王超，馬雪娜，馮博，郭春蘭，李瑩，侯文秀，鄒冰雪，黃珊珊，化金閣，郭梅，楊楠，龐震

（1.北大荒墾豐種業(yè)股份有限公司/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物生物育種重點實驗室，哈爾濱 150431；2.黑龍江大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院，哈爾濱 150080；3.東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，哈爾濱 150038）

0 引言

玉米種子純度的高低很大程度上決定了優(yōu)良作物品種的增產(chǎn)潛力。目前，種子市場秩序比較混亂，在銷售市場中嚴重存在以假冒真、以劣充優(yōu)的現(xiàn)象，不僅侵害了農(nóng)民和合法經(jīng)營企業(yè)的權(quán)益，而且也嚴重阻礙了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展。因此，純度檢驗在作物種子生產(chǎn)、加工和流通中具有重要的意義和應(yīng)用價值[1]。種子純度的檢驗方法很多，其中DNA分子標記技術(shù)是能夠直接反映生物個體或種群間基因組內(nèi)具有差異性的DNA片段，并不受外界環(huán)境因素的影響，被越來越多的科研工作者使用[2-5]。目前，SSR（簡單序列重復Simple Sequence Repeats）標記以其在基因組內(nèi)的多態(tài)性豐富、檢測技術(shù)簡單、結(jié)果可靠、重復性好等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于玉米種子真實性和純度檢測中[3，6-8]。

多重PCR 技術(shù)是在一個反應(yīng)體系中加入多對反應(yīng)引物，擴增出多個目的條帶的技術(shù)。由于該技術(shù)具有快速高效、低成本等優(yōu)點，目前在生物學的各個領(lǐng)域已得到廣泛的應(yīng)用[9-12]。因此本研究的主要目的在于利用SSR標記，針對本公司主推不同系列的‘德美亞’品種，篩選具有多態(tài)性的SSR 引物，并組建多重引物組合，將多重PCR技術(shù)應(yīng)用到玉米種子純度鑒定中，制定出一套玉米品種純度鑒定方案，指導大田生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用本公司提供的‘德美亞’雜交種及其親本為試驗材料，‘德美亞’品種主要分為3 個系列，分別是‘德美亞1號’、‘德美亞2號’和‘德美亞3號’。

1.2 SSR引物

SSR引物來自本實驗室，引物序列主要來自中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T 1432—2007上公布的玉米40對核心SSR引物，并由上海英俊生物技術(shù)有限公司北京部完成引物合成。

1.3 玉米基因組DNA的提取

本試驗采用4 種基因組DNA 提取方法：CTAB 提取法（參考MURRAY 等[13]）、磁珠法、改良的SDS 提取法（96孔板提?。?、堿煮法[14]。

1.3.1 CTAB提取法

取玉米葉片組織置于2.0 mL離心管中（離心管中裝有5 mm 鋼珠），用液氮研磨成粉末；加入800μL 預(yù)熱到65 ℃的1×CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）提取液，放入65 ℃水浴鍋中水浴30 min，期間顛倒混勻兩次；然后加入等體積（800μL）的氯仿/異戊醇（24∶1），顛倒混勻1 min；12 000 r/min 離心15 min，取700μL 上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL 離心管中；加入500μL預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，可見絮狀沉淀，用毛細管勾出絮狀沉淀，輕輕轉(zhuǎn)移至另一新的1.5 mL離心管中，加入200μL 70%的乙醇洗滌一次，盡量吸干管中的乙醇，將DNA在管中自然晾干，最后加入100μL的TE1.0（含有RNase）溶解DNA，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 磁珠法

采用GOMagTMPlant DNA Kit，配套使用KingFisher Flex自動核酸提取儀。具體操作步驟試劑盒說明書有說明。

1.3.3 改良的SDS提取法

取玉米葉片組織置于96 孔板中（板中裝有5 mm 鋼珠），用壓板機將蓋子壓緊后放置-80 ℃冰箱中2～3 h；用研磨儀研磨成粉末，每個孔中加入400 μL 的SDS 提取液，用壓板機將蓋子壓緊后，在磨樣機中磨樣2 min；離心1 min，4 000 r/min，隨后加入200μL NH4COOH，室溫放置10～15 min；離心25～30 min，4 000 r/min，將400μL 上清轉(zhuǎn)移至一新的96 孔板中，然后加入0.7 倍體積280μL 異丙醇，混勻，然后-20 ℃冰箱中放置15～30 min；離心15 min，4 000 r/min，小心將上清倒掉，然后加入300μL 70%乙醇；離心1 min，4 000 r/min，小心倒掉上清，吹干，加入100μL TE1.0（含有RNase）溶解DNA，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 堿煮法

