鄔升超 黃 斐 趙 瀛 虞 倩 韓 序 王蓓麗 張春燕 郭 瑋 樓文暉 潘柏申△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科,2普外科 上海 200032)

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利用多重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)KRAS相關(guān)突變

鄔升超1黃 斐1趙 瀛1虞 倩1韓 序2王蓓麗1張春燕1郭 瑋1樓文暉2潘柏申1△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科,2普外科 上海 200032)

目的 建立多重?cái)?shù)字PCR體系檢測(cè)血漿細(xì)胞游離DNA(cell-free DNA,cfDNA)中KRAS第2外顯子12、13密碼子的7種突變。方法 構(gòu)建7種KRAS突變型質(zhì)粒用以建立多重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)體系,以靈敏度、特異度和動(dòng)態(tài)范圍為主要參數(shù)評(píng)估體系的性能。利用該體系檢測(cè)15例手術(shù)可切除的胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)患者血漿cfDNA中KRAS第2外顯子12、13密碼子突變情況,并與ARMs的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果 自建的多重?cái)?shù)字PCR在0.01%～10%的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)線性良好。兩個(gè)檢測(cè)體系的靈敏度分別可達(dá)到0.025%和0.043%。15名PDAC患者組織中KRAS突變的陽(yáng)性率達(dá)到100%。數(shù)字PCR檢測(cè)血漿cfDNA所得的結(jié)果與組織結(jié)果的匹配率達(dá)到40%,ARMs檢測(cè)組織和血漿cfDNA結(jié)果的匹配率為20%。15例樣本中使用多重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)到血漿cfDNA的最低豐度達(dá)到0.09%。結(jié)論 多重?cái)?shù)字PCR具備高靈敏度和特異性,可用于準(zhǔn)確定量外周血cfDNA中KRAS相關(guān)突變的水平。

多重?cái)?shù)字PCR; 血漿游離DNA; KRAS

RAS基因突變被認(rèn)為與人類腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。RAS家族中的KRAS基因12、13密碼子的突變?cè)诮Y(jié)直腸癌和胰腺癌中均有較高的發(fā)現(xiàn)率,被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生、復(fù)發(fā)及患者預(yù)后直接相關(guān)[1-2]。胰腺癌尤其是胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)患者中約有75%～95%攜帶KRAS突變基因,其與CDKN2A、SMAD4和TP53在基因水平的改變被認(rèn)為與胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展直接相關(guān)[3-4],監(jiān)測(cè)KRAS在體內(nèi)突變情況的變化有助于理解基因改變與病情發(fā)展之間的聯(lián)系。

外周血細(xì)胞游離DNA(cell-free DNA,cfDNA)是來(lái)自正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞死亡后釋放的核酸片段的總稱。由于其在體內(nèi)的半衰期較短且細(xì)胞釋放的核酸會(huì)進(jìn)入外周血,因此cfDNA較之于組織標(biāo)本更能實(shí)時(shí)全面地反映患者體內(nèi)的腫瘤情況[5-6]。另一方面,患者對(duì)非侵入性樣本采集方式的接受度更高,cfDNA具有良好的臨床應(yīng)用前景。但是如何準(zhǔn)確定量cfDNA一直是個(gè)難題:高度片段化、極低的目的片段濃度及復(fù)雜的背景噪音干擾,使得傳統(tǒng)基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR建立的方法在靈敏度、特異性及重復(fù)性上均無(wú)法滿足要求[7-8]。

液滴式數(shù)字PCR作為新一代數(shù)字PCR檢測(cè)系統(tǒng),得益于無(wú)限稀釋的概念,具備絕對(duì)定量、高靈敏度、高特異性、重復(fù)性好以及抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[9]。在腫瘤相關(guān)領(lǐng)域,數(shù)字PCR已經(jīng)被用于肺癌患者的液態(tài)活檢,以輔助指導(dǎo)靶向藥物的使用[10];亦可用于結(jié)直腸癌患者,高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng)能夠從外周血中發(fā)現(xiàn)耐藥突變,且外周血與組織的一致性高[11-12]。較之肺癌和結(jié)直腸癌,數(shù)字PCR在其他癌癥尤其是胰腺癌中的相關(guān)報(bào)道較少。本文旨在自建多重?cái)?shù)字PCR體系檢測(cè)KRAS基因12、13密碼子的7個(gè)突變,并對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行初步的性能驗(yàn)證。通過(guò)對(duì)15例PDAC患者的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),初步評(píng)價(jià)該系統(tǒng)的檢測(cè)能力。

