洪長根

PCR就是聚合酶鏈式反應(yīng)的簡稱，是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法。雖然人教版教材僅用不到400個字和兩幅圖作了簡單介紹，但基于PCR在基因工程中的重要地位，使得涉及到的訓練越來越多、越來越難，相關(guān)的疑問和剖析大致有以下一些。

1 PCR原料是dATP、dTTP、dCTP、dGTP的原因

通過《必修2.遺傳與進化>的學習，學生知道DNA復制的原料是四種脫氧核苷酸，但教材的圖1-8中卻出現(xiàn)了dATP、dTTP、dCTIP、dGTP。學生知道ATP是三磷酸腺苷，但不知道dATP、dTTP、dCTP、dGTP。其實dATP、dTTP、dCTP、dGTP指的是三磷酸脫氧核苷酸（dNTP），是合成脫氧核糖核酸的“最小單位”。DNA復制時，脫氧核苷酸鏈的延伸使用的原料只能是dNTP。DNA的合成需要能量，dNTP才能提供足夠的能量，而dNMP則做不到，用這種原料所完成的反應(yīng)不可逆且極易發(fā)生。因為當脫氧核苷酸鏈延伸一個一磷酸脫氧核苷酸（dNMP），生成焦磷酸（Fl4P207），然后焦磷酸在焦磷酸酶的催化下迅速分解為兩個磷酸，使得反應(yīng)的總吉布斯自由能大幅降低，這是細胞內(nèi)典型的焦磷酸解驅(qū)動的反應(yīng)之一。其他如糖原的磷酸解、tRNA與氨基酸的結(jié)合反應(yīng)也都是焦磷酸解驅(qū)動的反應(yīng)。

2 PCR-個周期的大約時間

PCR過程雖然經(jīng)過復性（90-95℃）、退火（55-60℃）、延伸（70-75℃）3個基本反應(yīng)步驟才能完成，但實驗完成的時間卻只有2～4 min，也就是說2--3 h就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

3 引物的概念及PCR過程使用引物的原因

在PCR技術(shù)中，擴增目的基因的方法其實就是必修2中的DNA復制。那么，復制為什么要引物？這引物的化學本質(zhì)是什么？復制完成后引物到哪里去了？……學生會產(chǎn)生出一串關(guān)于引物的疑問。

在PCR過程中之所以需要引物是因為在DNA復制中DNA聚合酶僅僅可以把新的脫氧核苷酸加到已有的DNA鏈上，據(jù)此可知：引物其實就是引子，是一小段單鏈DNA（體內(nèi)DNA復制所用的引物是RNA，RNA引物形成后，由DNA聚合酶Ⅲ催化將第一個脫氧核苷酸按堿基互補原則加在RNA引物3一OH端而進入DNA鏈的延伸階段），是作為DNA復制的起始點。

3.1 引物的長度

DNA復制的引物為單鏈DNA，其長度常用的是18-27個脫氧核苷酸，但不應(yīng)大于38，因為過長的引物會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進行反應(yīng)。

3.2 引物的種類

DNA復制是以依解開的兩條鏈都作模板的，PCR也不例外，故PCR擴增時應(yīng)有兩種引物，即分別能與兩條模板鏈配對的兩種單鏈DNA。

3.3 需要引物的數(shù)量

引物雖然起的作用是開始進行脫氧核苷酸鏈的延長，但其本質(zhì)就是復制時所要合成的新鏈中的一段，完全沒有必要在DNA合成結(jié)束后脫下來再用于下個PCR周期（體內(nèi)DNA復制因用的引物是RNA，最后是被DNA聚合酶I切除的）。這就涉及到引物的消耗問題，如果擴增的數(shù)量大，則的消耗的引物也多，具體數(shù)據(jù)應(yīng)該等于整個PCR過程中新合成的DNA單鏈數(shù)。

