周仙杰,李 軍,魯飛翔,夏靖媛,劉慶春

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間歇式低氧對主動脈弓縮窄模型小鼠腸道菌群的影響

周仙杰1,李 軍2,魯飛翔1,夏靖媛1,劉慶春1

目的 了解間歇式低氧對主動脈弓縮窄(transverse aortic constriction, TAC)模型小鼠腸道菌群的影響。方法 18只C57 BL/6雄性小鼠隨機分為3組，假手術(shù)常氧組(C組)，主動脈弓縮窄模型常氧組(TC組)，主動脈弓縮窄模型低氧組(TH組)，每組各6只。間歇式低氧的條件為氧濃度10.5%，每天8 h低氧，16 h常氧，交替進行，連續(xù)10 d。獲取小鼠盲腸糞便中細菌DNA，經(jīng)16 S rDNA測序檢測小鼠盲腸糞便中微生物組成，應(yīng)用微生物生態(tài)學(xué)定量觀察進行生物信息學(xué)分析。結(jié)果 主動脈弓縮窄模型常氧組與假手術(shù)常氧組、主動脈弓縮窄模型低氧組相比，互營桿菌科顯示出更低的豐度。TC組與C組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)，TC組與TH組比較P=0.013。結(jié)論 間歇式低氧處理使主動脈弓縮窄模型小鼠腸道菌群發(fā)生了改變，這種改變對主動脈弓縮窄的進程是否有影響仍需進一步研究。

間歇式低氧；主動脈弓縮窄；腸道菌群

間歇式低氧是低氧和常氧反復(fù)交替周期循環(huán)的一種供氧模式[1]。間歇式低氧訓(xùn)練可用于適應(yīng)高海拔時的低氧環(huán)境和提高需氧耐受。同時可增加紅細胞總數(shù)和血紅蛋白濃度，降低運動時的心率反應(yīng)[2]。此外,間歇性低氧可增加心肌血管，冠狀動脈血流，心肌紅蛋白和增加抗氧化酶和應(yīng)激蛋白的表達[3]。本課題組動物實驗發(fā)現(xiàn)，主動脈弓縮窄模型小鼠心臟發(fā)生肥大且肺內(nèi)有炎性反應(yīng)細胞浸潤，間歇式低氧處理可以抑制主動脈弓縮窄(transverse aortic constriction，TAC)模型小鼠的心肌肥厚和肺部炎性反應(yīng)。通過基因和蛋白水平檢測發(fā)現(xiàn)，間歇式低氧處理后主動脈弓縮窄模型小鼠的S100A8和S100A9的表達量增加。S100A8和S100A9是固有免疫效應(yīng)分子抗菌肽的成員，同時也是鈣結(jié)合蛋白S100家族的成員[4]。鈣結(jié)合蛋白是炎性反應(yīng)性腸病的標(biāo)志物[5]，炎性反應(yīng)性腸病發(fā)生，細胞內(nèi)鈣結(jié)合蛋白的表達量會發(fā)生改變，同時宿主腸道菌群的組成和功能也會發(fā)生改變。腸道菌群可通過多條途徑參與免疫反應(yīng)，對炎性反應(yīng)的發(fā)生和抑制具有重要作用[6]。從菌對機體的影響來說，腸道內(nèi)微生物可分為致病菌、條件致病菌和益生菌等。從氧依賴的角度來說，腸道內(nèi)微生物主要包括專性厭氧菌、兼性厭氧菌和需氧菌，隨著宿主免疫狀態(tài)的改變，這些菌處于動態(tài)變化中。腸道菌群不僅可參與免疫調(diào)節(jié)，還可通過調(diào)節(jié)血壓，參與機體內(nèi)多種反應(yīng)的進行[7]。目前，間歇式低氧處理能否通過調(diào)節(jié)腸道菌群來抑制主動脈弓縮窄模型小鼠的心肌肥厚和肺部炎性反應(yīng)及其相關(guān)研究尚無報道。本研究將通過16S rDNA測序的方法檢測間歇式低氧處理后小鼠腸道內(nèi)微生物的組成，探討間歇式低氧處理后主動脈弓縮窄模型小鼠腸道菌群的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 選擇8～10周齡清潔級雄性C57BL/6小鼠18只，體重20～25 g。購自北京維通利華提供實驗動物技術(shù)有限公司，許可證編號為SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)于北京大學(xué)實驗動物中心，許可證編號 SYXK(京)2011-0003。按國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料喂養(yǎng)，動物自由攝食和飲水，光照為明暗12/12 h交替。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，動物隨機分為3 組，假手術(shù)常氧組(C組)，主動脈弓縮窄模型常氧組(TC組)，主動脈弓縮窄模型低氧組(TH組)，每組各6只。