材 料 和 方 法

患者基本信息 選取來(lái)自復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院普外科病房的15名PDAC患者以及8名來(lái)自體檢中心的健康人,其中健康人經(jīng)過(guò)影像學(xué)確認(rèn)不存在累及器官的病變,且血清結(jié)果顯示無(wú)異常。15名PDAC患者經(jīng)影像學(xué)發(fā)現(xiàn)胰腺占位,考慮為胰腺癌,行胰腺部分或全部切除術(shù),術(shù)前獲取6 mL全血樣本,術(shù)中獲取組織用以制備4%甲醛溶液固定石蠟包埋切片。所有23名受試者均簽署知情通知書。

組織DNA與血漿DNA抽提 從我院病理科獲得符合要求的4%甲醛溶液固定的石蠟包埋樣本(formalin-fixed and parrffin-embedded,FFPE),每例患者6張,使用QIAamp DNA Mini Kit(德國(guó)Qiagen公司)抽提組織DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆?。術(shù)前分別抽取10 mL外周血全血(EDTA抗凝管)和6 mL血清,1 900×g離心后用于CA199和CEA水平的測(cè)定。吸取離心后的血漿,16 000×g再次離心,吸取上清,-80 ℃凍存?zhèn)溆?。抽提前再次?6 000×g離心,取上清液,使用QIAmp Circulating Nucleic Acid Kit(德國(guó)Qiagen公司)抽提cfDNA。使用Nanodrop (美國(guó)Thermo Fisher公司)初步定量抽提后的cfDNA濃度,-20 ℃保存。

質(zhì)粒構(gòu)建 質(zhì)粒用于雙重和多重?cái)?shù)字PCR體系的建立和性能驗(yàn)證。以包含KRAS野生型片段的重組質(zhì)粒(貨號(hào):RC201958,美國(guó)Origene公司)為模板定點(diǎn)誘導(dǎo)常見(jiàn)的7種KRAS突變型(G12D、G12V、G12s、G12V、G12A、G12R和G13D)。為確保數(shù)字PCR生成的液滴狀態(tài)穩(wěn)定,構(gòu)建好的質(zhì)粒需使用對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割,使最終用于擴(kuò)增的包含目的片段的模板長(zhǎng)度小于3 000 bp,同時(shí)保證質(zhì)粒處于線性狀態(tài)。酶切后,使用天根DNA純化試劑盒(目錄號(hào):DP214)純化質(zhì)粒,-20 ℃保存?zhèn)溆?。為避免質(zhì)粒污染操作環(huán)境及質(zhì)粒間的交叉污染,實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中保證僅有一個(gè)樣本管處于打開(kāi)的狀態(tài),同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后打開(kāi)紫外燈照射操作室。

探針和引物的設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)使用RainDrop數(shù)字PCR系統(tǒng),分為收集裝置(Source)和讀取裝置(Sense),分別用于完成液滴的形成和信號(hào)采集與分析兩個(gè)步驟。按照儀器要求,需使用VIC和FAM兩種熒光對(duì)Taqman探針5’端進(jìn)行標(biāo)記,使用MGB淬滅基團(tuán)對(duì)Taqman探針3’端進(jìn)行標(biāo)記。為滿足多重?cái)?shù)字PCR設(shè)計(jì)時(shí)的需要,某種特定的突變形式需要用兩條不同熒光標(biāo)記的Taqman探針,且通過(guò)調(diào)整探針濃度使得不同突變類型的液滴得以在二維平面中區(qū)分[13],具體序列如表1、2所示。

