馬 亮 趙海玲 趙婷婷 趙美美 劉 怡 高 芃 李 平 曹永彤*

(1.中日友好醫(yī)院檢驗科，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所 免疫炎性疾病北京市重點(diǎn)實驗室，北京 100029)

2型糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一種復(fù)雜的代謝紊亂疾病，長期高血糖會導(dǎo)致機(jī)體多器官受累并出現(xiàn)較嚴(yán)重的并發(fā)癥。糖尿病相關(guān)腎病(diabetic kidney disease, DKD)是DM的主要血管并發(fā)癥，約有30%～40%的DM患者最終發(fā)展為DKD。DKD是多種因素綜合作用的結(jié)果，其中糖代謝紊亂、腎血流動力學(xué)的改變、微炎癥以及遺傳背景等均起到非常重要的作用[1]。近年來，微炎癥在DKD的發(fā)病機(jī)制中受到越來越多的重視。Tuttle等[2]認(rèn)為DM是一種由代謝紊亂觸發(fā)的炎癥性疾病。長時間微環(huán)境炎癥是DKD發(fā)病的主要原因之一,相關(guān)研究[3]表明，抗炎分子能減輕DKD，促炎因子如白細(xì)胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等可以促進(jìn)DKD進(jìn)展[4]。

近年來，可溶性環(huán)氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase, sEH)在腎臟疾病尤其是DKD發(fā)病中所起的作用逐漸被重視，sEH抑制劑的研究以及該基因敲除有可能成為DKD治療的新靶點(diǎn)。EPHX2編碼的sEH可水解體內(nèi)由芳香族和烯類化合物代謝產(chǎn)生的環(huán)氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids，EETs)生成相應(yīng)的二羥基二十碳三烯酸(dihydroxyeicosatrienoic acids，DHETs)，而且多個研究也表明EETs具有抗炎、舒張血管平滑肌、抗凝、促進(jìn)血管生成、抗凋亡等多種功能。腎臟EETs濃度降低可促進(jìn)DKD的發(fā)展，給予外源性EETs可以抑制2型糖尿病腎病大鼠腎臟組織中炎癥因子單核細(xì)胞趨化蛋白表達(dá)，降低尿白蛋白排泄率，減輕腎臟病理改變[5]。腎臟EETs濃度升高可通過阻斷核轉(zhuǎn)錄因子-κB的活化和減少腎臟巨噬細(xì)胞的浸潤來抑制腎臟微炎癥的進(jìn)展[6]。本課題組前期臨床研究[7]顯示，編碼sEH的EPHX2基因rs751141多態(tài)性(R287Q)與DKD的發(fā)生有關(guān)，該多態(tài)性與DKD相關(guān)性的具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。本研究中采用外源基因過表達(dá)、重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染等技術(shù)開展體外細(xì)胞實驗，探討EPHX2 rs751141基因多態(tài)性(G860A, R287Q)對sEH酶活性的影響及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

HK2細(xì)胞株(美國ATCC公司)；核酸提取試劑盒(德國QIAGEN公司)；EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶(美國New England Biolab公司)；pcDNA3.1/V5-His真核表達(dá)載體(美國Invitrogen 公司)；pUC-T TA連接試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；11,12-EET(美國Cayman公司)；11,12-EET DHET免疫測定試劑盒(美國Detroit R&D公司)；sEH和β-actin單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；p-AKT單克隆抗體、AKT單克隆抗體、PI3K單克隆抗體(美國CST公司)、高保真酶2×Es Taq Master Mix(康為世紀(jì))。

1.2 PCR擴(kuò)增EPHX2基因

Trizol提取HK2細(xì)胞株總RNA，取3 μg RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GeneBank中人EPHX2 mRNA CDS序列，以O(shè)ligo 7軟件設(shè)計引物，上游引物引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)。以高保真酶2×Es Taq Master Mix(康為世紀(jì))進(jìn)行擴(kuò)增EPHX2 cDNA片段。配制50 μL PCR反應(yīng)體系：25 μL 2×Mix，上下游引物各2 μL(20 μmol/L)，cDNA 6 μL，無RNase水 15 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，共32個循環(huán)，最后72 ℃10 min滅活Taq酶。

EPHX2 PCR擴(kuò)增引物序列：正向引物為5′-GAATTCATGACGCTGCGCGCGGCCGT-3′；反向引物為5′-CTCGAGCATCTTTGAGACCACCGGTG -3′(EcoRⅠ酶切位點(diǎn):GAATTC，XhoⅠ酶切位點(diǎn):CTCGAG)。

