張 麗 王明洋 牛紅妹 張 蘭 李 林

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥學(xué)部 北京市神經(jīng)藥物工程技術(shù)研究中心 北京腦重大疾病研究院 神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053)

腦小血管病(cerebral small vascular disease, CSVD)是一類病理改變主要累及顱內(nèi)小血管的疾病，臨床主要表現(xiàn)為腦卒中、認(rèn)知功能障礙、精神異常等[1]。隨著社會(huì)人口老齡化的加劇，該病發(fā)病率日趨增高，且有研究[2]顯示CSVD可使腦卒中發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)增加2～10倍，誘發(fā)36%～67%癡呆患者發(fā)病，是引起腦卒中和血管性癡呆的主要原因[3-4]。腦白質(zhì)損傷是CSVD引起病理變化的主要亞型，也是最常見(jiàn)典型的病理表現(xiàn)[5]。與CSVD相關(guān)的白質(zhì)損害被認(rèn)為是由慢性低灌注引起的，可導(dǎo)致認(rèn)知障礙[6]。CSVD直接或間接誘發(fā)繼發(fā)性病變，威脅患者的健康和生活質(zhì)量，給患者和社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，目前迫切需要開(kāi)發(fā)治療CSVD的有效藥物。

淫羊藿黃酮(epimedium flavanoids, EF)是從淫羊藿中提取的主要成分，具有延緩衰老、調(diào)節(jié)免疫、抑制下丘腦-垂體-腎上腺軸的作用[7-8]。前期研究[9]顯示EF可改善神經(jīng)細(xì)胞β-淀粉樣前體蛋白[myloid beta(A4)precursor protein, APP]轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，改善雙環(huán)己酮草酰二腙(cuprizone,CPZ)誘導(dǎo)的腦白質(zhì)病變小鼠模型的神經(jīng)功能損傷，而EF是否能通過(guò)減輕白質(zhì)損傷改善慢性低灌注引起的認(rèn)知功能障礙，從而達(dá)到治療CSVD的目的尚未可知。本研究采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型大鼠模擬CSVD的慢性腦缺血低灌注病理狀態(tài)，采用影像學(xué)及組織化學(xué)方法觀察EF對(duì)白質(zhì)損傷的影響，為研制能夠改善認(rèn)知功能障礙的新型抗CSVD藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

淫羊藿黃酮(epimediun flavanoids, EF)，由江蘇康緣藥業(yè)有限公司提供。尼莫地平片(nimodipine)，購(gòu)自正大青春寶藥業(yè)，羧甲基纖維素鈉、蔗糖、多聚甲醛、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等購(gòu)于北京法杰德化學(xué)試劑公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體級(jí)(specific pathogen free, SPF) SD雄性大鼠，體質(zhì)量280～300 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：11400700139347。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理編號(hào)：AEEI-2018-132。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。飼養(yǎng)溫度恒定為(22±3) ℃，相對(duì)濕度恒定為60%±5%，12 h光照/12 h黑暗循環(huán)，自由進(jìn)水及飼料。

1.3 動(dòng)物分組及處理

采用數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為5組，每組7只：假手術(shù)組(sham)，模型組(model)，100 mg/kg EF給藥組[model+EF(L)]，200 mg/kg EF給藥組[model+EF(H)]，陽(yáng)性藥尼莫地平組(model+nimodipine，10 mg/kg)。雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)(permanent bilateral common carotid artery ligation, 2VO)術(shù)后24 h灌胃給藥，每天固定時(shí)間1次，連續(xù)給藥6周，sham、model組給予等體積的0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))羧甲基纖維素鈉。

1.4 模型制備

將SD大鼠深度麻醉后，行2VO,四肢固定在木板上,通過(guò)頸部腹側(cè)切口將雙側(cè)頸總動(dòng)脈與頸部交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)分離，然后用5.0絲線結(jié)扎頸總動(dòng)脈。假手術(shù)組除了沒(méi)有結(jié)扎頸頸總動(dòng)脈外，其他操作與手術(shù)組相同。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，維持大鼠的體溫一直保持在37 ℃左右，縫合皮膚后，將大鼠放回籠子，待蘇醒后正常喂養(yǎng)。

1.5 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)