1.2 方法

1.2.1 主動脈弓縮窄手術(shù) 將雄性C57BL/6小鼠麻醉后，去除頸部和胸部的毛，再用優(yōu)碘和酒精清洗后置于仰臥位，用加熱墊使溫度保持在37 ℃。水平切開0.5～1.0 cm胸骨上切跡皮膚。撥開胸腺，在胸骨近端處，縱向切割2～3 mm，為低放大倍率觀察主動脈弓提供視野。一端帶有圈套的線從右無名小管根部和左頸總動脈之間的主動脈下穿過，用6-0縫合線綁在圈套上將線從主動脈拉出。彎曲的27號針頭放于主動脈弓旁，然后緊貼針和主動脈周圍縫合。結(jié)扎后，迅速取出針。閉合皮膚，將小鼠放在暖墊上恢復(fù)，直到他們完全清醒[8-10]。假手術(shù)組，除不結(jié)扎，其他與主動脈弓縮窄組相同。

1.2.2 間歇式低氧處理 模型制作后，常規(guī)飼養(yǎng)第8天對TH組小鼠進行間歇式低氧干預(yù)。間歇式低氧條件為，通過制氮機(北京創(chuàng)文氣體有限公司)、凍干機(杭州超濾)和空氣壓縮機(美國英格索蘭) 共同作用將空氣中的氮氣通入動物飼養(yǎng)室內(nèi)達到10.5%的氧濃度(相當(dāng)于海拔4500 m的高度)，每天8 h低氧，16 h常氧，交替進行，連續(xù)10 d。C組和TC組小鼠在常規(guī)環(huán)境中飼養(yǎng)，氧濃度為21%。

1.2.3 小鼠盲腸糞便中細菌DNA的提取 間歇式低氧干預(yù)后，小鼠頸椎脫臼處死，稱取0.1～0.2 g小鼠盲腸糞便，提取細菌DNA。使用強力糞便DNA提取試劑盒，購自深圳市安必勝科技有限公司，按照說明書進行操作。通過瓊脂糖凝膠電泳和Qubit檢測來確定DNA的大小和質(zhì)量。TC組1只小鼠DNA樣品量未達到樣品測序要求，因此后續(xù)試驗TC組實驗動物數(shù)為5只。

1.2.4 PCR擴增和16S rDNA測序 小鼠盲腸糞便中細菌DNA提取和檢測后，將16S rDNA基因V4區(qū)進行PCR擴增，PCR引物為341F(5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’)和806R(5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’)。反應(yīng)程序為 98 ℃預(yù)變性1 min； 30 個循環(huán)(98 ℃，10 s；50 ℃，30 s；72 ℃，30 s)； 72 ℃，5 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物， GeneJET 膠回收試劑盒(購自Thermo Scientific 公司)純化2次。NEB Next? UltraTMDNA Library Prep Kit建庫試劑盒(購自New England Biolabs 公司)構(gòu)建文庫，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測，合格后，使用Illumina公司的HiSeq進行上機測序。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 對測序后得到的有效數(shù)據(jù)進行分類單元(operational Taxonomic Units，OTUs)聚類和物種分類分析，結(jié)合物種注釋信息，從而得到每組樣品的OTUs數(shù)和物種注釋的基本分析結(jié)果。再根據(jù)物種注釋結(jié)果，進行組間群落組成分析，挖掘組間樣品的物種組成差異[11,12]。

