高 茜,謝 穎,黃海濤,倪紅梅,李雪梅,管 瑩,米其利,夭建華,*

(1.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司,云南昆明 650106; 2.云南中醫(yī)學(xué)院,云南昆明 650500)

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滇橄欖對(duì)人口腔唾液流率、pH及細(xì)菌的影響研究

高 茜1,謝 穎2,黃海濤1,倪紅梅1,李雪梅1,管 瑩1,米其利1,夭建華1,*

(1.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司,云南昆明 650106; 2.云南中醫(yī)學(xué)院,云南昆明 650500)

目的:研究滇橄欖對(duì)人體口腔唾液流率、pH及口腔細(xì)菌的影響。方法:分時(shí)段采集10名志愿者咀嚼滇橄欖前、咀嚼滇橄欖期間、咀嚼滇橄欖后的唾液,檢測(cè)志愿者唾液流率及pH的變化,同時(shí)采用熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)唾液中的總細(xì)菌及變形鏈球菌含量。結(jié)果:與咀嚼前相比,咀嚼滇橄欖后志愿者分泌唾液的量顯著增加,唾液的pH先降低后升高,口腔內(nèi)細(xì)菌及變形鏈球菌的數(shù)目有所減少。結(jié)論:滇橄欖有促進(jìn)人體口腔唾液分泌的作用,可以有效減少口腔內(nèi)的細(xì)菌總數(shù)及變形鏈球菌數(shù)量,有一定預(yù)防齲齒的效果。

滇橄欖,唾液流率,熒光定量PCR實(shí)驗(yàn),齲齒

口腔是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境,唾液對(duì)于維持口腔內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)起著至關(guān)重要的作用[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)干燥綜合征(SS)、藥物、放射性治療、糖尿病、高血壓等都可導(dǎo)致涎腺分泌功能減弱,唾液流率明顯偏低[2-5]。唾液處在溫暖、黑暗的口腔里,構(gòu)成了病菌、病毒和其他菌類的理想生存環(huán)境[6]。變形鏈球菌為革蘭氏染色陽(yáng)性的球菌,是主要的致齲菌,可促進(jìn)菌斑的形成,從而導(dǎo)致齲齒的形成[7-8]。

滇橄欖又名余甘果,系大戟科葉下珠屬植物余甘子(PhyllanthusemblicaLinn)的干燥成熟果實(shí)[9]。滇橄欖果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富,含有12種維生素、16種微量元素、16種氨基酸、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、多酚、糖類等[10]。滇橄欖果實(shí)微寒微苦、甘、酸澀,具有健胃、消食、潤(rùn)肺、生津、收斂止瀉、清熱降火、解毒、抗氧化[11]、消滯止咳、解除疲勞等作用[12],另一方面,滇橄欖中含有豐富的余甘子酸、黏酸等成分,具有較強(qiáng)的抗菌作用[13]。文獻(xiàn)表明用超臨界CO2萃取的余甘子精油對(duì)常見食品污染菌具有很好的抑制作用[14]。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物及探針

Table 1 The primers and probes of Real-time quantitative PCR

引物及探針序列5′-3′變形鏈球菌Forwardprimer5′GCCTACAGCTCAGAGATGCTATTCT-3′Reverseprimer5′-GCCATACACCACTCATGAATTGA-3′探針FAM-TGGAAATGACGGTCGCCGTTATGAA-TAMRA引物及探針序列5′-3′細(xì)菌通用Forwardprimer5′-CGCTAGTAATCGTGGATCAGAATG-3′Reverseprimer5′-TGTGACGGGCGGTGTGTA-3′探針FAM-CACGGTGAATACGTTCCCGGGC-TAMRA

滇橄欖被聯(lián)合國(guó)衛(wèi)生組織制定為在全世界推廣種植的三種保健植物之一[12]。近年來(lái),對(duì)滇橄欖功能因子的研究及其相應(yīng)功能的食品的開發(fā)越來(lái)越受到重視,但對(duì)于滇橄欖對(duì)人口腔生津作用、pH改變及抗菌作用的研究仍較少。本實(shí)驗(yàn)的主要目的是采用檢測(cè)志愿者唾液流率的變化來(lái)研究滇橄欖的生津功效,并檢測(cè)唾液的pH改變情況。同時(shí)采用了熒光定量PCR方法研究咀嚼滇橄欖對(duì)口腔內(nèi)微生物的影響,以期為滇橄欖的開發(fā)使用提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明市年齡為20～24歲的在校大學(xué)生健康人群,按照如下納入、排除標(biāo)準(zhǔn)篩選實(shí)驗(yàn)對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):無(wú)全身系統(tǒng)性疾病;牙齒完整,咬合關(guān)系正常;口腔衛(wèi)生良好,牙周健康;無(wú)未經(jīng)治療的齲齒;無(wú)口腔軟組織疾病,無(wú)長(zhǎng)期服藥史;不使用含氟牙膏及漱口水;實(shí)驗(yàn)前2周全身及口腔局部未使用抗生素。排除標(biāo)準(zhǔn):進(jìn)行正畸治療者;實(shí)驗(yàn)中需要服用抗菌藥物者。按照以上納入、排除標(biāo)準(zhǔn),最終篩選出10名受試者,其中男性8名,女性2名。