3.4 引物的結(jié)合位點

由于DNA復制只能是5'—3 '進行，而DNA的兩條單鏈又是反向平行的，這就決定了兩種引物的結(jié)合位點是模板鏈的3端。如果一種在左側(cè)的話，另一種應(yīng)在右側(cè)。學生產(chǎn)生疑問的原因是必修2學到DNA復制產(chǎn)生的子代DNA是與親代DNA -模一樣的，這就意味著引物都應(yīng)該結(jié)合在模板3的起始端，但訓練中涉及到PCR引物結(jié)合位點都不是3的起始端，如圖1所示。

為什么會出現(xiàn)這種差別？這是因為獲取目的基因時，不可能（不容易找到這樣的限制酶）正好在目的基因的前后切下來，使得獲取的目的基因的前后端或多或少帶有一段多余的DNA片段，為了不讓多余的DNA片段進入受體細胞，進而跟著表達而影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能。即便沒有影響，也由于引物擴增跨度一般以200-500 bp為宜，特定條件下才擴增長至10 kb的片段。所以，引物設(shè)計的結(jié)合位點一般是在目的基因起始序列附近。

4 PCR的過程中出現(xiàn)3種不同長度的DNA鏈的原因

4.1 以原始模板為模板合成的是長鏈

從基因文庫中最初獲取的DNA經(jīng)熱分開后的就是兩條長度最長的原始模板，以此為模板合成新單鏈時。引物是從3端開始延伸，但引物前的模板（5端的一小段）不能被復制，復制的產(chǎn)物就是長鏈。長鏈比原始模板缺了一端的序列，因此，其長度不如原始模板。

4.2 以長鏈為模板合成的是短鏈

當PCR進入第二周期后，引物與新合成的長鏈結(jié)合時，也不能從開始部位結(jié)合，因為原始模板3端在上個周期復制時都復制出來了。由此可知，以長鏈為模板復制出來的新鏈又比長鏈短了一點，名為短鏈。

4.3 以短鏈為模板合成的也是短鏈

從第三個周期開始，將出現(xiàn)以短鏈為模板復制出的與短鏈等長的新鏈，這樣復制出的子代DNA就是平時所說的通過PCR克隆出來的目的基因。

5 PCR擴增過程中各種DNA鏈的變化規(guī)律

在PCR擴增過程中，理論上講DNA分子總數(shù)為2''（n為PCR循環(huán)數(shù)），各種DNA單鏈總數(shù)為2×2''，但在實際反應(yīng)中并不能達到理論值。因為，反應(yīng)初期DNA片段的增加是正常的，但隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴增的DNA片段的數(shù)量就會降下來甚至停止，這稱作平臺期。一般情況下正常的增長大約是30個循環(huán)左右。好在訓練也只涉及到最初幾個循環(huán)的計算，具體的變化規(guī)律如下。

5.1 原始模板鏈的數(shù)量

原始模板永遠只有兩個。因為以原始模板為模板復制出的新鏈是長鏈（其長度比原始模板短一點）。

5.2 長鏈的數(shù)量

既然用原始模板能復制出來的是長鏈，原始模板又永遠只有兩個，這樣就能保證每經(jīng)過一個反應(yīng)周期，長鏈就可以增加2個。又由于以長鏈為模板復制出的新鏈為短鏈（其長度比長鏈還短一點），二者合起來計算，長鏈的變化規(guī)律是：PCR循環(huán)一次增加2條。

5.3 短鏈的數(shù)量

短鏈的情況有點復雜，從模板的角度分析的結(jié)果是以長鏈為模板復制出的新鏈是短鏈，當短鏈出現(xiàn)后，再以短鏈為模板復制出的新鏈也是短鏈;從時間的角度分析的結(jié)果是第一個反應(yīng)周期沒有短鏈產(chǎn)生，第二個反應(yīng)周期通過以長鏈為模板首次復制出短鏈，到第三個反應(yīng)周期時，就會以兩種模板同時復制出短鏈。關(guān)于短鏈的數(shù)量變化可以認為是按指數(shù)倍數(shù)增加的，但找不到一個簡單的數(shù)學式來表達，若要求某個反應(yīng)周期后的短鏈數(shù)，只能根據(jù)DNA單鏈總數(shù)、原始模板數(shù)和長鏈數(shù)來推算。好在這三個數(shù)據(jù)都是簡單而有規(guī)律的，相關(guān)推算可以參考圖2進行。