取玉米胚組織（挖胚）放在96孔深孔板中（板中裝有5 mm 鋼珠），加入0.1 mol/L NaOH 提取液250μL，以蓋住樣品為準，用封口膜封上深孔板，密封嚴實（避免水浴時水進入到樣品中），水沸騰后煮沸15 min，水量要適宜。煮沸15 min 后，將樣孔板拿出，擦干上面的水，揭下封口膜，擦干水，加入等體積250 μL TE 緩沖液（pH2.0），靜置至室溫備用。

1.4 DNA質(zhì)量檢測

提取的玉米基因組DNA 采用超微量分光光度計Nanodrop8000 檢測其濃度，并用1%的瓊脂糖凝膠檢測基因組DNA 的質(zhì)量。

1.5 PCR擴增

單重PCR 體系：20 ng DNA 1μL、10×Buffer 1μL、引物0.4μL、Taq 酶0.1μL、dNTP 0.2μL、ddH2O 7.3μL，總體積為10μL。

多重PCR 體系中，相應(yīng)地增加引物對數(shù)，但是引物用量與單重PCR 體系中一致，為保證PCR 體系不變，相應(yīng)地減少ddH2O 用量。

PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進行35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.6 瓊脂糖凝膠電泳檢測

多重PCR擴增產(chǎn)物采用4%瓊脂糖凝膠電泳檢測，恒壓160 V 電泳1 h，用凝膠成像儀掃描結(jié)果并記錄。

1.7 SSR引物多態(tài)性篩選

將40對SSR 引物分別對‘德美亞1 號’、‘德美亞2號’和‘德美亞3 號’的父本和母本進行多態(tài)性篩選，一共是6 個樣品，選用父母本質(zhì)量較好的DNA 進行引物多態(tài)性篩選，篩選雙親之間片段大小有明顯差異的，并且用4%瓊脂糖凝膠檢測能夠明顯看出差異的及擴增穩(wěn)定的最適合引物，為后續(xù)組建多重引物組合做準備。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同DNA提取方法的比較

不同方法提取的玉米基因組DNA 濃度結(jié)果見表1。不同提取方法得到的玉米基因組DNA 質(zhì)量存在一定的差異，通過Nanodrop 測定DNA 濃度結(jié)果顯示CTAB 法和SDS 法提取的樣品A260/A280 比值在2.0 左右，磁珠法提取的樣品A260/A280比值在1.9左右，但是前兩者方法提取的DNA 產(chǎn)量很高，所提DNA 濃度是磁珠法所提DNA 濃度的2倍左右；而堿煮法提取的樣品A260/A280 比值較差，DNA 濃度也偏低，說明此方法提取的DNA中含有較多雜質(zhì)。

表1 不同方法提取的玉米基因組DNA 的紫外檢測結(jié)果Table 1 The UV test results of maize genome DNA with different extraction methods

將玉米基因組DNA 用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，結(jié)果（圖1）顯示CTAB、SDS和磁珠法所提的DNA帶型清晰明亮，說明所提的DNA含量較高，主帶完整，條帶無嚴重拖尾現(xiàn)象，說明DNA基本上沒有降解；膠孔內(nèi)干凈，說明沒有其他雜質(zhì)的成分。相反，堿煮法所提取的DNA 在膠圖中沒有看到主帶，說明此方法提取的DNA濃度極低，質(zhì)量差。

圖1 4種方法提取的玉米基因組DNA質(zhì)量比較Fig.1 Comparison of DNA quality of maize genome using the four extraction methods

4 種方法提取的DNA 進行PCR 擴增時，用一對引物進行擴增時，擴增效果都比較好，彼此之間沒有太大的差異；用多對引物同時進行擴增時，CTAB 法、磁珠法和SDS法都能得到很好的擴增效果，擴增產(chǎn)物帶型清晰，條帶大小一致，但是堿煮法提取的DNA擴增效果差，擴增產(chǎn)物帶型呈現(xiàn)彌散狀態(tài)，不穩(wěn)定。比較這4種方法的優(yōu)缺點，CTAB法雖然提取的DNA 質(zhì)量高、量大，但是步驟繁瑣，并且存在有毒試劑（甲醛）；磁珠法提取DNA 質(zhì)量好但成本太高；堿煮法前期挖胚工作耗費時間且DNA擴增效果不好；SDS法提取DNA 質(zhì)量好，步驟相對簡單，且有害試劑少，更適合對于純度鑒定這種大樣本的DNA 提取，綜上所述，為了節(jié)省時間和降低成本，我們選用SDS法進行后續(xù)的樣本DNA提取工作。

