顧以韌，李智，梁艷，楊雪梅，陶璇，鐘志君，陳曉暉，呂學(xué)斌

（1.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川成都610066；2.瀘縣畜牧局，四川瀘州646100）

不同豬種初乳外核體中免疫相關(guān)miRNA的鑒定

顧以韌1，李智2，梁艷1，楊雪梅1，陶璇1，鐘志君1，陳曉暉1，呂學(xué)斌1

（1.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川成都610066；2.瀘縣畜牧局，四川瀘州646100）

母乳是嬰兒最重要的食物來(lái)源，對(duì)嬰兒的健康發(fā)育特別是后天免疫的形成有著至關(guān)重要的作用，乳質(zhì)量形成的分子基礎(chǔ)已成為當(dāng)今生物學(xué)科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。試驗(yàn)采用第2代高通量測(cè)序技術(shù)（Solexa測(cè)序）對(duì)大約克夏豬和梅山豬初乳外核體中miRNA進(jìn)行了鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫相關(guān)的miRNA在初乳中呈現(xiàn)富集現(xiàn)象，且梅山豬初乳外核體中的數(shù)量極顯著高于大約克夏豬（P＜0.01），而在大約克夏豬個(gè)體間差異不顯著，說(shuō)明梅山豬對(duì)疾病的抵抗力高于大約克夏豬。此試驗(yàn)可為深入研究母乳在嬰兒免疫系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中的基本功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

豬；初乳；外核體；miRNA

母乳有初乳和常乳之分，初乳比常乳具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，它傳遞了被動(dòng)免疫保護(hù)以及母源的代謝調(diào)節(jié)信號(hào)，對(duì)新生后代早期的存活和生長(zhǎng)發(fā)育起著重要的作用[1]。畜牧業(yè)生產(chǎn)中，吃不到母乳的幼畜很難成活，而吃不足母乳或吃不到初乳者抗病力弱，更易患病。目前，對(duì)影響乳質(zhì)量的常規(guī)成分已經(jīng)有了較為系統(tǒng)和深入的研究，但在母乳提高機(jī)體免疫能力、增強(qiáng)對(duì)疾病抵抗能力以及在幼兒消化系統(tǒng)中存在抗性的分子機(jī)理的研究還遠(yuǎn)不夠系統(tǒng)和深入，且主要集中關(guān)注DNA和mRNA水平的蛋白編碼基因。miRNA是一類內(nèi)源性的、長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的非編碼小分子RNA，它們廣泛存在于多種真核生物體中，通過(guò)與靶mRNA的3'UTR互補(bǔ)結(jié)合，可降解該mRNA或抑制其翻譯，其在基因表達(dá)調(diào)控、生物個(gè)體發(fā)育、代謝、疾病發(fā)生和免疫調(diào)控等生理過(guò)程中均發(fā)揮著重要的作用[2-3]。然而，乳成分十分復(fù)雜，并非乳中所有的miRNA在進(jìn)入新生兒消化系統(tǒng)后均能被消化吸收。研究認(rèn)為乳中的miRNA可分為兩部分：一部分為游離于乳汁中的，沒(méi)有任何保護(hù)的裸露的miRNA；另一部分是被稱作外核體（Exosome）包被的miRNA。Exosome是一類直徑約30～100 nm廣泛存在各種體液中的小囊泡體，可以保護(hù)其中包被的miRNA、mRNA和蛋白質(zhì)，還能參與細(xì)胞之間信息的傳遞和物質(zhì)的交換，甚至在植物性食品和人體之間進(jìn)行交流[4-6]。當(dāng)母乳進(jìn)入新生兒的胃內(nèi)以后，那些裸露于乳汁中的、沒(méi)有外核體保護(hù)的miRNA將被胃內(nèi)極酸的微環(huán)境迅速降解，而不能被新生兒的消化系統(tǒng)吸收利用，只有那些被外核體包被的miRNA才能在胃內(nèi)極酸環(huán)境下避免被降解，最終被新生兒消化系統(tǒng)吸收，從而對(duì)新生兒免疫系統(tǒng)的完善、保持機(jī)體正常發(fā)育起重要調(diào)控作用。故研究母乳外核體中的miRNA比僅籠統(tǒng)的研究全乳中miRNA更能準(zhǔn)確反映母乳是如何調(diào)控新生兒免疫系統(tǒng)發(fā)育的。采用Solexa測(cè)序技術(shù)對(duì)中外不同豬種初乳外核體中miRNA進(jìn)行了鑒定，并篩選出與免疫功能密切相關(guān)的miRNA，有助于探明不同豬種初乳在調(diào)控仔豬機(jī)體免疫方面存在明顯差異的分子機(jī)制，并為深入研究乳質(zhì)量形成的分子基礎(chǔ)提供必要的基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及樣本采集

