徐 濤， 董 天 飛， 陳 明， 范 勝 男， 史 超

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034；2.赤峰工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 內(nèi)蒙古 赤峰 024005 )

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海洋真菌Schizochytriumsp.DP-16發(fā)酵產(chǎn)DHA油脂過(guò)程的優(yōu)化

徐 濤1， 董 天 飛2， 陳 明1， 范 勝 男1， 史 超1

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034；2.赤峰工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 內(nèi)蒙古 赤峰 024005 )

利用一株海洋真菌Schizochytriumsp. DP-16發(fā)酵產(chǎn)DHA，對(duì)其發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化，并利用氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)對(duì)其脂肪酸組成進(jìn)行了分析。通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了發(fā)酵培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，在優(yōu)化條件下培養(yǎng)120 h，細(xì)胞生物量達(dá)65.0 g/L，油脂產(chǎn)量達(dá)30.7 g/L，DHA達(dá)8.9 g/L。GC-MS分析表明Schizochytriumsp. DP-16細(xì)胞中共檢出8種脂肪酸，主要含有C14：0 和C16：0兩種飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸主要包括DPA和DHA，其中DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)28.784%。

海洋真菌；裂殖壺菌；DHA；發(fā)酵優(yōu)化；氣質(zhì)聯(lián)用

0 引 言

二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)是一種重要的ω-3多不飽和脂肪酸，具有降血脂、增強(qiáng)視力、促進(jìn)腦細(xì)胞發(fā)育等生理功效[1]，廣泛用于食品醫(yī)藥行業(yè)，被譽(yù)為新一代功能因子，人體自身難以合成，必須從外界攝取。傳統(tǒng)的DHA主要來(lái)源于深海魚(yú)油，但品質(zhì)與產(chǎn)量難以滿(mǎn)足商業(yè)化發(fā)展需求，而微生物來(lái)源DHA具有含量高、質(zhì)量好、過(guò)程可控、產(chǎn)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，成為目前的研究熱點(diǎn)[2]。

裂殖壺菌(Schizochytrium)是一種富含DHA的海洋真菌，具有生長(zhǎng)快、易培養(yǎng)、細(xì)胞內(nèi)油脂和DHA含量高等優(yōu)點(diǎn)，是商業(yè)化生產(chǎn)DHA的理想生產(chǎn)菌之一[3]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外圍繞裂殖壺菌產(chǎn)DHA的菌種選育、DHA合成途徑、油脂積累機(jī)制、油脂提取等方面進(jìn)行研究，取得了一些研究成果，而如何提高DHA產(chǎn)量一直是裂殖壺菌發(fā)酵產(chǎn)DHA的重點(diǎn)內(nèi)容[4-6]。本實(shí)驗(yàn)利用一株裂殖壺菌Schizochytriumsp. DP-16發(fā)酵產(chǎn)DHA，對(duì)其發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化，并利用氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)對(duì)其油脂的脂肪酸組成進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

Schizochytriumsp. DP-16，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，酵母浸粉10，蛋白胨2，海水晶15，pH 6.0。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖70，酵母浸粉10，蛋白胨10，海水晶15，MgSO4·7H2O 2，KH2PO4·H2O 4，pH 6.0。

1.1.3 試劑與儀器

BF3-甲醇溶液、DHA甲酯，上海安譜科學(xué)儀器有限公司，甲醇、氯仿、正己烷等均為分析純。

7890型氣相色譜-5975型質(zhì)譜聯(lián)用儀，Agilent Technologies。

1.2 方 法

1.2.1 種子液的制備

將菌種轉(zhuǎn)接于斜面，25 ℃培養(yǎng)3 d后，挑取2～3環(huán)接入裝有40 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，25 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)2 d。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵

按10%接種量將種子液接入裝有40 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，25 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)4 d，測(cè)定菌體生物量及油脂產(chǎn)量。

1.2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

利用單因素試驗(yàn)，依次對(duì)碳源種類(lèi)和濃度、氮源種類(lèi)和濃度、無(wú)機(jī)鹽濃度、接種量、搖瓶裝液量、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4 生物量測(cè)定