2.2 SSR引物多態(tài)性篩選的確定

利用公布的40對玉米SSR引物分別對‘德美亞1號’、‘德美亞2號’和‘德美亞3號’的親本及F1進行引物多態(tài)性初步篩選，將每一個引物位點都對母本、父本和F1進行PCR 擴增，并通過4%瓊脂糖凝膠電泳檢測。初步篩選結(jié)果：‘德美亞1號’親本之間篩選出16對引物，‘德美亞2號’親本之間篩選出23對引物，‘德美亞3號’親本之間篩選出21對引物。隨后將初步篩選出的這些引物進行復篩再次驗證，根據(jù)復篩的結(jié)果，我們選擇親本之間擴增產(chǎn)物條帶大小差異較大，并且擴增穩(wěn)定，沒有非特異性擴增的優(yōu)秀引物。最終，‘德美亞1號’篩選出5 對引物分別是：P01、P05、P10、P12 和P37；‘德美亞2 號’篩選出9 對引物分別是：P06、P11、P13、P21、P25、P30、P33、P37 和P40；‘德美亞3 號’篩選出9 對引物分別是：P08、P12、P13、P14、P22、P30、P34、P37和P40。引物多態(tài)性篩選電泳結(jié)果見圖2、圖3和圖4。

圖2 德美亞1號引物多態(tài)性復篩結(jié)果Fig.2 The results of the second selection of primer polymorphism in Demeiya1

圖3 德美亞2號引物多態(tài)性復篩結(jié)果Fig.3 The results of the second selection of primer polymorphism in Demeiya2

圖4 德美亞3號引物復篩電泳結(jié)果Fig.4 The results of the second selection of primer polymorphism in Demeiya3

2.3 多重引物組合的設(shè)計與篩選

我們利用前期引物多態(tài)性篩選的結(jié)果，將‘德美亞’不同系列所篩選到的引物進行毛細管電泳（QIAxcel Advanced），進而能夠具體得到每對引物擴增產(chǎn)物片段的大小，然后根據(jù)片段大小進行多重引物的組合，這樣既可以避免出現(xiàn)擴增片段重合的現(xiàn)象，又能縮短篩選時間，提高工作效率。

2.3.1 3重PCR擴增

對于雜交種而言，每一對引物可以產(chǎn)生兩條譜帶，引物數(shù)量越多，擴增的譜帶數(shù)也會越多，很容易出現(xiàn)譜帶之間重疊或者距離相近的現(xiàn)象，再加上瓊脂糖凝膠的分辨率有限，所以需要進行組合的引物數(shù)量不能太多，同時需要考慮引物在染色體上的位置，選擇位于不同染色體上的引物進行組合。因此我們主要進行了3重引物的組合：‘德美亞1號’雜交種設(shè)計了3組3重引物組合，并命名為1-1、1-2和1-3；‘德美亞2號’雜交種設(shè)計了13組3重引物組合，并命名為2-1、2-2、2-3……2-13；‘德美亞3號’雜交種設(shè)計了10組3重引物組合，并命名為3-1、3-2、3-3……3-10?！旅纴啞煌盗?重引物組合設(shè)計見表2。

表2 德美亞1、2、3 號3 重引物組合匯總Table 2 Three-fold primer group from Demeiya1,2 and 3

為了進一步鑒定多重引物組合的擴增效果，我們選擇用CTAB法提取的DNA作為模板，同時將設(shè)計好的3 重引物組合分別對母本、父本和雜交種進行PCR 擴增，兩次重復，即分別將3 對引物依次加入到同一PCR管中，所用試劑用量和DNA 模板用量均與單重PCR 相同，PCR 體系為10μL，擴增程序也與單重PCR 相同，PCR擴增結(jié)束后，用4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。多重擴增凝膠電泳分離效果見圖5。

圖5 德美亞1號、2號、3號3重引物組合凝膠擴增效果Fig.5 The amplification results of primer by three-fold PCR in Demeiya1,Demeiya2 and Demeiya3