采用新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)2VO大鼠的物體分辨能力，以物體分辨指數(shù)(discrimination index, DI)為檢測(cè)指標(biāo)，反映大鼠胼胝體部位相關(guān)的空間記憶能力，從而反映大鼠的認(rèn)知能力。給藥結(jié)束后(造模后43 d)進(jìn)行新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)行為學(xué)測(cè)試，參照Ma等[10]的實(shí)驗(yàn)方法，主要分為3個(gè)階段進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。具體操作步驟：第1天為適應(yīng)期：將大鼠放于均勻光照的正方形木箱中，其尺寸為100 cm ×100 cm×100 cm(長(zhǎng)×寬×高),自行適應(yīng)性活動(dòng)10 min。第2天為熟悉期：在正方形木箱中放入2個(gè)相同的圓柱體(直徑為5 cm，高為5 cm)，圓柱體置于正方形木箱斜對(duì)角線的1/3處，將大鼠放于反應(yīng)箱中自行活動(dòng)10 min，記錄其在10 min內(nèi)對(duì)每個(gè)圓柱體的探索時(shí)間(以大鼠的嘴湊近圓柱體<0.5 cm，方向必須對(duì)著該圓柱體才計(jì)入探索時(shí)間，站在圓柱體上等不計(jì)入時(shí)間)。第3天為識(shí)別期：放入新的一個(gè)立方體(高為5 cm，直徑為5 cm)替換其中的一個(gè)圓柱體，分別記錄大鼠在10 min 內(nèi)探索圓柱體和立方體的時(shí)間。計(jì)算各組大鼠第3天的分辨指數(shù)，數(shù)值越大，反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物空間記憶能力越好。計(jì)算公式為：

1.6 磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)檢測(cè)方法

各組大鼠(n=3)分別于行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后(造模后47 d)進(jìn)行小動(dòng)物核磁掃描。大鼠磁共振檢測(cè)在首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心影像教研室完成。用快速自旋回波脈沖序列進(jìn)行彌散張量成像(diffusion tensor imaging, DTI)，檢測(cè)腦白質(zhì)胼胝體和視束部位微觀結(jié)構(gòu)的改變。應(yīng)用MRI-DTI觀察大鼠腦白質(zhì)紋狀體斷面胼胝體部位軸突與髓鞘結(jié)構(gòu)的改變。大鼠經(jīng)JD醫(yī)用麻醉系統(tǒng)吸入2.5%(體積分?jǐn)?shù))異氟醚進(jìn)行麻醉，待麻醉成功后，取俯臥位，頭置于線圈中央，采用7.0T小動(dòng)物專用核磁掃描儀進(jìn)行大鼠全腦掃描，維持大鼠體溫在37 ℃。DTI掃描參數(shù)為：TR 18 000 ms，TE 25 ms，MTX128×128，F(xiàn)OV:3 cm×3 cm,t=8 min, 層厚：2 mm。利用Paravision version 5.1軟件獲得分?jǐn)?shù)各向異性(fractional anisotropy, FA)、表觀擴(kuò)散系數(shù)(apparent diffusion coefficient,ADC)和3個(gè)特征向量(λ1、λ2、λ3)圖。使用Paravision version 5.1軟件，在每只大鼠的FA圖上手動(dòng)追蹤胼胝體，左右視束作為感興趣區(qū)(region of interesting, ROI)，然后，將感興趣區(qū)移位到軸向擴(kuò)散系數(shù)(axial diffusion coefficient, AD)和徑向擴(kuò)散系數(shù)(radial diffusivity coefficient, RD)圖上的相同位置，記錄各項(xiàng)指標(biāo)。通過(guò)將主特征向量和FA圖組合成RGB圖像，生成FA偽彩圖。

1.7 LFB髓鞘染色法

造模后48 d各組大鼠取3只進(jìn)行灌注取材，腦組織行冠狀位冰凍切片，切片厚度為30 μm。每只大鼠取胼胝體部位腦片3張，每組3只，貼于預(yù)先用明膠處理過(guò)的載玻片上。待自然晾干后，切片經(jīng)蒸餾水清洗，入0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))堅(jiān)牢藍(lán)(luxol fast blue, LFB)溶液，于室溫密封浸染24 h。腦片經(jīng)蒸餾水清洗后，95%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))乙醇-0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))碳酸鋰水溶液-70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇分色，直至顯微鏡下觀察灰質(zhì)和白質(zhì)部位區(qū)分清晰，背景無(wú)色為止。用蘇木精-伊紅復(fù)染5 min。用30%-50%-70%-90%-100%(體積分?jǐn)?shù))乙醇梯度脫水，每次10 min，髓鞘呈鮮藍(lán)色，核呈深藍(lán)色，二甲苯透明，中性樹膠封片。正置顯微鏡下觀察并拍照，對(duì)各組LFB染色情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：正常；1級(jí)：神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)紊亂；2級(jí)：明顯空泡形成；3級(jí)：有髓神經(jīng)纖維消失。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 EF對(duì)2VO模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

組間大鼠物體分辨指數(shù)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示，與sham組相比，model組的分辨指數(shù)顯著下降(P<0.05)，與model組相比，EF各劑量及陽(yáng)性藥組分辨指數(shù)均顯著升高(P<0.05,圖1)。

圖1 EF對(duì)2VO模型大鼠物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)物體分辨指數(shù)的影響Fig.1 Effects of EF on discrimination index in new object recognition test of 2VO rats #P<0.05 vs sham group;*P<0.05，**P<0.01 vs model group. EF:epimedium flavonoids; 2VO: permanent bilateral common carotid artery ligation; EF(L): epimedium flavonoids 100 mg/kg; EF(H): epimedium flavonoids 200 mg/kg; Nim: nimodipine.