1.3 合成點(diǎn)突變引物并誘導(dǎo)點(diǎn)突變

運(yùn)用Primer premier 5.0設(shè)計軟件，以加州大學(xué)圣克魯茲分校UCSC Feb.2009(GRCh37/hg19)數(shù)據(jù)庫提供的EPHX2基因組序列為參照序列，R287Q點(diǎn)突變引物序列正向引物: 5′- TCTGGCCCAGGCAGGTTACCAGGTCCTAGCTATGGACATG-3′; 反向引物: 5′- CATGTCCATAGCTAGGACCTGGTAACCTGCCTGGGC- CAGA-3′。

1.4 EPHX2 DNA亞克隆至pcDNA3.1/V5-His A真核載體

將測序正確的質(zhì)粒DNA與載體pcDNA3.1/V5-His A分別經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，T4連接酶連接后，重新轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，接種至LB固體培養(yǎng)基，同時接種載體自身連接作為陰性對照。37 ℃培養(yǎng)16 h后挑取單克隆菌，依次經(jīng)擴(kuò)增、提取、酶切鑒定、測序等步驟后，得到含有正確插入片段的重組質(zhì)粒DNA。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)液中11,12-DHET含量測定

本實驗共設(shè)置3組:空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(NC)、突變型組(EPHX2/R287Q/pcDNA3.1/V5-His，R287Q)、野生型組(EPHX2/pcDNA3.1/V5-His，WT)。實驗結(jié)束前2 h加入11,12-EET，終濃度為1 μmol/L。終止實驗收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。使用ELISA試劑盒檢測11,12-DHET濃度。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測IL-17A和IL-1細(xì)胞因子濃度

標(biāo)準(zhǔn)品用前2 000 g離心10 s，加入250 μL稀釋液，混勻并冰浴10 min，取一個八聯(lián)管，標(biāo)記1～8，將最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)入1號管，其余每管加入120 μL 稀釋液，由1號管依次轉(zhuǎn)移60 μL到下一管混勻，到7號管，8號管不加為本底，完成梯度稀釋。獲取模板的建立，打開一個新程序，建立散點(diǎn)圖及柱狀圖。運(yùn)行檢測程序樣品的檢測結(jié)果分析。

1.7 實時定量PCR法檢測轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后相關(guān)指標(biāo)IL-17A和IL-1表達(dá)變化

配置總體積為25 μL/管的PCR反應(yīng)體系如下：UltraSYBR Mixture(含ROXⅠ) 12.5 μL；上游引物： 1 μL(10 μmol/L)；下游引物：1 μL(10 μmol/L)；cDNA模板 2 μL(10 ng)；無RNase水 8.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，共計40個循環(huán)，融解曲線95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。引物序列詳見表1。

表1 Real-time PCR引物序列

1.8 Western blotting檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后相關(guān)指標(biāo)變化

提取R287Q組、WT組、NC組蛋白，BCA法測定蛋白濃度，蛋白上樣量40 μg,經(jīng)凝膠配置、上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉封閉1 h，分別加入p-AKT、AKT、PI3K、β-actin抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后，滴加HRP標(biāo)記羊抗鼠/兔 IgG室溫孵育1 h。使用凝膠攝像儀器曝光信號檢測， Image J 1.43軟件進(jìn)行灰度值分析測量，將相應(yīng)目的蛋白與內(nèi)參蛋白(β-actin)灰度值比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建EPHX2 WT、R287Q突變型重組表達(dá)質(zhì)粒

EPHX2 WT、R287Q突變型重組表達(dá)質(zhì)粒和空載體轉(zhuǎn)染至HK2細(xì)胞后48 h收集細(xì)胞進(jìn)行實驗。用Western blotting方法檢測融合蛋白的表達(dá)(圖1)，sEH蛋白的相對分子質(zhì)量為62 500。該結(jié)果表明WT、R287Q突變型重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒及空載體轉(zhuǎn)染后sEH蛋白表達(dá)情況Fig.1 Expression of sEH protein after transfection with recombinant plasmid and empty vector1: wild type; 2: R287Q mutant; 3: empty vector; sEH: soluble epoxide hydrolase.