表1 多重?cái)?shù)字PCR多重體系1的探針序列和濃度

表2 多重?cái)?shù)字PCR多重體系2的探針序列和濃度

多重?cái)?shù)字PCR體系構(gòu)建 多重?cái)?shù)字PCR的體系中包含野生型和多種突變型探針。將G12D、G12R、G12V及野生型構(gòu)成四重?cái)?shù)字PCR,命名為體系1(multiplex-1);將G13D、G12A、G12C、G12S以及野生型構(gòu)成五重?cái)?shù)字PCR,命名為體系2(multiplex-2)。體系1和2的體積均為40 μL,包括20 μL Genotyping Master Mix(美國(guó)Life Technologies公司)、0.5 μmol/L正向引物(5’-CTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGG-3’)和反向引物(5’-TAGCTGTATCGTCAAGGCAC-TC-3’)、野生型探針和不同類型的突變型探針(表1)、1.6 μL液滴穩(wěn)定劑(美國(guó)RainDance Technologies公司)和不低于50 ng的模板量,剩余用ddH2O補(bǔ)足。整個(gè)體系配制完成后,將混合液混勻,瞬時(shí)離心,轉(zhuǎn)移至芯片上對(duì)應(yīng)的加樣孔中,使用Source將40 μL混合液體制備成10-12級(jí)別的均勻液滴。處理完畢的樣本使用ABI Veriti96 PCR進(jìn)行擴(kuò)增(美國(guó)Applied Bio-systems公司),循環(huán)條件如下:95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s、64 ℃退火15 s、60 ℃延伸45 s,共45個(gè)循環(huán),98 ℃再延伸10 min后,12 ℃恒溫備用。最后將擴(kuò)增好的液滴轉(zhuǎn)移至Sense中進(jìn)行讀取。

數(shù)字PCR數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)分析使用Raindrop Analyst 10.0.7r2(美國(guó)RainDance Technologies公司)完成,具體步驟:(1) 雜音的排除。雜音的存在會(huì)嚴(yán)重干擾最后計(jì)數(shù)的結(jié)果,導(dǎo)致假陽(yáng)性的發(fā)生。利用軟件中自帶的功能“EVENT&對(duì)應(yīng)通道”來(lái)判斷該坐標(biāo)軸中散點(diǎn)的性質(zhì):如果散點(diǎn)聚成一團(tuán)出現(xiàn),則提示為雜音;如果為均勻分布,則提示為陽(yáng)性液滴,計(jì)數(shù)有效。(2) 熒光補(bǔ)償。每個(gè)液滴均不可避免存在熒光交叉的情況,具體表現(xiàn)為VIC通道中可以檢測(cè)到部分FAM熒光信號(hào),反之也是如此。熒光補(bǔ)償僅能改變“簇”的位置,不改變“簇”的相對(duì)位置和其中所含散點(diǎn)的數(shù)量。(3) 設(shè)門和定值。在多重體系中加入對(duì)應(yīng)質(zhì)粒獲得的散點(diǎn)分布圖可用于設(shè)定“門”,“門”是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的概念,其大小和位置是固定的,“門”所包含的散點(diǎn)的集合即為“簇”,散點(diǎn)的個(gè)數(shù)對(duì)應(yīng)為液滴數(shù),減去空白檢測(cè)限(limit of blank,LOB)即為目的片段的拷貝數(shù)。(4) 結(jié)果解讀。結(jié)合操作者對(duì)整個(gè)圖形的定性分析(噪音點(diǎn)的分布情況,不同突變型之間的距離、總共形成液滴的個(gè)數(shù)),將結(jié)果分為“陰性”、“陽(yáng)性”和“不置可否”3種情況。對(duì)于無(wú)法確認(rèn)的樣本使用自建的雙重?cái)?shù)字PCR進(jìn)行檢測(cè),或增加一倍的模板量后再使用多重?cái)?shù)字PCR進(jìn)行測(cè)試,以此為最終可信的結(jié)果。

多重?cái)?shù)字PCRLOB建立與驗(yàn)證 使用質(zhì)粒作為樣本建立初始LOB-A。利用體系1和2分別對(duì)4例KRAS野生型質(zhì)粒標(biāo)本(每個(gè)體系加入8 μL樣本)進(jìn)行LOB測(cè)試,所得結(jié)果取均值,根據(jù)泊松分布公式計(jì)算得到每個(gè)基因型對(duì)應(yīng)的LOB-A。再以健康人的混合血漿cfDNA為標(biāo)本,對(duì)LOB-A結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。同樣在每個(gè)體系中加入8 μL混合cfDNA,重復(fù)8次,計(jì)算均值并根據(jù)泊松分布公式得到結(jié)果LOB-B,將其與LOB-A進(jìn)行比較。