取2 mL發(fā)酵液，10 000 r/min離心15 min，棄上清，菌體沉淀置于80 ℃干燥至恒重，稱(chēng)量。

1.2.5 葡萄糖含量測(cè)定

采用DNS法測(cè)定葡萄糖含量[7]。

1.2.6 油脂含量測(cè)定

取發(fā)酵液5 mL，離心后棄上清，加入5 mL 4 mol/L HCl，置于沸水浴中10 min，加入10 mL體積比2∶1氯仿-甲醇混勻，離心后取氯仿層，加等體積的0.1% NaCl溶液，振蕩混勻，取氯仿層至干燥的試管中，70 ℃干燥至恒重，稱(chēng)量。

1.2.7 油脂脂肪酸組成的GC-MS分析

脂肪酸的甲酯化按文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。取2 mL發(fā)酵液，加3 mL水，4 000 r/min離心5 min，棄上清。將沉淀用7 mL 1 mol/L NaOH-甲醇溶液分兩次轉(zhuǎn)入100 mL磨口瓶中，加塞，置70 ℃ 水浴下皂化30 min，加入7 mL 14% BF3-甲醇溶液，70 ℃水浴下甲酯化反應(yīng)30 min。冷卻，加入10 mL飽和NaCl溶液及3 mL正己烷，振蕩混勻，靜置，取上層有機(jī)相于4 000 r/min離心5 min，吸取上層有機(jī)相用于GC-MS分析。

氣相色譜條件：HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度為260 ℃；載氣為高純度氦氣，體積流量為1 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，分流比1∶10；柱溫采取程序升溫：初始溫度140 ℃，維持5 min，以4 ℃/min升溫至240 ℃，240 ℃維持15 min。質(zhì)譜條件：離子源溫度230 ℃；接口溫度280 ℃；質(zhì)量掃描范圍35～450 u，scan全掃描方式。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1 碳源種類(lèi)的影響

分別選用果糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、麥芽糖、乳糖和菊糖為發(fā)酵培養(yǎng)基碳源，質(zhì)量濃度均為70 g/L，菌體利用不同碳源產(chǎn)DHA的結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，7種碳源均可被菌體利用，其中以葡萄糖為碳源時(shí)菌體生物量和油脂產(chǎn)量最高，果糖和半乳糖次之，木糖、乳糖、麥芽糖和菊糖較差，因此選擇葡萄糖為碳源。

2.1.2 碳源質(zhì)量濃度的影響

改變發(fā)酵培養(yǎng)基中初始葡萄糖濃度，考察葡萄糖濃度對(duì)DHA油脂發(fā)酵的影響。如圖2所示，在葡萄糖質(zhì)量濃度70～100 g/L，生物量和油脂產(chǎn)量隨葡萄糖質(zhì)量濃度的增大而略有增加。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為110 g/L時(shí)，生物量和油脂產(chǎn)量達(dá)到最大，分別為16.8和4.2 g/L，進(jìn)一步增加葡萄糖質(zhì)量濃度，生物量和油脂產(chǎn)量均降低，可能是由于葡萄糖質(zhì)量濃度過(guò)高對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生了一定程度的抑制。因此選擇初始葡萄糖質(zhì)量濃度為110 g/L。

圖1 碳源種類(lèi)對(duì)菌體生物量和油脂產(chǎn)量的影響

圖2 初始葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)菌體生物量和油脂產(chǎn)量的影響

Fig.2 Effects of initial glucose concentrations on the biomass and lipid yields of the strain

2.1.3 氮源種類(lèi)的影響

氮源包括有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源，有機(jī)氮源有利于產(chǎn)油脂微生物細(xì)胞生長(zhǎng)，尤以酵母浸粉能較好地促進(jìn)DHA油脂積累[9-10]。以酵母浸粉為基礎(chǔ)氮源，考察添加其他氮源(10g/L)對(duì)DHA油脂發(fā)酵的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，添加谷氨酸鈉能夠有效促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和油脂積累，因此，選擇酵母浸粉和谷氨酸鈉組成的復(fù)合氮源。