2.2 R287Q突變型重組質(zhì)粒對HK2細(xì)胞培養(yǎng)上清11,12-DHET濃度的影響

將WT組、R287Q組、NC組轉(zhuǎn)染HK2細(xì)胞，并在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入1 μmol/L 11,12-EET后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中11,12-DHET的量顯著上調(diào)，表明轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞的EPHX2重組質(zhì)粒成功在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并且具有較強(qiáng)的水解酶活性。R287Q組水解11,12-EET活性明顯低于野生型WT(P<0.01)，詳見圖2。

圖2 WT組、R287Q組重組表達(dá)質(zhì)粒和NC組轉(zhuǎn)染HK2細(xì)胞后，給予11，12-EET細(xì)胞培養(yǎng)上清中11,12-DHET濃度Fig.2 Concentration of 11,12-DHET in the supernatant of HK2 cells transfected with the recombinant expression plasmids of WT, R287Q and NC was measuredn=3; 11,12-EET: 11,12-epoxyeicosatrienoic acid; 11,12-DHET: 11,12-dihydroxyeicosatrienoic acid; WT：EPHX2/pcDNA3.1/V5-His; R287Q：EPHX2/R287Q/pcDNA3.1/V5-His; NC:pcDNA3.1/V5-His.

2.3 R287Q突變型重組質(zhì)粒對HK2細(xì)胞上清炎癥因子濃度的影響

2.3.1 R287Q突變型重組質(zhì)粒對HK2細(xì)胞上清IL-17A濃度的影響

如圖3所示，突變型R287Q組細(xì)胞上清IL-17A濃度低于WT組(P<0.05)，未干預(yù)的WT組IL-17A濃度為34.61 pg/mL，突變型R287Q組IL-17A濃度為24.13 pg/mL，NC組IL-17A濃度為29.00 pg/mL。

圖3 突變型R287Q重組質(zhì)粒對HK2細(xì)胞IL-17A濃度以及外源性11,12-EET干預(yù)對其影響Fig.3 Effect of mutant R287Q recombinant plasmid on the level of IL-17A and exogenous 11,12-EET intervention in HK2 cellsn=3，*P<0.05; IL: interleukin； 11,12-EET: 11,12-epoxyeicosatrienoic acid;WT：EPHX2/pcDNA3.1/V5-His;R287Q：EPHX2/R287Q/pcDNA3.1/V5-His;NC:pcDNA3.1/V5-His.

加入11,12-EET干預(yù)后，11,12-EET可以使WT組IL-17A濃度降低為30.56 pg/mL，低于未加11,12-EET 的WT野生型組(P<0.05)，高于加入11,12-EET 突變型R287Q組IL-17A濃度(26.90 pg/mL)(P<0.05)，NC組IL-17A濃度降低為27.99 pg/mL。

2.3.2 R287Q突變型重組質(zhì)粒對HK2細(xì)胞上清IL-1濃度的影響

如圖4所示，突變型R287Q組細(xì)胞上清IL-1濃度低于WT組(P<0.05)，未干預(yù)的WT野生型IL-1濃度為0.70 pg/mL，突變型R287Q組 IL-1濃度為0.55 pg/mL， NC組IL-1濃度為0.70 pg/mL。

圖4 突變型R287Q組重組質(zhì)粒對HK2細(xì)胞IL-1濃度以及外源性11,12-EET干預(yù)對其影響Fig.4 Effect of mutant R287Q recombinant plasmid on the level of IL-1 and exogenous 11,12-EET intervention in HK2 cells n=3, *P<0.05; IL: interleukin; 11,12-EET: 11,12-epoxyeicosatrienoic acid;WT：EPHX2/pcDNA3.1/V5-His;R287Q：EPHX2/R287Q/pcDNA3.1/V5-His;NC:pcDNA3.1/V5-His.

加入11,12-EET干預(yù)后，11,12-EET可以使WT野生型IL-1濃度降低為0.60 pg/mL，低于未加11,12-EET 的WT組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.15)；高于加入11,12-EET的突變型R287Q 組IL-1(0.57 pg/mL)，但差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.52)，NC組IL-1濃度為0.65 pg/mL。

2.4 R287Q突變型重組質(zhì)粒對HK2細(xì)胞IL-17A和IL-1β mRNA水平的影響

2.4.1 R287Q突變型重組質(zhì)粒對HK2細(xì)胞IL-17A mRNA表達(dá)的影響

如圖5所示，突變型R287Q組相對于WT組HK2細(xì)胞IL-17A mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)。加入11,12-EET干預(yù)后，WT組低于未加11,12-EET 的WT組(P<0.05)，高于加入11,12-EET的突變型R287Q組(P<0.05)。

圖5 R287Q突變型重組質(zhì)粒對HK2細(xì)胞株IL-17A mRNA表達(dá)的影響以及外源性11,12-EET干預(yù)后對其影響Fig.5 Effect of mutant R287Q recombinant plasmid on the expression level of IL-17A mRNA in HK2 cell line and after exogenous 11,12-EET intervention n=3, *P<0.05, **P<0.01； IL-17A: interleukin-17A;11,12-EET: 11,12-epoxyeicosatrienoic acid；WT：EPHX2/pcDNA3.1/V5-His;R287Q：EPHX2/R287Q/pcDNA3.1/V5-His;NC:pcDNA3.1/V5-His.