滇橄欖果實(shí) 云南昆明;變形鏈球菌引物及探針、細(xì)菌通用引物及探針 Invitrogen;(表1)、熒光定量PCR試劑盒 KAPATMProbe;微生物裂解液 Takara;熒光定量PCR96孔板、熒光定量PCR96孔板膜 Biotipsci;無(wú)水乙醇 西隴化工;標(biāo)準(zhǔn)菌株:變形鏈球菌ATCC25175。

LC480熒光定量PCR系統(tǒng) 瑞士Roche公司;3-18K高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司;HH-S26s恒溫水浴鍋 上海博訊公司;臺(tái)式pH計(jì)，XS204分析天平 瑞士Mettler公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 唾液采集 采集唾液在安靜的房間里進(jìn)行,受試者平坐于椅上,上身稍前傾,手持帶漏斗的量杯,將口內(nèi)分泌的唾液外吐于量杯內(nèi),且受試者在實(shí)驗(yàn)前2周和實(shí)驗(yàn)期間未服用抗生素類藥物及影響唾液分泌的藥物,實(shí)驗(yàn)前2 h禁食、禁刷牙、漱口和吸煙。每位受試者分別給予(12±0.5) g滇橄欖果實(shí)一枚。采集唾液的方法為吐取法:使唾液在口底聚集,受試者每隔一定時(shí)間將其通過(guò)玻璃漏斗吐入15 mL離心管。采集唾液的總持續(xù)時(shí)間為22 min。具體時(shí)間段為:0～2、2～4、4～6、6～8、8～10、20～22 min。受試者開始咀嚼橄欖的時(shí)間為2 min,在10 min時(shí)停止咀嚼,從第10 min到第20 min中的這10 min為洗脫時(shí)間,咀嚼時(shí)間共持續(xù)8 min。

1.2.2 唾液流率及pH的測(cè)定 將采集好唾液稱重并記錄,計(jì)算不同時(shí)間段的平均唾液流率,并用pH計(jì)測(cè)量不同時(shí)間點(diǎn)的唾液pH。唾液流率計(jì)算公式如下:

每個(gè)時(shí)間段內(nèi)唾液流率(g/min)=該時(shí)段內(nèi)的唾液分泌重量(g)/收集時(shí)間(min)

1.2.3 DNA提取 實(shí)驗(yàn)方法參見文獻(xiàn)[15]:取各個(gè)志愿者的唾液0.5 mL置于無(wú)菌1.5 mL EP管中,將EP管中唾液進(jìn)行4 ℃離心10 min(12000 r/min),去除上清液,再加入50 μL微生物PCR專用裂解緩沖液于EP管中,混合均勻,然后置于80 ℃水浴鍋中熱變性15 min,低速離心1 min(1000 r/min),最后取上清液與無(wú)菌水按1∶8比例稀釋后作為熒光定量PCR的模板。

1.2.4 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn) 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)方法參見文獻(xiàn)[16]:反應(yīng)體系共20 μL,其中2×mix 10 μL、上下游引物各200 nmol/L、探針250 nmol/L、無(wú)菌水1.475 μL、模板(上清液)8 μL且混合均勻。反應(yīng)條件參見文獻(xiàn)[16]為:預(yù)變性95 ℃ 5 min,變性95 ℃ 15 s,退火/延伸 60 ℃ 1 min,進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。分別將通用菌(通用菌采用牙齦卟啉單胞菌、變形鏈球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的混合菌)和變形鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)品DNA按10倍梯度稀釋作為模板進(jìn)行定量PCR,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)樣本檢測(cè)均重復(fù)3次,取其平均值,每次反應(yīng)均設(shè)空白對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 唾液流率結(jié)果

志愿者在咀嚼滇橄欖之前(0～2 min)的平均靜態(tài)唾液流率為1.16 g/min。在咀嚼滇橄欖后2 min(2～4 min)中唾液流率達(dá)到峰值(3.10 g/min),是靜態(tài)唾液流率的2.7倍。隨著咀嚼時(shí)間的延長(zhǎng),唾液流率逐漸降低,但仍高于靜止?fàn)顟B(tài),20～22 min的唾液流率(1.53 g/min)是靜態(tài)唾液流率的1.32倍(圖1)。