1.3 觀測指標(biāo) 測序后的序列進行分類聚類和物種注釋。通過各組總的序列數(shù)目、無法聚類到OTUs的序列數(shù)目、聚類到OTUs但沒有獲得注釋信息的序列數(shù)目和構(gòu)建到OTUs且獲得注釋信息的序列數(shù)目，了解測序的基本情況。根據(jù)注釋結(jié)果，計算香農(nóng)指數(shù)(Shannon)和Chao1指數(shù)，用以評估樣品組間微生物群落的平均多樣性和豐富度。根據(jù)各組樣品OTUs(物種)數(shù)目，獲得組間共有的物種數(shù)和特有的物種數(shù)。同時通過分析不同細菌水平樣品中微生物的組成，獲得門、科和屬三個細菌水平上，相對豐度較高的菌的組成，并篩選差異菌。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠體重的變化 實驗處理前后，小鼠體重C組和TC組、TC組和TH組組間均無統(tǒng)計學(xué)差異。處理后C組和TC組小鼠體重與各自處理前相比無統(tǒng)計學(xué)差異，但TH組間歇式低氧處理后與處理前相比小鼠體重有增加的趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 主動脈弓縮窄模型小鼠低氧處理前后體重比較 ；g)

注：C組. 假手術(shù)常氧組；TC組. 主動脈弓縮窄模型常氧組；TH組. 主動脈弓縮窄模型低氧組；P1. 處理前組間P值；P2. 處理后組間P值；P3. 各組處理前后P值

2.2 間歇式低氧組和常氧組小鼠腸道菌群多樣性評估 將測序后C組獲得的41 505條序列，TC組獲得的42 739條序列和TH組獲得的39 072條序列進行分類單元(OTUs)聚類和注釋，其中C組有38 664條序列，TC組有41 143條序列，TH組有37 491條序列構(gòu)建到OTUs且獲得注釋信息，TC組和C組比較P值為0.661，TH組和TC組比較P值為0.296，各組聚類和注釋情況見圖1。根據(jù)聚類和注釋結(jié)果，利用α-多樣性指數(shù)，香農(nóng)指數(shù)(Shannon)和Chao1評估樣品組間微生物群落的平均多樣性和豐富度，見表2。TC組和C組比較，TH組和TC組比較，均無統(tǒng)計學(xué)差異。說明本研究處理條件下樣品組間微生物群落的平均多樣性和豐富度并未發(fā)生改變。將構(gòu)建到OTUs且獲得注釋信息的序列均一化處理之后進行后續(xù)分析。C組有827個OTU，TC組有704個OTU，TH組有777個OTU用于分析。其中C組、TC組和TH組共有的OTUs數(shù)目為578，C組和TC組共有的OTUs數(shù)目為69，C組和TH組共有的OTUs數(shù)目為113，TC組和TH組共有的OTUs數(shù)目為39。C組、TC組和TH組特有的OTUs數(shù)目分別為67、18和47。不同組間共有和特有的OTU數(shù)目(物種數(shù)目)，見圖2。