2.4.2 R287Q突變型重組質(zhì)粒對HK2細(xì)胞IL-1β mRNA表達(dá)的影響

如圖6所示，突變型R287Q組相對于WT組HK2細(xì)胞IL-1β mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)。WT組低于未加11,12-EET 的WT組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.24)，高于加入11,12-EET的突變型R287Q組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖6 R287Q突變型重組質(zhì)粒對HK2細(xì)胞株IL-1β mRNA表達(dá)的影響以及外源性11,12-EET干預(yù)后對其影響Fig.6 Effect of mutant R287Q recombinant plasmid on the expression level of IL-1β mRNA in HK2 cell line and after exogenous 11,12-EET intervention n=3, *P<0.05, **P<0.01； IL-1β: interleukin-1β; 11,12-EET: 11,12-epoxyeicosatrienoic acid；WT：EPHX2/pcDNA3.1/V5-His;R287Q：EPHX2/R287Q/pcDNA3.1/V5-His;NC:pcDNA3.1/V5-His.

2.5 R287Q突變型重組質(zhì)粒對HK2細(xì)胞p-AKT/AKT蛋白表達(dá)的影響

R287Q突變型相對于WT型HK2細(xì)胞p-AKT/AKT表達(dá)明顯降低(P<0.05)。加入11,12-EET干預(yù)后，WT型低于未加11,12-EET 的WT型組(P<0.01)，高于加入11,12-EET的R287Q突變型(P<0.05)，詳見圖7。

圖7 R287Q突變型重組質(zhì)粒對HK2細(xì)胞株p-AKT/AKT蛋白表達(dá)的影響以及外源性11,12-EET干預(yù)后對其影響Fig.7 Effect of mutant R287Q recombinant plasmid on the expression of p-AKT/AKT protein in HK2 cell line and after exogenous 11,12-EET intervention A: Western blotting; B: data analysis; n=3,*P<0.05, **P<0.01; 11,12-EET: 11,12-epoxyeicosatrienoic acid；WT：EPHX2/pcDNA3.1/V5-His;R287Q：EPHX2/R287Q/pcDNA3.1/V5-His;NC:pcDNA3.1/V5-His.

2.6 R287Q突變型重組質(zhì)粒對HK2細(xì)胞PI3K蛋白表達(dá)的影響

R287Q突變型相對于WT型HK2細(xì)胞PI3K/β-actin表達(dá)明顯降低(P<0.05)。加入11,12-EET干預(yù)后，WT型高于未加11,12-EET 的WT型組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.37)，低于加入11,12-EET的R287Q突變型(P<0.01)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，詳見圖8。

圖8 R287Q突變型重組質(zhì)粒對HK2細(xì)胞株P(guān)I3K表達(dá)的影響以及外源性11,12-EET干預(yù)后對其影響Fig.8 Effect of mutant R287Q recombinant plasmid on the expression level of PI3K in HK2 cells and the effect of exogenous 11,12-EET intervention A: Western blotting; B: data analysis; n=3, *P<0.05, **P<0.01; 11,12-EET: 11,12-epoxyeicosatrienoic acid；WT：EPHX2/pcDNA3.1/V5-His;R287Q：EPHX2/R287Q/pcDNA3.1/V5-His;NC:pcDNA3.1/V5-His.