從結(jié)果中可以看出，‘德美亞1 號’3個組合擴增效果并不是很理想，組合1-1 中引物P10 擴增效率太低，無論在親本和雜交種中，P10 擴增條帶都偏弱，這可能是引物之間存在競爭性抑制作用導致。后期我們將P10引物進行優(yōu)化，但是效果并不明顯。組合1-2中引物P12的父本帶與P01的父本帶重合，難以分辨，所以導致在父本中我們只看到兩條帶，而在雜交種中，我們只看到5條帶。組合1-3的問題與組合1-2是一樣的。所以最后我們采用P01和P37進行兩重PCR擴增，擴增效果非常好，條帶清晰并且能夠區(qū)分開。

針對于‘德美亞2 號’，經(jīng)過第一次篩選，我們從13個組合中篩選到了9 個擴增效果好的組合：2-1、2-2、2-5、2-6、2-7、2-8、2-11、2-12、2-13；經(jīng)過第二次篩選，進而從這9個組合中我們最終選擇5個擴增效果更好的組合：2-1、2-7、2-8、2-12 和2-13。針對于‘德美亞3 號’，我們從10 個組合中篩選到了5 個擴增效果較好的組合：3-1、3-3、3-5、3-7、3-10。

每一個組合的3 對引物在親本和雜交種中都能擴增出清晰的條帶，在親本中表現(xiàn)出3 條帶，在雜交種中表現(xiàn)出6 條帶，條帶數(shù)量沒有增加或減少，條帶的位置也沒有發(fā)生變化，并且條帶之間能夠區(qū)分開來。而剩余的其他組合擴增效果較差，擴增條帶較弱，條帶之間距離相近，難以分辨，同時3對引物中有的只擴增2對引物或者1對引物，組合引物擴增效率太低，引物之間存在很強的競爭性抑制作用，并且表現(xiàn)也不穩(wěn)定。

2.3.2 4重和5重PCR擴增

對于自交系而言，每一對引物只能產(chǎn)生一條譜帶，所以相比雜交種來說，引物數(shù)量可以相應(yīng)地增加，因此我們在3重引物的基礎(chǔ)上設(shè)計了4重、5重引物組合來鑒定不同的自交系。4重和5重的PCR擴增體系同3重一樣，只是相應(yīng)地增加了引物的數(shù)量，‘德美亞1 號’親本采用4重引物組合（P01+P05+P12+P37）鑒定，‘德美亞2 號’親本也采用4 重引物組合（P06+P37+P21+P30）鑒定，德美亞3 號親本采用5 重引物組合（P08+P40+P12+P13+P37）鑒定，4重和5重都得到了很好的擴增效果，同時表明本試驗所采用的擴增體系和擴增程序適宜2～5重PCR反應(yīng)。自交系的多重引物PCR 擴增效果見圖6。

圖6 德美亞自交系4重或5重引物PCR擴增效果Fig.6 The amplification results of primer by four or five-fold PCR in Demeiya inbreds

2.4 多重PCR技術(shù)檢測玉米雜交種純度

我們利用所確定的3重引物組合進行‘德美亞1 號’、‘德美亞2號’和‘德美亞3號’雜交種種子純度的鑒定，每份樣品檢測100個單株，并且用SDS法進行DNA 提取?！旅纴?號’采用兩重PCR+單重PCR 組合模式進行純度鑒定，‘德美亞2號’選用組合2-1進行純度鑒定，‘德美亞3號’所篩選的5個最優(yōu)組合中都具有P30這個引物，而由于后期我們進行雜交種純度鑒定時發(fā)現(xiàn)引物P30該位點表現(xiàn)極不穩(wěn)定，在雜交種中該位點出現(xiàn)單帶的比例很高，所以這個引物后續(xù)將不能用于雜交種純度的檢測，所以我們使用組合3-4（P08+P12+P13）來進行‘德美亞3號’雜交種純度鑒定。部分樣品雜交種純度鑒定的結(jié)果見圖7。

圖7 多重PCR技術(shù)檢測雜交種純度Fig.7 Hybrid purity tested by multi-PCR technology

從圖7 中可以看出，在‘德美亞1 號’雜交種純度檢測中，第1 號單株為雜株，引物P01 擴增出單帶，而其他樣品均擴增出正常的4 條帶，并且?guī)捅憩F(xiàn)一致。在‘德美亞2 號’雜交種純度檢測中，組合2-1 和組合2-13均能檢測出雜種子，雜種子的帶型不是來自本身父母本的結(jié)合，而是來自外源花粉的污染，其中組合2-13中的第10 號單株，3 對引物都擴增出單帶，后經(jīng)過分析，表明此單株屬于母本自交苗。‘德美亞3號’雜交種純度檢測中，第15號單株表現(xiàn)異常帶型，其他單株的帶型均一致，該組合均能擴增出6條帶，并且?guī)驼！?/p>