2.3 間歇式低氧組和常氧組小鼠糞便樣本中微生物16S rDNA序列分析 根據(jù)OTUs的注釋結(jié)果，分析不同細菌水平樣品中微生物的組成。在門水平， 相對豐度較高的菌為擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門，見圖3。TC組和C組相比，擬桿菌門的相對豐度為0.404和0.428，厚壁菌門的相對豐度為0.302和0.357，變形菌門的相對豐度為0.27和0.202，組間均無顯著性差異。TH組和TC組相比，擬桿菌門的相對豐度為0.447和0.404，變形菌門的相對豐度為0.25和0.27，組間均無顯著性差異。厚壁菌門的相對豐度為0.258和0.302，與TC組相比，TH組厚壁菌門的相對豐度有降低趨勢，差異顯著，但厚壁菌門與擬桿菌門相對豐度的比值并無顯著性差異。在科水平，組間有差異的細菌主要是乳酸桿菌科和互營桿菌科，見表3。與C組相比，TC組乳酸桿菌科和互營桿菌科的相對豐度有降低的趨勢，差異有顯著性。與TC組相比，TH組互營桿菌科的相對豐度有增加的趨勢，差異有顯著性。TC組和C組、TH組比較，互營桿菌科的相對豐度具有顯著性差異。在屬水平，TC組和C組相比，有顯著性差異的菌屬為乳桿菌屬(P=0.045)，梭菌屬(P=0.034)和吉氏副擬桿菌屬(P=0.045)。同時TC組相比于C組乳桿菌屬和梭菌屬的相對豐度降低，吉氏副擬桿菌屬的相對豐度增加。TH組和TC組相比，有顯著性差異的菌屬為Butyricicoccus，P=0.028，且TH組Butyricicoccus的相對豐度較低。本研究，TC組和C組比較，主要的菌門的相對豐度未發(fā)現(xiàn)顯著性變化，但科水平上乳酸桿菌科和互營桿菌科的相對豐度發(fā)生改變，同時屬水平上吉氏副擬桿菌屬、乳桿菌屬和梭菌屬的相對豐度發(fā)生改變。TH組和TC組比較，主要的菌門中厚壁菌門的相對豐度發(fā)生改變，但厚壁菌門與擬桿菌門相對豐度的比值并未發(fā)生改變。主要的菌科中互營桿菌科的相對豐度發(fā)生改變，且主要的菌屬中Butyricicoccus的相對豐度發(fā)生改變。因此TC組和C組、TH組相比，互營桿菌科的相對豐度有降低趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 C組、TC組和TH組樣品OTUs聚類

注：Total_Tag：測序后各組總的序列數(shù)目；Unique_Tag：無法聚類到OTUs的序列數(shù)目；Unclassified_Tag：聚類到OTUs但沒有獲得注釋信息的序列數(shù)目；Taxon_Tag：構(gòu)建到OTUs且獲得注釋信息的序列數(shù)目

組別nChao1P1ShannonP2C組6518.00±56.28-6.17±0.41-TC組5483.20±91.680.4585.60±0.550.08TH組6462.33±45.030.6335.67±1.030.991

注：C組. 假手術(shù)常氧組；TC組. 主動脈弓縮窄模型常氧組；TH組. 主動脈弓縮窄模型低氧組；P1. Chaol組間P值；P2. Shannan組間P值

圖2 C組、TC組和TH組樣品OTUs(物種)數(shù)目

注： C組、TC組和TH組共有的OTUs為578個； C組和TC組共有的OTUs為69個； C組和TH組共有的OTUs為113個； TC組和TH組共有的OTUs為39個

表3 C組、TC組和TH組科水平物種的相對豐度

注：C組. 假手術(shù)常氧組；TC組. 主動脈弓縮窄模型常氧組；TH組. 主動脈弓縮窄模型低氧組；P1. Lactobacillaceae組間P值；P2. Odoribacteraceae組間P值；P3. Syntrophobacteraceae組間P值