2.2 EF對(duì)2VO模型大鼠胼胝體部位DTI參數(shù)變化的影響

各組大鼠間胼胝體部位FA、RD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，ADC、AD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。兩兩比較顯示，與假手術(shù)組相比，與模型組相比，EF高劑量(200 mg/kg)組大鼠胼胝體部位FA值明顯升高(P<0.05)，RD值顯著降低(P<0.05)。EF給藥6周能夠減輕腦缺血致胼胝體部位白質(zhì)纖維束損傷。

圖2 EF給藥對(duì)2VO模型大鼠胼胝體部位DTI參數(shù)的影響Fig.2 Effects of EF on white matter fiber bundles in corpus callosum of 2VO rats detected by MRI-DTIA: color-coded FA images in the corpus callosum section at bregma 0.26 mm, B: quantitative analysis of FA； C: quanlitative ADC; D: analysis of AD; E: analysis of RD in the corpus callosum. n=6. #P<0.05, ##P<0.01 vs sham group; *P<0.05 vs model group; EF：epimedium flavonoids; MRI: magnetic resonance imaging; DTI: diffusion tensor imaging; FA: fractional anisotropy; ADC: apparent diffusion coefficient; AD: axial diffusion coefficient; RD: radial diffusivity; 2VO: permanent bilateral common carotid artery ligation; EF(L): epimedium flavonoids 100 mg/kg; EF(H): epimedium flavonoids 200 mg/kg; Nim: nimodipine.

2.3 EF對(duì)2VO模型大鼠視束部位DTI參數(shù)變化的影響

各組大鼠間視束部位FA、 ADC、AD、RD值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較顯示，EF給藥與模型組相比，EF高劑量(200 mg/kg)治療組大鼠視束部位FA值顯著升高(P<0.01)，RD值顯著降低(P<0.05)。EF低、高劑量(100、200 mg/kg)治療組ADC、AD值明顯降低(P<0.05，圖3)。EF給藥6周能夠減輕腦缺血致視束部位白質(zhì)纖維束損傷。

圖3 EF給藥對(duì)2VO模型大鼠視束部位DTI參數(shù)的影響Fig.3 Effects of EF on white matter fiber bundles in corpus callosum of 2VO rats detected by MRI-DTIA: color-coded FA images in the corpus callosum section at bregma -3.14 mm, B: quantitative analysis of FA； C: quanlitative ADC; D: analysis of AD; E: analysis of RD in the corpus callosum. n=6. #P<0.05 vs sham group；*P<0.05, **P<0.01 vs model group. EF：epimedium flavonoids; 2VO: permanent bilateral common carotid artery ligation; MRI: magnetic resonance imaging; DTI: diffusion tensor imaging; FA: fractional anisotropy; ADC: apparent diffusion coefficient; AD: axial diffusion coefficient; RD: radial diffusivity; EF(L): epimedium flavonoids 100 mg/kg; EF(H): epimedium flavonoids 200 mg/kg; Nim: nimodipine.

2.4 EF對(duì)2VO模型大鼠胼胝體部位髓鞘變化的影響(LFB染色)

各組大鼠間胼胝體部位著色程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠胼胝體部位著色程度顯著減低，髓鞘結(jié)構(gòu)紊亂明顯。與模型組相比，EF高劑量 (200 mg/kg) 給藥組能夠明顯增加2VO大鼠胼胝體部位的著色程度，髓鞘紊亂減輕 (圖4A)。通過(guò)對(duì)髓鞘紊亂分級(jí)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠髓鞘紊亂分級(jí)值明顯增高 (P<0.01),給予EF高劑量能夠顯著降低模型大鼠的髓鞘紊亂分級(jí)值 (P<0.05，圖4B)。

圖4 EF給藥對(duì)2VO模型大鼠胼胝體部位髓鞘變化的影響(LFB染色)Fig.4 Effects of EF on demyelination in the corpus callosum of 2VO rats (LFB staining)A: representative images of brain sections stained with LFB (scale bar=50 μm); B: quantitative analysis of grading score for LFB-stained sections. ##P<0.01 vs sham group, *P<0.05 vs model group. EF：epimedium flavonoids;2VO: permanent bilateral common carotid artery ligation; LFB: luxol fast blue; EF(L): epimedium flavonoids 100 mg/kg; EF(H): epimedium flavonoids 200 mg/kg; Nim: nimodipine.

