隗 歆 劉 丹 武 燁,2 呂坤譯 申 言 劉慧榮,2*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，北京 100069； 2. 代謝紊亂相關(guān)心血管疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069； 3. 首都醫(yī)科大學(xué)燕京醫(yī)學(xué)院，北京 101300)

數(shù)據(jù)[1]顯示，中國老年人口已超過1.5億，老年人口即60歲以上人口比例超過10%即進(jìn)入老齡化社會(huì)，因此研究衰老的機(jī)制尤為重要。衰老是多種疾病的嚴(yán)重危險(xiǎn)因素，如心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥、慢性阻塞性肺疾病、代謝性疾病等[2]。衰老也可被獨(dú)立定義為一種疾病[3]，表現(xiàn)為衰老細(xì)胞永久性生長停滯、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)表達(dá)譜的改變[4]，但細(xì)胞衰老的生物學(xué)機(jī)制尚不十分清楚。

目前已知誘發(fā)衰老的機(jī)制包括線粒體損傷[5]、DNA損傷[6]、端粒功能障礙[7]等。越來越多的證據(jù)[8]表明，線粒體功能障礙是衰老的潛在調(diào)節(jié)機(jī)制。已知線粒體參與能量合成代謝、活性氧的產(chǎn)生、鈣鐵的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞凋亡等多種細(xì)胞代謝[9-11]，對于細(xì)胞存活至關(guān)重要。損傷線粒體在細(xì)胞內(nèi)積聚，線粒體功能障礙使活性氧生成增加，從而加重氧化應(yīng)激損傷是細(xì)胞衰老的重要機(jī)制之一[12]。損傷線粒體主要通過線粒體內(nèi)蛋白酶修復(fù)線粒體蛋白的功能及線粒體自噬降解損傷線粒體，共同維持線粒體質(zhì)量調(diào)控。線粒體質(zhì)量控制是保證線粒體功能的基礎(chǔ)，研究[13]顯示，一種線粒體質(zhì)量調(diào)控蛋白絲氨酸蛋白酶Omi/HtrA2定位于線粒體膜間隙，作為伴侶蛋白降解錯(cuò)誤折疊的線粒體，修復(fù)線粒體功能。在神經(jīng)組織中，Omi/HtrA2通過保障線粒體質(zhì)量發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，Omi/HtrA2的缺乏致線粒體功能障礙是神經(jīng)退行性疾病的重要發(fā)病機(jī)制[14]。相反，在心肌組織中Omi/HtrA2表達(dá)的增加介導(dǎo)老年心肌損傷，加劇心肌細(xì)胞凋亡及缺血再灌注損傷的易感性[15]，提示Omi/HtrA2對細(xì)胞的存活具有雙重作用[16-17]。

文獻(xiàn)[18]報(bào)道，Omi/HtrA2的活性喪失會(huì)引起線粒體功能障礙，促進(jìn)小鼠早衰。同時(shí)，Omi/HtrA2表達(dá)過度增加也會(huì)引起線粒體功能障礙[19]，但Omi/HtrA2對衰老是否也具有雙重作用，表達(dá)增加的Omi/HtrA2是否影響細(xì)胞衰老仍不十分清楚。

本文探討了在心肌中表達(dá)增加的Omi/HtrA2是否也參與細(xì)胞衰老的發(fā)生，為Omi/HtrA2對細(xì)胞衰老的影響提供病理生理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

心肌特異性過表達(dá)Omi/HtrA2轉(zhuǎn)基因小鼠(4月齡，雄性)由賽業(yè)廣州生物科技有限公司提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(粵)2008-0090]。 轉(zhuǎn)基因小鼠分為野生型WT組與心肌特異性過表達(dá)Omi/HtrA2的Omi組，每組6只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用遵循中華人民共和國衛(wèi)生部令(現(xiàn)國家衛(wèi)生健康委員會(huì))(第55號(hào))—醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則以及首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理細(xì)則。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物通過首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理編號(hào)： AEEI-2018-028)。

1.2 主要試劑與材料

H9c2細(xì)胞系(北京協(xié)和細(xì)胞庫)、Omi/HtrA2穩(wěn)轉(zhuǎn)H9c2細(xì)胞系(賽業(yè)生物科技有限公司)、胎牛血清(Peak Serum公司，美國)、青鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司)、DMEM高糖培養(yǎng)基(Nalgene公司，美國)、胰蛋白酶(Sigma公司，美國)、PBS(Hyclone公司，美國)、BCA蛋白分析試劑盒及細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)。UCF101(Merck公司，美國)，p53抗體(ab26)、p21抗體(ab109199，ab188224)、p16抗體(ab51243，Abcam公司，英國)，GAPDH抗體(E12-052)、β-tublin抗體(E12-043，南京恩晶生物科技有限公司)，山羊抗兔IgG/生物素標(biāo)記(ZB2301)、山羊抗小鼠IgG/生物素標(biāo)記(ZB2305，北京中杉金橋公司) 。