3 討 論

本研究運用16S rDNA測序的方法檢測了間歇式低氧處理后主動脈弓縮窄模型小鼠腸道微生物的組成。間歇式低氧處理后TH組小鼠體重與處理前相比顯著性增加。此外TC組和C組、TH組相比，Syntrophobacteraceae的相對豐度有降低趨勢，有統(tǒng)計學(xué)差異。有研究顯示持續(xù)性低氧可能影響蛋白質(zhì)的代謝，導(dǎo)致體重的丟失[13]。本研究間歇式低氧處理后小鼠體重出現(xiàn)增加的趨勢，這表明間歇式低氧模式可能對小鼠具有有利的影響，其因果關(guān)系仍需進一步研究。此外，本研究結(jié)果顯示，門水平上，相對豐度較高的菌為擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門，這與其他腸道微生物相關(guān)研究的結(jié)果是一致的。主動脈弓縮窄模型常氧組與假手術(shù)常氧組相比，科水平上，Lactobacillaceae、Odoribacteraceae和Syntrophobacteraceae的相對豐度發(fā)生改變。屬水平上Lactobacillus、Odoribacter、Clostridium和Parabacteroides的相對豐度發(fā)生改變。Lactobacillus對血壓的影響目前還存在爭議，Odoribacter和Parabacteroides與主動脈弓縮窄相關(guān)研究尚未見報道，Lactobacillus、Odoribacter和Parabacteroides與主動脈弓縮窄的關(guān)系仍需進一步研究。Clostridium屬于厭氧芽孢桿菌，在主動脈弓縮窄組顯著性減少，間歇式低氧組未出現(xiàn)降低趨勢。其下屬的丁酸梭菌可以促進腸道有益菌的增值和抑制有害菌的繁殖，其代謝產(chǎn)物丁酸對腸上皮組織和鈉的吸收具有促進作用，對血壓具有一定的影響。間歇式低氧處理后相對豐度發(fā)生改變的菌主要是Syntrophobacteraceae和Butyricicoccus。低氧處理后Syntrophobacteraceae的相對豐度有增加的趨勢。Syntrophobacteraceae屬于厭氧互營菌，參與丙酸鹽向乙酸鹽、二氧化碳和氫氣等有機物的降解過程，可以為其他微生物提供基質(zhì)[14]。同時有研究顯示，依賴腸道菌群產(chǎn)生的丙酸鹽可通過嗅覺受體78(Olfr78)和G蛋白偶聯(lián)受體41(Gpr41)調(diào)節(jié)血壓[15]。Butyricicoccus可以代謝產(chǎn)生丁酸鹽，間歇式低氧Butyricicoccus相對豐度降低，這與已報道的Butyricicoccus的相關(guān)研究結(jié)果不一致。這可能與Butyricicoccus的活性受到抑制相關(guān)，有待進一步研究驗證。實驗結(jié)果顯示相對豐度發(fā)生改變的菌多是厭氧菌，間歇式低氧處理可能通過改變小鼠腸道內(nèi)氧氣的濃度，提高厭氧菌耐受和代謝，通過小鼠腸道內(nèi)微生物組成的改變及其產(chǎn)物的代謝對主動脈弓縮窄小鼠的血壓和炎性反應(yīng)等具有一定的影響。間歇式低氧處理是如何通過調(diào)節(jié)腸道菌群來抑制主動脈弓縮窄模型小鼠的心肌肥厚和肺部炎性反應(yīng)的相關(guān)內(nèi)容仍需進一步研究。

[1] Neubauer J A. Invited review: physiological and pathophysiological responses tointermittent hypoxia[J]. J Appl Physiol, 2001,90(4):1593-1599.

[2] Casas M, Casas H, Pagés T，etal. Intermittent hypobaric hypoxia induces altitude acclimation and improves the lactate threshold[J]. Aviat Space Environ Med,2000,71(2):125-130.

[3] Zhuang J, Zhou Z. Protective effects of intermittent hypoxic adaptation onmyocardium and its mechanisms[J]. Biol Signals Recept,1999,8(4-5):316-322.

[4] Zou X, Sorenson B S, Ross K F，etal. Augmentation of epithelial resistance to invading bacteria by using mRNA transfections[J]. Infect Immun, 2013,81(11):3975-3983.

[5] R?seth A G, Schmidt P N, Fagerhol M K. Correlation between faecal excretion ofindium-111-labelled granulocytes and calprotectin, a granulocyte marker protein, in patients with inflammatory bowel disease[J]. Scand J Gastroenterol,1999,34(1):50-54.

