[J].水產(chǎn)學報,2007(5):687-691.[13] WANG F Y, YANG H S, GAO F, et al. Effects of acute temperature or salinity stress on the immune response in sea cucumberApostichopusjaponicus[J]. Comparative Biochemistry and Physiology, 2008, 151(4): 491-498.

徐濤,董天飛,陳明,范勝男,史超.海洋真菌Schizochytriumsp.DP-16發(fā)酵產(chǎn)DHA油脂過程的優(yōu)化[J].大連工業(yè)大學學報,2016,35(6):411-415.

Analysis on categories of coelomocytes in sea cucumberApostichopusjaponicusand its mortality with relation to temperature

CHEN Tingjia1, TIAN Jingyu1, DING Yue1, SUI Lingyun1, SONG Liang1,2

( 1.School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China； 2.National Engineering Research Center of Seafood, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

The types of coelomocytes in Apostichopus japonicas were determined by light microscopy and transmission electron microscopy, and the subsets of coelomocytes were analyzed by flow cytometry. Coelomocytes could be divided into spherical cell, amoebocytes, lymphoid cell and spindle cell according to the morphology under light microscopy; besides, the coelomocytes could be identified as granulosa cell and agranulocytes based on the cellular structure under the transmission electron microscopy. The population of coelomocytes in sea cucumber Apostichopus japonicas was further analyzed by flow cytometry. Two parameters of light-scatter were set up such as light-scatter (FSC) and side light-scatter (SSC). The analysis results were expressed as the dot and the contour plots of two parameters (FSC & SSC), the single parameter (FSC & SSC) histogram of coelomocytes for Apostichopus japonicas. Apostichopus japonicas coelomocytes were divided into two populations of granulocytes and agranulocytes by flow cytometry, and agranulocytes were major population accounting for 65% whereas granulocytes accounted for 31%. The relationship between mortality of coelomocytes and temperature was invested based on flow cytometry analysis. Results showed that the mortality of sea cucumber coelomocyte did not change significantly at low temperature range (0-20 ℃), while higher temperature (20-30 ℃) accelerated cell rupture sharply, leading to the shorter cell survival duration.

Apostichopusjaponicas; coelomocytes; classification; temperature; mortality

2015-09-30.

國家自然科學基金青年科學基金資助項目(31401562)；遼寧省農(nóng)業(yè)領(lǐng)域青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃項目(2015002)；遼寧省教育廳科學研究一般項目(L2014220).

陳庭家(1989-)，男，碩士研究生；通信作者：宋 亮(1980-)，男，講師.

TS254.9

A

1674-1404(2016)06-0407-04

CHEN Tingjia, TIAN Jingyu, DING Yue, Sui Lingyun, SONG Liang. Analysis on categories of coelomocytes in sea cucumberApostichopusjaponicusand its mortality with relation to temperature[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2016, 35(6): 407-410.