選取健康狀況良好的3頭經(jīng)產(chǎn)大約克夏母豬和1頭梅山母豬，在分娩時(shí)立刻采集試驗(yàn)所需的母豬乳樣本，每頭豬采集2份母乳樣本（每份3～5 mL），并將其保存在液氮中用于后續(xù)試驗(yàn)。試驗(yàn)時(shí)間為2014年6—12月，試驗(yàn)地點(diǎn)為四川省畜牧科學(xué)研究院種豬科研基地。

1.2 外核體沉淀及RNA提取

首先吸取母乳1.5 mL 2 000 g/min離心10 min去除乳中的脂肪球，上清液再經(jīng)過(guò)12 000 g/min離心30 min去除細(xì)胞碎屑等雜質(zhì)，然后按照2∶1的比例加入ExoQuick Exosome Precipitation Solution（SBI,CA, USA）4℃孵育12 h后進(jìn)行1 500 g/min離心30 min獲得Exosome顆粒沉淀，用250 μL左右的RNAfree水將Exosome沉淀溶解后再用TRIzol?LS Reagent（美國(guó)Invitrogen公司）按照說(shuō)明書(shū)從Exosome中提取高質(zhì)量的RNA。提取得到的該RNA樣品經(jīng)過(guò)AgilentBioanalyzer 2100檢測(cè)后用于下游試驗(yàn)。

1.3 miRNA的高通量測(cè)序及免疫密切相關(guān)的miRNA的篩選

采用美國(guó)Illumina公司開(kāi)發(fā)的高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)通過(guò)上述方法提取得到的母乳RNA樣品進(jìn)行miRNA深度測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)初處理和生物信息學(xué)分析后鑒定出豬乳外核體中的miRNA，該部分由美國(guó)LC公司完成。對(duì)鑒定出的miRNA結(jié)合Pathway Central database（SABiosciences,MD,USA）（http://www.sabiosciences.com/mirna_pcr_array.php）數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)miRNA功能的注釋，在豬乳外核體中篩選與免疫功能密切相關(guān)（與數(shù)據(jù)庫(kù)中的Immunopathology,InflammatoryResponseandAutoimmunity,T-Cell&BCell Activation 3部分功能相對(duì)應(yīng)）的miRNA。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)結(jié)果采用Sigmaplot12.0的x2-test程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