[6] Cammarota G, Ianiro G, Cianci R，etal. The involvement of gut microbiota in inflammatory bowel disease pathogenesis: potential for therapy[J]. Pharmacol Ther,2015,149:191-212.

[7] Honour J W. Historical perspective: gut dysbiosis and hypertension[J]. Physiol Genomics, 2015,47(10):443-446.

[8] Faerber G, Barreto-Perreia F, Schoepe M，etal. Induction of heart failure by minimally invasive aortic constriction in mice: reduced peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator levels and mitochondrial dysfunction[J]. J Thorac Cardiovasc Surg,2011,141(2):492-500.

[9] Chen Y, Guo H, Xu D，etal. Left ventricular failure produces profound lung remodeling and pulmonary hypertension in mice: heart failure causes severe lung disease[J]. Hypertension,2012,59(6):1170-8.

[10] 李 軍,尚海豹,劉慶春，等. 微創(chuàng)手術(shù)致主動脈弓狹窄在小鼠心力衰竭模型制作中的應(yīng)用[J]. 山東醫(yī)藥,2014, 54(12):5-7.

[11] 汪小軍,李 鑫,李 瑾，等.膀胱癌全腹膜外回腸膀胱術(shù)術(shù)式改良探討[J].武警醫(yī)學(xué),2016,27(4):334-338.

[12] Moreno-Indias I, Torres M, Montserrat J M，etal. Intermittent hypoxia alters gut microbiota diversity in a mouse model of sleep apnoea[J]. Eur Respir J, 2015,45(4):1055-1065.

[13] Kayser B. Nutrition and high altitude exposure[J]. Int J Sports Med,1992,13(Suppl 1) :S129-132.

[14] Plugge C M, Henstra A M, Worm P，etal. Complete genome sequence of Syntrophobacter fumaroxidans strain (MPOB(T)[J]. Stand Genomic Sci, 2012,7(1):91-106.

[15] Pluznick J L, Protzko R J, Gevorgyan H，etal. Olfactory receptor responding to gut microbiota-derived signals plays a role in renin secretion and blood pressureregulation[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2013,110(11):4410-4415.

(2016-05-11收稿 2016-09-23修回)

(責(zé)任編輯 郭 青)

Effect of intermittent hypoxia on transverse aortic constriction of intestinal flora in a murine model

ZHOU Xianjie1,LI Jun2, LU Feixiang1, XIA Jingyuan1, and LIU Qingchun1.1.General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force,Beijing 100039,China;2.Laboratory Animal Center, Peking University, Beijing 100871, China

Objective To study the influence of intermittent hypoxia on transverse aortic constriction (TAC) of intestinal flora in a murine model.Methods Eighteen C57BL/6 mice were evenly and randomly divided into three groups: Group C, Group TC and Group TH. Twelve of these mice were subjected to transverse aortic constriction and six model mice to a pattern of intermittent hypoxia (8 h at 10.5% O2 and 16 h at room air) for 10 days. Twelve mice served as normoxic controls. Faecal samples were obtained and microbiome composition was determined by 16 S rDNA pyrosequencing and bioinformatics analysis by Quantitative Insights into Microbial Ecology.Results A lower abundance of Syntrophobacteraceae was detected in the normoxic-exposed transverse aortic constriction model mice than in controls.The difference between TC and C was of statistical significance (P=0.004), but wasP=0.013 between TC and TH.Conclusion sIntermittent hypoxia can alter intestinal flora in a mouse model. Whether this change has influence on the progress of the transverse aortic constriction needs to be further studied.

intermittent hypoxia；transverse aortic constriction；intestinal flora

周仙杰，碩士研究生。

1.100039 北京，武警總醫(yī)院采購中心;2.100871，北京大學(xué)實驗動物中心

劉慶春，E-mail：lqc@vip.163.com

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