3 討論

本研究主要采用2VO模型模擬CSVD的慢性腦缺血低灌注病理狀態(tài)，給藥6周后采用新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的變化。新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)是利用嚙齒類動(dòng)物喜歡探索新物體的習(xí)性來(lái)判斷動(dòng)物是否能夠辨別新舊物體的行為學(xué)方法，被廣泛應(yīng)用于與認(rèn)知障礙有關(guān)疾病動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)中，包括CSVD、神經(jīng)退行性疾病、腦損傷模型等多個(gè)方面[10-11]。對(duì)新物體的偏愛(ài)用“分辨指數(shù)”指標(biāo)進(jìn)行量化，分辨指數(shù)高，則空間識(shí)別記憶能力好。本研究中，與sham組相比，2VO模型大鼠的分辨指數(shù)顯著下降，各給藥組均能升高模型組大鼠的分辨指數(shù)，表明EF可改善2VO模型大鼠的空間工作記憶及物體識(shí)別認(rèn)知能力。2VO術(shù)后24 h開(kāi)始連續(xù)6周給予EF治療，可明顯改善慢性腦灌流不足引起的學(xué)習(xí)記憶障礙，提示EF有可能改善CSVD患者的臨床癥狀。

腦白質(zhì)損傷是可在腦內(nèi)觀察到的CSVD最常見(jiàn)、最早的組織損害，被認(rèn)為在CSVD損傷中起關(guān)鍵作用[5]。腦白質(zhì)纖維在連接各腦區(qū)功能中起著非常重要的作用，各腦區(qū)之間功能連接異常可導(dǎo)致學(xué)習(xí)工作記憶障礙的發(fā)生[12]。DTI是MRI的一種特殊形式，能夠?qū)铙w腦內(nèi)的白質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)進(jìn)行非侵入性檢測(cè)。常用的DTI參數(shù)包括： FA、ADC、AD、RD，這些指標(biāo)被用來(lái)評(píng)估缺血后腦白質(zhì)和灰質(zhì)的神經(jīng)元壞死、軸突斷開(kāi)和髓鞘降解情況[13-14]。其中，F(xiàn)A代表白質(zhì)纖維完整性，并用于確定軸突的密度、分布和方向一致性，是檢測(cè)腦損傷后白質(zhì)纖維完整性最敏感的DTI參數(shù)之一[15]，其變化反映了腦白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)完整性的改變。目前在許多動(dòng)物模型中都發(fā)現(xiàn)FA減少，例如新生大鼠缺氧、缺血[16]，以及雙環(huán)己酮草酰二腙小鼠模型[17]等。ADC與神經(jīng)元丟失和白質(zhì)髓鞘脫失有關(guān)[18]。AD代表軸突損傷，其與軸突腫脹和神經(jīng)絲功能障礙有關(guān)[19]。RD代表脫髓鞘情況，多項(xiàng)研究[20-21]表明RD增加是髓鞘損傷的特異性標(biāo)志。AD和RD分別表征特定于軸突和髓鞘的白質(zhì)變化，增加的AD反映軸突的結(jié)構(gòu)破壞，而增強(qiáng)的RD與缺血后廣泛的髓鞘降解有關(guān)[22]。

本研究應(yīng)用MRI-DTI檢測(cè)各組大鼠腦白質(zhì)胼胝體及視束部位FA、ADC、AD和RD值的變化，以評(píng)估EF對(duì)2VO模型大鼠腦白質(zhì)纖維束的影響。結(jié)果提示EF可提高2VO大鼠術(shù)后6周的FA值，降低ADC值、AD值和RD值，提示EF可減輕腦白質(zhì)的微結(jié)構(gòu)損傷, 有較強(qiáng)的保護(hù)神經(jīng)纖維完整性作用。同時(shí)采用堅(jiān)牢藍(lán)(luxol fast blue, LFB)染色對(duì)各組大鼠進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估，以驗(yàn)證DTI檢測(cè)結(jié)果。LFB屬于銅-酞菁染料，在乙醇溶液中具有與髓鞘磷脂結(jié)合的染色特性。應(yīng)用LFB髓鞘染色可以很好地顯示出神經(jīng)組織的髓鞘結(jié)構(gòu)。同樣，本研究在LFB染色中也觀察到2VO模型組大鼠胼胝體部位神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)紊亂，髓鞘排列疏松，有部分松解，且有明顯空泡形成。EF給藥可明顯減輕髓鞘結(jié)構(gòu)紊亂，減輕白質(zhì)損傷。

綜上所述，EF能夠改善2VO模型大鼠胼胝體和視束部位髓鞘和軸突微觀結(jié)構(gòu)的損傷，減輕髓鞘的脫失及紊亂，改善慢性腦缺血低灌注引起的腦白質(zhì)脫髓鞘病變，進(jìn)而改善CSVD認(rèn)知功能障礙。