多重?cái)?shù)字PCR動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍測(cè)試 使用雙重?cái)?shù)字PCR定量檢測(cè)KRAS突變型和野生型的拷貝數(shù),將突變型和野生型質(zhì)粒(copies/μL)分別按照0.01%、0.1%、1%和10%進(jìn)行稀釋,獲得4個(gè)濃度梯度的混合樣本,供線性驗(yàn)證使用。使用多重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)上述樣本,以理論拷貝數(shù)和實(shí)際拷貝數(shù)之間的偏移結(jié)合復(fù)相關(guān)系數(shù)R2評(píng)價(jià)多重?cái)?shù)字PCR的線性性能。

多重?cái)?shù)字PCR的靈敏度測(cè)試 兩個(gè)多重?cái)?shù)字PCR體系中分別加入KRAS野生型質(zhì)粒(約50 000 copy/μL)和任一種突變型質(zhì)粒(約20 copy/μL),充分混勻后(使用雙重?cái)?shù)字PCR確認(rèn)濃度范圍)測(cè)定混合樣本中突變型和野生型的拷貝數(shù),并以“突變型/(突變型+野生型)”的比值MUT/(WT+MUT) %來(lái)描述多重?cái)?shù)字PCR的靈敏度。

ARMs方法檢測(cè)組織和外周血KRAS突變 選用商品化試劑盒AmoyDx?KRAS突變檢測(cè)試劑盒(廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司)檢測(cè)抽提后的組織DNA和血漿cfDNA中KRAS基因的突變情況。

結(jié) 果

入組患者的基本信息 15例PDAC患者中男性11例,女性4例,平均年齡為(56.21±4.52)歲。根據(jù)腫瘤位置不同進(jìn)行分類:7例在胰頭,3例在胰頸,5名在胰尾。根據(jù)TNM分期進(jìn)行分類:7例為ⅠA,8例為ⅡB。血清CA-199的中位水平為141.4 U/mL(0.7～2 010.0 U/mL),血清CEA的中位水平為4.8 U/mL(1.5～54.7 U/mL)。

多重?cái)?shù)字PCR體系的建立 通過(guò)調(diào)整探針的濃度和類型,獲得多重?cái)?shù)字PCR的兩個(gè)檢測(cè)體系(圖1)。在Multiplex-1體系中,FAM標(biāo)記的包含G12D和G12V突變型的液滴分布在靠近橫坐標(biāo)軸的位置,且G12D的熒光強(qiáng)度高于G12V;VIC標(biāo)記的包含野生型的液滴則分布在靠近縱坐標(biāo)軸的位置;FAM和VIC標(biāo)記的包含G12R突變型的液滴位于坐標(biāo)平面45°角的位置。在體系2中,FAM標(biāo)記的包含G12C和G12S突變型的液滴位于靠近橫坐標(biāo)軸的位置,且G12S的熒光強(qiáng)度高于G12C;VIC標(biāo)記的包含野生型和G13D突變型的液滴位于靠近縱坐標(biāo)軸的位置,FAM和VIC標(biāo)記的包含G12A突變型的液滴位于坐標(biāo)平面45°角的位置。所有不包含目的擴(kuò)增模板的液滴未能進(jìn)行有效擴(kuò)增,均位于坐標(biāo)平面的左下側(cè)。

多重?cái)?shù)字PCR LOB的建立 實(shí)驗(yàn)組中兩個(gè)體系分別檢測(cè)4例野生型質(zhì)粒標(biāo)本,拷貝數(shù)的取值范圍為11 000～14 000 copy/μL,結(jié)果取均值,根據(jù)泊松分布公式計(jì)算得到每個(gè)基因型的LOB-A分別為:G12D(9)、G12R(5)、G12V(4)、G13D(8)、G12A(5)、G12C(4)和G12S(7)。在驗(yàn)證組中,兩個(gè)體系分別檢測(cè)來(lái)自于健康人的混合血漿cfDNA(拷貝數(shù)約為180 copy/μL),所得的LOB-B結(jié)果分別為:G12D(7)、G12R(4)、G12V(3)、G13D(7)、G12A(5)、G12C(3)和G12S(6)。每個(gè)體系使用不同數(shù)量級(jí)的樣本測(cè)定LOB,最終得到的結(jié)果近似(圖2)。