表2 唾液中變形鏈球菌數(shù)量變化趨勢(shì)表

Table 2 Change trend of the number ofStreptococcusmutansin saliva

志愿者編號(hào)唾液中變形鏈球菌數(shù)量(不同時(shí)間段)0～2min2～4min4～6min6～8min8～10min20～22min1NNNNNN2035×102±001×102NNNNN3208×102±007×102NNNN046×102±006×1024036×102±002×102NNNNN5NNNNNN6040×102±000×102NNNN005×102±001×102714921×102±213×1023051×102±093×102NNN043×102±022×1028NNNNNN9051×102±000×102047×102±000×102NNN008×102±001×10210NNNNNN

圖1 唾液流率變化圖Fig.1 Change of saliva flow rate

注:N表示未檢出。2.2 pH檢測(cè)結(jié)果

志愿者在咀嚼滇橄欖之前的靜態(tài)唾液的pH平均值為7.07。咀嚼滇橄欖后唾液pH呈下降趨勢(shì),在2～4 min降到最低值(4.17),隨著咀嚼時(shí)間的延長(zhǎng),唾液pH又呈上升趨勢(shì),20～22 min時(shí)唾液pH達(dá)到所有時(shí)間段里的最高值(7.67),即停止咀嚼滇橄欖后的唾液pH為最大值,高于靜止?fàn)顟B(tài)的pH(p<0.01)(圖2)。

圖2 唾液pH變化圖Fig.2 pH change of saliva

2.3 熒光定量PCR的檢測(cè)結(jié)果

變形鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3,受試者唾液中的變形鏈球菌的含量變化見表2:在咀嚼滇橄欖之前,10個(gè)受試者唾液中有6個(gè)檢測(cè)出變形鏈球菌,測(cè)出的唾液中變形鏈球菌平均含量為25.49×102個(gè)/mL,在咀嚼滇橄欖10 min后(20～22 min時(shí)段)有4個(gè)受試者唾液檢出變形鏈球菌,變形鏈球菌平均含量為0.26×102個(gè)/mL,低于咀嚼滇橄欖之前的含量。說(shuō)明在咀嚼滇橄欖之后,變形鏈球菌含量有所減少,而在咀嚼滇橄欖期間,僅有2～4 min時(shí)段有2個(gè)受試者唾液檢出變形鏈球菌,其他時(shí)段均未檢出。

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)變形鏈球菌構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of Streptococcus mutans for real-time quantitative PCR

總細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4,受試者唾液中的總細(xì)菌含量變化可由圖5看出:在咀嚼滇橄欖之前,總細(xì)菌的數(shù)目是所有時(shí)間段里的最大值,在開始咀嚼滇橄欖的2 min內(nèi),總細(xì)菌數(shù)目迅速降到最低值,隨著咀嚼時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)菌的數(shù)目有所波動(dòng),但在停止咀嚼滇橄欖10 min之后的細(xì)菌數(shù)目仍小于咀嚼滇橄欖之前。

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)總細(xì)菌構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of total bacterial for real-time quantitative PCR

圖5 唾液中細(xì)菌數(shù)量變化趨勢(shì)圖Fig.5 Change trend of the number of total bacterial in saliva

3 結(jié)論與討論

唾液有濕潤(rùn)口腔、調(diào)和食物、保持味覺(jué)的作用。人的舌頭能在口腔中自由活動(dòng),全靠唾液的幫助,說(shuō)話、進(jìn)食都少不了它。所以也把唾液稱為“口腔潤(rùn)滑劑”[17]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀測(cè)受試者咀嚼滇橄欖前后唾液流率的變化,研究了滇橄欖對(duì)人體唾液分泌的影響。由圖1 的唾液流率變化趨勢(shì)圖可以看出:咀嚼滇橄欖可有效刺激涎腺分泌唾液,隨著咀嚼時(shí)間的延長(zhǎng),涎腺受到的有效刺激有所減少,故唾液流率呈緩慢下降的趨勢(shì),但仍高于靜態(tài)唾液流率。唾液流率增加的原因有二,根據(jù)對(duì)志愿者唾液的pH檢測(cè)結(jié)果,在開始咀嚼滇橄欖時(shí)pH驟然下降,主要原因是滇橄欖本身的性味為酸,其中含豐富的余甘子酸和黏酸等成分,從而導(dǎo)致味覺(jué)刺激分泌更多的唾液,二是咀嚼本身帶來(lái)一定的機(jī)械刺激,也有促進(jìn)唾液分泌的功效。總之,滇橄欖能有效刺激涎腺分泌唾液,有一定的生津潤(rùn)燥、治療口干的作用。但由于本次實(shí)驗(yàn)條件所限,僅采集了受試者咀嚼后10 min后的唾液,至于滇橄欖是否能在更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)增加唾液的分泌及持續(xù)抑菌效果上仍待進(jìn)一步研究。