在玉米雜交種純度檢測中，采用多重引物PCR 技術(shù)檢測不僅能夠提高檢測效率，節(jié)省成本，還能夠顯著提高檢測的準確性。

3 討論

3.1 玉米基因組DNA提取方法

DNA 是進行分子生物學研究的前提，DNA 質(zhì)量的好壞直接決定了實驗成敗，因此獲得高質(zhì)量的DNA 對研究的成功起著至關(guān)重要的作用[15]。目前，植物DNA 提取方法主要有標準的CTAB 法、SDS法、堿煮法，而磁珠法用的較少，主要是該方法成本太高，對DNA 質(zhì)量具有特定要求的試驗才會采用。不同試驗對于DNA 的質(zhì)量要求也不同，本試驗中只是進行純度鑒定，所以無需將DNA 保存很久，由于純度鑒定需要檢測的單株樣品量大，所以采用最少的試劑用量和簡便的操作流程進行DNA 提取是最理想的[16-18]。在本試驗4種DNA 提取方法中，快速堿煮法是最理想的DNA 提取方式，對于單重PCR 來說該方法效果較好，穩(wěn)定性相對較高，但是對于多重PCR 來說其實并不理想，試驗中雜交種3 重PCR 擴增條帶未全部顯示出來，無法對結(jié)果進行統(tǒng)計。綜合考慮改進的SDS法是比較理想的DNA 提取方法，相對于CTAB和磁珠法，操作簡便，有毒試劑少，并且成本較低，完全能夠滿足試驗的需求。

3.2 多重PCR 技術(shù)在玉米品種純度鑒定上的應(yīng)用價值

多重PCR 即在單重PCR 的基礎(chǔ)上增加引物的數(shù)量，多對引物采用相同的退火溫度和退火時間，便于構(gòu)建多重引物組合，引物之間可能競爭但所組建的引物組合均保證各個引物成功擴增[19]。相比于單重PCR，多重PCR 不僅能夠減少試劑和樣本的用量，同時也大大節(jié)省了人力和時間。王偉等研究玉米SSR 標記的多重PCR中指出利用多重PCR技術(shù)能夠使工作效率提高2～6倍[20]。

目前，已經(jīng)報道了很多關(guān)于SSR 標記多重PCR 技術(shù)檢測品種純度的研究[7，11，21-23]。譚君等利用多重PCR技術(shù)鑒定玉米品種研究中，以3 個玉米自交系和4 個雜交種為材料，成功構(gòu)建了2～5 重引物組合，并有效應(yīng)用于玉米種子純度鑒定中[24]。吳明生等利用3 重PCR 檢測玉米雜交種純度，結(jié)果表明多重PCR 擴增效果非常理想，很容易將雜種子鑒別出來[25]。而在本研究中，針對玉米雜交種，我們也同樣采用3 重引物組合的方法，擴增效果非常好，組合中的每一對引物都得到成功擴增，目的條帶清晰。

玉米雜交種純度主要是受母本去雄不及時或不徹底導致自交苗產(chǎn)生，以及外源花粉污染形成異型株，或者機械混雜的影響，其中母本自交苗是玉米雜交種純度鑒定的關(guān)鍵，為了準確地將自交苗種子和雜種子鑒別出來，至少需要3 對引物，得到的結(jié)果才是可靠的。因此，我們構(gòu)建3重引物組合可以滿足純度鑒定的要求。針對玉米自交系，我們也嘗試了4 重和5 重引物組合，能夠明顯區(qū)分不同的自交系，都得到了很好的擴增效果。利用篩選出的這幾套多重引物組合，可以有效應(yīng)用到生產(chǎn)上大面積推廣的玉米雜交種純度的檢測，確保鑒定結(jié)果可靠、高效、快速和低成本。

4 結(jié)論

本試驗成功地構(gòu)建了‘德美亞’系列玉米品種的特定純度鑒定引物組合，‘德美亞1號’親本采用4重引物組合（P01+P05+P12+P37）鑒定，‘德美亞2號’親本也采用4重引物組合（P06+P37+P21+P30）鑒定，德美亞3號親本采用5 重引物組合（P08+P40+P12+P13+P37）鑒定，4 重和5 重都得到了很好的擴增效果，同時表明本試驗所采用的擴增體系和擴增程序適宜2～5重PCR反應(yīng)。為今后‘德美亞’系列品種鑒定提供了便利，同時也為其他玉米品種的純度鑒定提供了思路。