多重?cái)?shù)字PCR線性驗(yàn)證 檢測(cè)MUT/(WT+MUT)%為0.01%、0.1%、1%和10%的樣本(圖2)。將4個(gè)濃度的結(jié)果擬合直線,所得的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2結(jié)果如下:G12V(0.91)、G12D(0.99)、G12R(0.91)、G12A(0.9)、G12S(0.99)、G12C(0.94)、G13D(0.99),提示該多重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)系統(tǒng)具有良好的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍。

多重?cái)?shù)字PCR的靈敏度測(cè)試 通過(guò)對(duì)自制的混合樣本進(jìn)行檢測(cè),在體系1的47 672個(gè)KRAS野生型拷貝中發(fā)現(xiàn)21個(gè)G12D拷貝,在體系2的48 972個(gè)KRAS野生型拷貝中發(fā)現(xiàn)25個(gè)G12C拷貝,分別減去LOB后實(shí)際混合樣本中突變型的豐度分別為0.025%和0.043%,即在體系1中每3 972個(gè)野生型拷貝中可以檢測(cè)到1個(gè)G12D突變型拷貝,在體系2中每2 332個(gè)野生型拷貝中可以檢測(cè)到1個(gè)G12C突變型拷貝(圖3)。

LOB-A:LOB calculated according to plasmid; LOB-B:LOB calculated according to cfDNA from pooled plasma cfDNA.

圖2 多重?cái)?shù)字PCR體系LOB的建立

Fig 2 LOB of multiplex digital PCR

PDAC患者組織和血漿樣本的KRAS突變情況使用ARMs方法檢測(cè)FFPE樣本中KRAS突變情況,同時(shí)在自建的多重?cái)?shù)字PCR平臺(tái)上檢測(cè)患者血漿DNA中KRAS的突變情況(表3)。在15例PDAC患者中,組織KRAS突變的陽(yáng)性率為100%,ARMs檢測(cè)血漿cfDNA的陽(yáng)性率為20%,數(shù)字PCR的檢測(cè)結(jié)果則為53%。6例患者(40%)的血漿cfDNA結(jié)果與組織完全匹配,8例患者未在外周血中發(fā)現(xiàn)KRAS相關(guān)突變?；颊?和患者12的組織結(jié)果與血漿cfDNA結(jié)果有差異。使用多重?cái)?shù)字PCR在患者7的外周血中檢測(cè)出低豐度的G12S突變型,而ARMs方法無(wú)論在組織還是cfDNA中均未檢測(cè)出該突變?；颊?2的組織中存在G13D突變,但是在血漿中兩種方法均未發(fā)現(xiàn)該突變,且ARMs未在cfDNA中檢測(cè)出低豐度的G12D突變。

CaseNo.TNMTumortissueDNAARMsPlasmacfDNAARMsdPCR1ⅡAG12DNG12D(1.32%)2ⅡAG12DNN3ⅡBG12VG12VG12V(4.52%)4ⅡAG12VNG12V(0.92%)5ⅡBG12R,G12CNN6ⅡAG12RNN7ⅡBG12DG12DG12s(0.82%),G12D(12.24%)8ⅡAG12RNN9ⅡBG12VG12VG12V(6.56%)10ⅡBG12RNN11ⅡBG12VNG12V(1.36%)12ⅡAG12D,G13DNG12D(0.56%)13ⅡBG12DNN14ⅡAG12DNG12D(0.09%)15ⅡBG12VNN

N:Non-amplified.