齲病是口腔常見病和多發(fā)病,是牙齒在多種因素共同作用下,發(fā)生硬組織脫礦、有機(jī)物溶解和牙組織進(jìn)行性破壞導(dǎo)致缺損的一種疾病[18]。而變形鏈球菌是口腔中常見的革蘭氏陽(yáng)性鏈球菌,也是口腔主要的致齲菌之一。熒光定量PCR的結(jié)果表明咀嚼滇橄欖過(guò)程中及咀嚼前后,口腔內(nèi)的變形鏈球菌和細(xì)菌數(shù)目都有所減少。結(jié)合文獻(xiàn)分析主要有如下原因:一是文獻(xiàn)表明滇橄欖中含有大量抗菌物質(zhì)可在體外對(duì)口腔中的微生物起到抑制作用:余甘子甲醇提取液對(duì)5個(gè)致病菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、普通變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌)具有抗菌活性[9],另外有研究表明用超臨界CO2萃取的余甘子精油對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希式桿菌、沙門氏菌、啤酒酵母、米曲霉等常見食品污染菌具有很好的抑制作用[14];滇橄欖中含豐富的余甘子酸、黏酸、沒(méi)食子酸等成分,有一定的抗菌作用[19]。二是唾液流率的增加,對(duì)口腔起到一定的清潔作用,從而導(dǎo)致微生物數(shù)量的降低,有研究表明:人體口腔唾液中含有一類抗菌蛋白質(zhì)為溶菌酶,具有抗菌消炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面的藥理作用,溶酶菌可以阻止齲齒的發(fā)生,故滇橄欖刺激人體口腔分泌唾液,有一定的抗菌作用[20]。三是由于變形鏈球菌的致齲原因主要是通過(guò)發(fā)酵多種碳水化合物產(chǎn)生乳酸,降低菌斑的pH,從而導(dǎo)致牙齒脫礦,在停止咀嚼滇橄欖后唾液的pH高于咀嚼滇橄欖之前的pH,說(shuō)明在咀嚼滇橄欖之后,使咀嚼滇橄欖使口腔內(nèi)環(huán)境稍微偏堿性,從而起到一個(gè)長(zhǎng)時(shí)間的抗齲作用[21]。這三個(gè)原因的共同作用,導(dǎo)致了本文實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出的總細(xì)菌及變形鏈球菌的數(shù)量在滇橄欖咀嚼中及咀嚼后均有所減少。

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Effect of theFructusphyllanthion the human saliva flow rate,pH and bacterial

GAO Qian1,XIE Ying2,HUANG Hai-tao1,NI Hong-mei1,LI Xue-mei1,GUAN Ying1,MI Qi-li1,YAO Jian-hua1，*

(1.China Tobacco Yunnan industrial Corporate Limited,Kunmin 650106,China； 2.Yunnan University of TCM,Kunming 650500,China)

Objective:TostudytheeffectoftheFructus phyllanthionthehumansalivaflowrate,pHandbacterial.Methods:Thesalivabothbeforeandafterchewingform10volunteerswerecollected,thesalivaflowrateandpHchangeweredeterminedandthetotalbacteriaandStreptococcus mutanscontentinsalivaweredetectedusingreal-timePCRexperiment.Results:Comparedwiththeresultsbeforechewing,volunteerssalivaflowratewasincreasedsignificantlyafterchewingFructus phyllanthi,thepHwasdecreasedfirstandthenincreased,thenumberoftotalbacteriaandS. mutansweredecreased.Conclusion:Fructus phyllanthicouldpromotehumansalivasecretion,andeffectivelyreducethenumberoftotalbacteriaandS. mutansintheoral,therewasacertaineffectonthepreventionofdentalcaries.

Fructus phyllanthi;salivaflowrate;real-timePCR;dentalcaries

2016-04-27

高茜(1984-)，女，博士，助理研究員，研究方向：生物學(xué)，E-mail:gaoqian840905@163.com。

*通訊作者:夭建華(1968-)，女，博士，研究員，研究方向：煙草生物學(xué),E-mail:jhyao_2007@126.com。

云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司項(xiàng)目(2015JC02)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)19-0352-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.060