3 討論

1973年Gill等[8]在研究類似昆蟲保幼激素萜類環(huán)氧化物的代謝時發(fā)現(xiàn)sEH，因其主要位于細(xì)胞的可溶性成分如細(xì)胞質(zhì)和過氧化酶體中而命名，主要分布于細(xì)胞質(zhì)及過氧化物酶體中，在肝臟、腎臟、內(nèi)皮細(xì)胞、胰島和心肌細(xì)胞中表達(dá)最為豐富。sEH以同源二聚體的形式存在，具有氨基端和羧基端兩個活性結(jié)構(gòu)域，羧基端具有氧化水解的活性，而氨基端可能與sEH穩(wěn)定性有關(guān)，具有磷酸酶活性。sEH須以二聚體的形式發(fā)揮其生物活性[9]，該二聚體的三維結(jié)構(gòu)模式圖提示，兩個羧基末端相互靠近，氨基末端之間不直接接觸而是與相應(yīng)的羧基末端聯(lián)系，空間結(jié)構(gòu)的破壞將導(dǎo)致其功能的喪失。

人類sEH編碼基因EPHX2有19個外顯子的長約45 kb，定位在8p21-p12[10]。Sandberg等[11]于2000年首次在25例肝臟組織中發(fā)現(xiàn)4例EPHX2基因cDNA序列860位堿基G突變?yōu)锳(c.860G>A)，相對應(yīng)的氨基酸由精氨酸變?yōu)楣劝滨０?R287Q)，并進(jìn)一步應(yīng)用t-SO(trans -[3H ]stilbene oxide)作為底物對該突變酶活性研究發(fā)現(xiàn)R287Q突變型酶活性明顯低于野生型。

本研究中，本課題組首先構(gòu)建了sEH野生型和R287Q突變型表達(dá)質(zhì)粒，將其在HK2細(xì)胞株中過表達(dá)，在實驗結(jié)束前2 h加入11,12-EET，終濃度1 μmol/L，通過檢測其代謝產(chǎn)物11,12-DHET，可以反映sEH不同突變類型代謝11,12-EET的能力，另一方面也間接反映不同突變類型sEH水解酶活性。研究結(jié)果顯示，R287Q重組質(zhì)粒水解11,12-EET的酶活性在所有構(gòu)建的重組質(zhì)粒中最低，并且明顯低于野生型，這與之前的研究[9]較一致。R287Q不位于催化活性中心，表明sEH的催化作用并不能用簡單的催化活性中心與底物相互作用來解釋。Nelson等[9]sEH二聚體的研究顯示，R287Q多態(tài)性與野生型相比并不改變二聚體結(jié)構(gòu)狀態(tài)，但是卻呈現(xiàn)不穩(wěn)定的二聚體狀態(tài)，導(dǎo)致其水解能力降低，所以sEH二聚體結(jié)構(gòu)狀態(tài)對其水解活性具有非常重要的作用。

本研究的細(xì)胞實驗結(jié)果顯示，通過野生型和突變型外源基因過表達(dá)，在IL-1、IL17A等炎癥因子水平上，R287Q突變型低于野生型，說明R287Q突變型具有減緩炎癥作用。在mRNA水平表達(dá)上，R287Q突變型也能夠降低炎癥因子的表達(dá)。

蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/Akt)是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，在葡萄糖代謝，細(xì)胞凋亡、存活、增殖以及細(xì)胞骨架的變化等活動中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。Akt廣泛表達(dá)于體內(nèi)各種組織，磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)是其活性形式。之前的研究[12]證實，在糖尿病大鼠中，胰島素樣生長因子刺激Akt的磷酸化，導(dǎo)致Akt通路的激活。而磷酸化的Akt能夠激活I(lǐng)κB激酶，使IκB與核轉(zhuǎn)錄因子-κB形成具有活性的核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65亞基，使得其進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)相關(guān)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生[13]。而在本研究中，R287Q突變型相對于野生型p-Akt/Akt明顯降低，說明R287Q突變型可以通過下調(diào)p-Akt減緩炎癥。

當(dāng)加入過量外源11,12-EET時，野生型炎性指標(biāo)水平差距變小，但仍高于加入過量外源11,12-EET的R287Q突變型，說明野生型與R287Q之間差距部分可以被外源11,12-EET減弱，但并沒有完全消除，這可能與sEH還代謝其他炎癥相關(guān)活性物質(zhì)有關(guān)，相關(guān)研究[14]也顯示與EETs相比，新發(fā)現(xiàn)的sEH的底物EEQs具有更強(qiáng)的抗炎作用，因此R287Q減緩炎癥的具體機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

本研究首次構(gòu)建了R287Q突變型重組表達(dá)質(zhì)粒對該突變型酶活性進(jìn)行了研究，與國外其他研究[8]該酶活性的方法不同，但結(jié)論一致。并通過外源基因過表達(dá)的方法證實了該酶點(diǎn)突變可以影響炎癥水平及相關(guān)信號通路，為R287Q多態(tài)性的臨床應(yīng)用奠定了實驗基礎(chǔ)。