討 論

本實(shí)驗(yàn)使用的液滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)在2個(gè)反應(yīng)孔中實(shí)現(xiàn)了對(duì)外周血中KRAS基因第2外顯子12、13密碼子共7個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行絕對(duì)定量分析的目的。經(jīng)過(guò)初步的性能驗(yàn)證結(jié)合實(shí)際標(biāo)本的檢測(cè),我們認(rèn)為多重?cái)?shù)字PCR具備對(duì)多個(gè)突變位點(diǎn)在單孔中進(jìn)行同時(shí)分析的能力,特異性、敏感度和重復(fù)性均可滿足臨床需求。

多重?cái)?shù)字PCR在雙重PCR的基礎(chǔ)上通過(guò)改變探針的類型和濃度以達(dá)到在二維坐標(biāo)上區(qū)分不同基因型的目的。由于數(shù)字PCR具備無(wú)限稀釋分液的能力,確保了單個(gè)液滴中僅包含一條模板及反應(yīng)體系。在單個(gè)反應(yīng)液滴中,如果探針與模板匹配,隨著PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加可使液滴發(fā)出可檢測(cè)到的熒光,且該熒光強(qiáng)度與探針的濃度成正比。通過(guò)FAM和VIC兩種熒光標(biāo)記同一種基因型,可使得液滴具備不同波段的熒光信號(hào),此類液滴通常位于二維坐標(biāo)軸的右上方(如體系1中的G12R和體系2中的G12A),具體位置隨著探針濃度的變化而改變。因此,按照此理論對(duì)探針的濃度和標(biāo)記物類型進(jìn)行調(diào)整,最高可建立十重?cái)?shù)字PCR的檢測(cè)體系。

LOB的確立依賴于大量以野生型為模板進(jìn)行的空白測(cè)試結(jié)果的累積。通?？晒┻x擇的野生型模板類型包括碎片化的質(zhì)?；蚣?xì)胞系、正常人cfDNA以及合成短序列等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,7個(gè)突變型均存在一定數(shù)量的“假液滴”作為雜音存在于檢測(cè)體系中。在兩個(gè)反應(yīng)體系中發(fā)現(xiàn)G12D和G13D的LOB均顯著高于所在體系中其他突變類型,可能與加入探針的終濃度相關(guān)(G12D∶0.2 μmol/L,G13D:0.25 μmol/L,G12S:0.2 μmol/L)。過(guò)高的探針濃度會(huì)提高與野生型模板錯(cuò)配的概率,最終表現(xiàn)為L(zhǎng)OB升高。相對(duì)而言,由于雙重PCR僅需添加兩種類型的探針,此現(xiàn)象并不常見(jiàn)。本研究對(duì)LOB實(shí)驗(yàn)和驗(yàn)證的結(jié)果提示,無(wú)論是樣本的濃度還是類型均不會(huì)明顯改變LOB值,該結(jié)論在Valerie等[12]的研究中也被證實(shí)。因此,后續(xù)類似項(xiàng)目可考慮使用更易獲得、制備方便且穩(wěn)定的質(zhì)粒作為質(zhì)控品。

通過(guò)多重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)15例PDAC患者cfDNA與ARMs方法檢測(cè)組織標(biāo)本的結(jié)果比對(duì)發(fā)現(xiàn),數(shù)字PCR在檢測(cè)血漿cfDNA時(shí)優(yōu)于ARMs方法。以數(shù)字PCR的檢測(cè)結(jié)果作為參考,ARMs檢測(cè)的cfDNA陽(yáng)性患者的最低檢出豐度為0.92%。與之相比,數(shù)字PCR的最低檢出豐度達(dá)到0.09%。以組織結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),在數(shù)字PCR檢測(cè)出的cfDNA陽(yáng)性標(biāo)本中有3例的ARMs檢測(cè)結(jié)果為陰性。因此認(rèn)為,目前ARMs方法的靈敏度無(wú)法完全滿足血漿cfDNA的檢測(cè)需求。