由圖1可知，在3頭大約克夏豬母乳外核體中共檢測(cè)到的miRNA數(shù)量分別為147、153和159種，其中免疫相關(guān)的miRNA（SABiosciences database）數(shù)量分別為52、56和56條，分別占鑒定的miRNA總數(shù)的35.37%、36.60%和35.22%。梅山豬母乳外核體中共檢測(cè)到miRNA 146種，其中免疫相關(guān)的miRNA數(shù)量為81種，占被鑒定的miRNA總數(shù)55.48%。以上結(jié)果說(shuō)明，無(wú)論在大約克夏豬還是梅山豬中，免疫相關(guān)的miRNA在其初乳外核體中均存在明顯的富集現(xiàn)象，這也與我們之前對(duì)不同泌乳期豬乳外核體中miRNA的鑒定結(jié)果一致[7]。這些免疫相關(guān)的miRNA在初乳中由于受到外核體的保護(hù)而使其能夠在外界極端惡劣條件下不被降解，其調(diào)控功能主要涉及到免疫病理、炎癥反應(yīng)和自身免疫、T細(xì)胞和B細(xì)胞活性等方面，因此初生仔豬及時(shí)吮吸初乳可促進(jìn)自身機(jī)體免疫系統(tǒng)的快速建立并迅速增強(qiáng)其對(duì)疾病的抵抗能力。顯著性統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，免疫相關(guān)的miRNA在梅山豬初乳外核體中的數(shù)量極顯著高于大約克夏豬（P＜0.01），而在大約克夏豬個(gè)體間差異不顯著，這說(shuō)明同等情況下梅山豬仔豬可能比引進(jìn)豬種—大約克夏豬更早建立起完善的自身免疫系統(tǒng)，其對(duì)疾病的抵抗力也高于大約克夏豬。我們推測(cè)豬乳中的這些與免疫相關(guān)的miRNA是通過(guò)仔豬消化道被吸收，進(jìn)而對(duì)幼畜的免疫系統(tǒng)發(fā)揮調(diào)控功能的，這也與我國(guó)梅山豬的抗逆性優(yōu)于國(guó)外豬種大約克夏豬的種質(zhì)特性相一致。本研究不僅可為乳的研究提供新的思路，而且可為豬的抗病育種提供可靠的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

圖1 大約克夏豬和梅山豬母乳外核體中免疫相關(guān)miRNA

[1]Paramasivam K,Michie C,Opara E,et al.Human breast milk immunology:a review[J].Int J Fertil Womens Med,2006,51:208-217.

[2]Bartel D P.MicroRNAs:target recognition and regulatory functions[J].Cell,2009,136:215-233.

[3]Xiao C,Rajewsky K.MicroRNA control in the immune system: basic principles[J].Cell,2009,136:26-36.

[4]Mathivanan S,Ji H,Simpson R J.Exosomes:extracellular organelles important in intercellular communication[J].J Proteomics,2010, 73:1907-1920.

[5]Zhou Q,Li M,Wang X,et al.Immune-related microRNAs are abundant in breast milk exosomes[J].Int J Biol Sci,2012,8:118-123.

[6]Admyre C,Johansson S M,Qazi K R,et al.Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk[J].J Immunol,2007,179:1969-1978.

[7]Gu Y,Li M,Wang T,et al.Lactation-related microRNA expression profiles of porcine breast milk exosomes[J].PloS ONE, 2012,7(8):e43691.

（編輯：富春妮）

Identification of Immune-Related MicroRNA in Porcine Colostrum Exosomes of Yorkshire and Meishan Pigs

GU Yiren1,LI Zhi2,LIANG Yan1,YANG Xuemei1,TAO Xuan1,ZHONG Zhijun1,CHEN Xiaohui1,LV Xuebin1
(1.Sichuan Aniamal Science Academy,Chengdu 610066,China; 2.Lu County Animal Husbandry Bureau,Luzhou 646100,China)

Breast milk,the primary source of nutrition for newborns,plays important roles in infant's growth and is crucial for the development of the post-natal immune system.It is of great interest to decipher the molecular mechanism of breast milk quality which is beneficial for immune diseases researches.Here,we analyzed the immune related miRNA in porcine colostrum by a deep sequencing and found that immune related miRNAs are present and enriched in breast milk exosomes.Notably,these exosomal immune related miRNAs are present in higher numbers in the colostrums of Meishan pigs than the Yorkshires pigs(P＜0.01).These observations are a prelude to in-depth investigations of the essential roles of breast milk in the development of the infant's immune system.

pig;colostrum;exosome;miRNA

S828

A

1002-1957(2016)02-0060-02

2016-03-10

國(guó)家自然科學(xué)基金（31301942）；四川省畜牧科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（SASA2014A08）；國(guó)家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系—綜合試驗(yàn)站（CARS-36）

顧以韌（1980-），男，江蘇響水人，副研究員，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種.E-mail:guyiren1128@163.com

呂學(xué)斌（1965-），男，研究員，博士，研究方向?yàn)樨i的遺傳育種.E-mail:lvxuebin@21cn.com