圖3 氮源種類(lèi)對(duì)菌體生物量和油脂產(chǎn)量的影響

2.1.4 氮源添加量的影響

改變發(fā)酵培養(yǎng)基中谷氨酸鈉添加量，考察谷氨酸鈉濃度對(duì)菌體發(fā)酵產(chǎn)DHA油脂的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。在谷氨酸鈉添加量為5～50g/L，谷氨酸鈉添加量對(duì)生物量和油脂產(chǎn)量的影響不大，當(dāng)谷氨酸鈉添加量為10g/L時(shí)，生物量和油脂產(chǎn)量達(dá)到最大值，所以選擇谷氨酸鈉質(zhì)量濃度為10g/L。

圖4 谷氨酸鈉添加量對(duì)菌體生物量和油脂產(chǎn)量的影響

Fig.4 Effects of monosodium glutamate amounts on biomass and lipid yields of the strain

2.1.5 無(wú)機(jī)鹽質(zhì)量濃度的影響

無(wú)機(jī)鹽對(duì)微生物的生長(zhǎng)和代謝具有重要作用，如磷酸鹽是微生物生長(zhǎng)所必需的，K+與細(xì)胞滲透壓和透性有關(guān)，Mg2+是多種酶的激活劑，能夠促進(jìn)糖代謝[11]。

在優(yōu)化培養(yǎng)基中添加MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度分別為2、5、8g/L，KH2PO4·H2O質(zhì)量濃度分別為1、4、7g/L，采用不同組合方式考察無(wú)機(jī)鹽質(zhì)量濃度對(duì)Schizochytriumsp.DP-16發(fā)酵產(chǎn)DHA油脂影響，結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，當(dāng)MgSO4·7H2O為5g/L、KH2PO4·H2O為7g/L時(shí)，細(xì)胞生物量和油脂產(chǎn)量達(dá)到最大。

2.2培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 接種量的影響

研究了不同接種量對(duì)Schizochytriumsp.DP-16生長(zhǎng)和油脂積累的影響，如圖5所示。結(jié)果表明，在接種量為2%～10%，生物量及油脂積累與接種量的大小表現(xiàn)出正向相關(guān)性；進(jìn)一步擴(kuò)大接種量至13%，菌體生物量和油脂產(chǎn)量均降低，這可能是由于接種量過(guò)大，菌體生長(zhǎng)過(guò)快，從而使發(fā)酵液黏度增加，導(dǎo)致溶氧不足所致。因此選擇適宜的接種量為10%。

表1 無(wú)機(jī)鹽質(zhì)量濃度對(duì)菌體生物量和油脂產(chǎn)量的影響

Tab.1 Effects of inorganic salt concentrations on biomass and lipid yields of the strain

實(shí)驗(yàn)號(hào)ρ(MgSO4·7H2O)∶ρ(KH2PO4·H2O)ρ/(g·L-1)生物量油脂產(chǎn)量18∶134．57．228∶437．57．338∶734．06．845∶138．57．755∶433．06．665∶739．59．572∶134．57．582∶437．57．992∶732．56．5

圖5 接種量對(duì)菌體生物量和油脂產(chǎn)量的影響

2.2.2 裝液量的影響

研究了不同裝液量對(duì)Schizochytriumsp. DP-16生長(zhǎng)和油脂積累的影響，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明，搖瓶裝液量DHA影響較大，250 mL三角瓶中隨著發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量的增加，生物量和油脂產(chǎn)量先上升后急劇下降，這可能是因?yàn)樵摪l(fā)酵過(guò)程需要適宜的溶氧量。當(dāng)裝液量為30 mL時(shí)，生物量達(dá)57.5 g/L，油脂產(chǎn)量為14.9 g/L。