個(gè)體間對(duì)核酸清除能力的差異、腫瘤負(fù)荷、腫瘤分期、腫瘤類型均會(huì)影響cfDNA在外周血能夠被檢出的水平。在本研究的15例Ⅱ期的PDAC患者的cfDNA中,KRAS突變的檢出率為53%?；颊?出現(xiàn)外周血和組織結(jié)果不匹配的情況,通過(guò)數(shù)字PCR檢測(cè)出組織中未發(fā)現(xiàn)的KRAS G12S突變。對(duì)于上述情況可能的解釋是單一組織樣本不能反映整個(gè)腫瘤組織的突變狀態(tài),腫瘤亞克隆被認(rèn)為廣泛存在于腫瘤組織中?！耙后w活檢”的優(yōu)勢(shì)之一便是當(dāng)游離核酸釋放入血后獲取的血液樣本囊括了來(lái)自于腫瘤組織的大部分信息,這一觀點(diǎn)在近期的一些研究中也有類似報(bào)道[15-16]。患者12的外周血中并未能檢測(cè)出組織中發(fā)現(xiàn)的G13D突變,經(jīng)過(guò)復(fù)檢后確認(rèn)組織和外周血的結(jié)果。為確認(rèn)組織中G12D和G12D的豐度,使用數(shù)字PCR檢測(cè)該樣本發(fā)現(xiàn)G12D和G13D的豐度分別為12.1%和1.21%。G13D較低的豐度提示腫瘤灶內(nèi)該類型的突變要遠(yuǎn)低于G12D,游離到外周血的cfDNA可能因被降解而無(wú)法被檢測(cè)到。因此,外周血cfDNA的結(jié)果也并不能夠反映腫瘤灶的全部信息。

數(shù)字PCR系統(tǒng)具有高靈敏度和特異性,其檢測(cè)能力已得到廣泛認(rèn)可,同時(shí)參照2013年數(shù)字PCR的MIQE導(dǎo)則也可逐步規(guī)范整個(gè)體系的操作步驟[14]。但是,在實(shí)際使用中亟需解決以下2個(gè)問(wèn)題:(1) 缺乏對(duì)測(cè)試結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化解讀模式(更多依賴于個(gè)人經(jīng)驗(yàn));(2) 目前的檢測(cè)結(jié)果與具體病例之間很難建立起有效聯(lián)系。針對(duì)前者可以通過(guò)累積大量數(shù)據(jù)以提升整個(gè)系統(tǒng)的檢測(cè)性能(如LOB、最低檢測(cè)限、臨床決定水平等)。針對(duì)后者則需要將“液體活檢”理論和數(shù)字PCR技術(shù)結(jié)合,探索其在腫瘤早期診斷、治療評(píng)估、復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

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KRAS related mutations detected by multiplex digital PCR

WU Sheng-chao1, HUANG Fei1, ZHAO Ying1, YU Qian1, HAN Xu2, WANG Bei-li1, ZHANG Chun-yan1, GUO Wei1, LOU Wen-hui2, PAN Bai-shen1△

(1DepartmentofClinicalLaboratory,2DepartmentofSurgery,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

Objective To establish amultiplex digital PCR panel detecting 7 most common mutations in codon 12,13 of KRAS exon 2 from plasma cell-free DNA (cfDNA). Methods Plasmids prepared were applied to the establishment of multiplex digital PCR panels.We regarded sensitivity,specificity and dynamic range as main parameters to evaluate the performance.Plasma cfDNA and tissue sample from 15 resectable patients of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) were tested with dPCR and ARMs respectively and consistency between these two methods was also evaluated. Results Our self-built multiplex dPCR showed a good linearity performance in the dynamic range of 0.01%-10%.The sensitivity of two panels reached 0.025% and 0.043%,respectively.Among 15 PDAC patients,the consistency between plasma cfDNA given by digital PCR and tissue samples was 40%,while the result was 20% when we used ARMs to detect plasma cfDNA.The lowest abundance of KRAS mutations in plasma cfDNA among 15 PDAC patients was 0.09% according to digital PCR. Conclusions Multiplex digital PCR system shows high sensitivity and specificity in detecting and quantifying mutations of KRAS simultaneously in cfDNA.

multiplex digital PCR; plamsa cell-free DNA; KRAS

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81572064);上海市衛(wèi)生計(jì)生系統(tǒng)重要薄弱學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(2015ZB0201)

R446.11+9

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2016.06.011

2016-01-11;編輯:段佳)

△Corresponding author E-mail:pan.baishen@zs-hospital.sh.cn

*This work was supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China (81572064) and the Key Developing Disciplines of Shanghai Municipal Commission of Health and Family Planning (2015ZB0201).