圖6 裝液量對(duì)菌體生物量和油脂產(chǎn)量的影響

2.2.3 培養(yǎng)時(shí)間的影響

利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方，在搖瓶裝液量30 mL、接種量為10%條件下，研究了Schizochytriumsp. DP-16發(fā)酵產(chǎn)DHA油脂的時(shí)間進(jìn)程，其中生物量和葡萄糖質(zhì)量濃度每隔12 h測(cè)定，油脂和DHA產(chǎn)量每隔24 h測(cè)定，結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表明，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，葡萄糖被Schizochytriumsp. DP-16細(xì)胞利用，其質(zhì)量濃度逐漸降低，同時(shí)細(xì)胞生物量、油脂產(chǎn)量和DHA質(zhì)量濃度隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而不斷提高，在120 h時(shí)達(dá)到最高值，分別為65.0、30.7和8.9 g/L。因此，確定適宜的發(fā)酵時(shí)間為120 h。

a) 葡萄糖和生物量

b) 脂肪酸和DHA

圖7Schizochytriumsp. DP-16發(fā)酵產(chǎn)DHA油脂的時(shí)間進(jìn)程

Fig.7 Time course of fermentation by Schizochytrium sp. DP-16 for DHA lipid production

2.3 油脂的脂肪酸組成分析

對(duì)Schizochytriumsp.DP-16油脂的脂肪酸組成進(jìn)行GC-MS分析，圖8為總離子色譜圖。對(duì)總離子色譜圖的各色譜峰選擇美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)研究所(NIST)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)數(shù)據(jù)系統(tǒng)進(jìn)行檢索分析，結(jié)果表明，脂肪酸甲酯對(duì)應(yīng)的色譜峰保留時(shí)間為13～31min，共檢出8種脂肪酸，分析結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，Schizochytriumsp.DP-16油脂中主要含有C14：0和C16：0兩種飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸主要包括DPA和DHA，其中DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)28.784%。

圖8 Schizochytriumsp.DP-16油脂GC-MS分析的總離子色譜圖

Fig.8 Total ions chromatograph profile of Schizochytrium sp. DP-16 fatty acids analyzed by GC-MS

表2 Schizochytrium sp. DP-16的脂肪酸組成

3 結(jié) 論

對(duì)Schizochytriumsp. DP-16發(fā)酵產(chǎn)DHA的過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化，確定了其發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L)：葡萄糖110，酵母浸粉10，谷氨酸鈉10，海水晶15，MgSO4·7H2O 5 ，KH2PO4·H2O 7；培養(yǎng)條件為種齡48 h，接種量10%，裝液量250 mL 搖瓶裝液30 mL，初始pH 6.0，25 ℃下培養(yǎng)120 h，其生物量達(dá)65.0 g/L，油脂30.7 g/L，DHA 8.9 g/L。GC-MS分析結(jié)果表明，Schizochytriumsp. DP-16油脂中主要含有C14：0和C16：0兩種飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸主要包括DPA和DHA，其中DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)28.784%。

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Optimization of fermentation process by a marine fungus strainSchizochytriumsp. DP-16 for DHA lipid production

XU Tao1, DONG Tianfei2, CHEN Ming1, FAN Shengnan1, SHI Chao1

( 1.School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China； 2.Chifeng Industry Vocational Technology College, Chifeng 024005, China )

The fermentation process of Schizochytrium sp. DP-16 for DHA lipid production was optimized by single factor test, and the composition of cell fatty acids was analyzed as fatty acid methyl esters derivatives (FAMEs) by GC-MS. The results showed that the biomass, lipid production and DHA concentration could reach to 65.0, 30.7 and 8.9 g/L respectively at 120 h under optimized conditions. Eight fatty acids were detected in Schizochytrium sp. DP-16 cells by GC-MS, in which the main saturated fatty acids were C14:0 and C16:0 acid, and the main polyunsaturated fatty acids were DPA and DHA. The content of DHA in Schizochytrium sp. DP-16 cells accounted for 28.784% of the total fatty acids.

marine fungus;Schizochytriumsp.; DHA; fermentation optimization; GC-MS

2015-05-16.

遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014026011).

徐 濤(1990-)，男，碩士研究生；通信作者：陳 明(1979-)，男，副教授.

TS225.6；Q815

A

1674-1404(2016)06-0411-05

XU Tao, DONG Tianfei, CHEN Ming, FAN Shengnan, SHI Chao. Optimization of fermentation process by a marine fungus strainSchizochytriumsp. DP-16 for DHA lipid production[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2016, 35(6): 411-415.