1.3 主要儀器

多功能化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(BG-gdsAUTO710Pro，北京百晶生物技術(shù)有限公司)，光學(xué)顯微鏡(Olympus公司，日本)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物刺激

含10%(體積分?jǐn)?shù))FBS DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)至60%細(xì)胞密度，加入Omi/HtrA2特異性抑制劑UCF101刺激Omi/HtrA2穩(wěn)轉(zhuǎn)H9c2細(xì)胞48 h，檢測后續(xù)指標(biāo)。

1.5 Western blotting法檢測衰老標(biāo)志物表達(dá)水平

Western blotting心肌組織樣品制備：取凍存心肌組織10 mg，加入100 μL RIPA裂解液，1 μL PMSF蛋白酶抑制劑，1 μL蛋白磷酸酶抑制劑。勻漿破碎心肌組織后，超聲波細(xì)胞破碎儀破碎勻漿液20次，12 000 r/min 10 min離心吸取上清棄沉淀。BCA法測蛋白濃度，1∶20比例稀釋心肌組織上清液(1 μL上清+19 μL蒸餾水)，50倍體積BCA試劑A∶1倍體積BCA試劑B制備BCA工作液，每孔加入100 μL BCA工作液，37 ℃水浴30 min，酶標(biāo)儀讀取562 nm吸光度，按照BCA標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各上清濃度，加入蒸餾水稀釋各樣品至最低濃度，加入1/4體積5×lodding buffer上樣緩沖液，99 ℃金屬浴10 min，-20 ℃保存樣品。

Western blotting細(xì)胞樣品制備：待細(xì)胞長到80%～90%密度，PBS洗3次，六孔板每小皿細(xì)胞加入80 μL RIPA裂解液，0.8 μL PMSF蛋白酶抑制劑，0.8 μL蛋白磷酸酶抑制劑。刮取細(xì)胞于Ep管內(nèi)，超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞懸濁液20次，12 000 r/min 10 min離心吸取上清棄沉淀。BCA法測蛋白濃度，加入1/4體積5×lodding buffer上樣緩沖液，99 ℃金屬浴10 min，-20 ℃保存樣品。

制備12%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分離膠，上樣量為30 μg蛋白，采用80 V恒壓電泳至樣品自濃縮膠進(jìn)入分離膠，改為120 V待樣品跑至最底層。400 mA 恒流濕轉(zhuǎn)1 h，蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))封閉牛奶室溫孵育1 h，TBST洗3次，10 min/次，在對應(yīng)條帶位置分別加入p53、p21、p16、GAPDH和β-tublin，4 ℃孵育過夜。TBST洗3次，二抗室溫孵育1 h，TBST洗3次，按1∶1比例配制發(fā)光液，置于多功能化學(xué)成像發(fā)光儀檢測條帶并用Image J分析條帶灰度值。

1.6 β-半乳糖苷酶染色檢測細(xì)胞衰老

PBS洗細(xì)胞3次，加入β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫孵育15 min，根據(jù)說明書配制β-半乳糖苷酶染色工作液，37 ℃水浴孵育過夜，光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Omi/HtrA2過表達(dá)心肌組織衰老標(biāo)志物表達(dá)增加

與野生型相比，Omi組(心肌特異性過表達(dá)Omi/HtrA2小鼠)心肌內(nèi)Omi/HtrA2表達(dá)顯著增加(1.007±0.379vs0.456±0.216,P<0.01)(圖1A)。

圖1 Omi/HtrA2過表達(dá)心肌組織衰老標(biāo)志物表達(dá)增加Fig.1 The senescence markers increased in the myocardium of overexpressed cardiac-specific Omi/HtrA2 transgenic miceA： Western blotting shows that the expression of Omi/HtrA2 increased in Omi group compared with WT group; B-D： Western blotting results show the expression of senescence markers p53, p21 and p16 increased in Omi group compared with WT group. **P<0.01 vs WT group; n=6 per group. WT: wild type group; Omi: overexpressed cardiac-specific Omi/HtrA2 transgenic mice group.

與野生型相比，Omi組心肌p53表達(dá)顯著增加(2.227±0.343vs1.691±0.308,P<0.01)，p21表達(dá)增加(0.413±0.136vs0.237±0.190,P<0.01)，p16表達(dá)增加(0.336±0.079vs0.220±0.128,P<0.01)(圖1B、C、D)。

2.2 衰老標(biāo)志物p53、p21、p16與心肌表達(dá)增加的Omi/HtrA2呈正相關(guān)

衰老標(biāo)志物p53的表達(dá)與心肌組織內(nèi)Omi/HtrA2的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.530 8，P<0.05)，p21的表達(dá)與Omi/HtrA2表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.590 5，P<0.05)，p16的表達(dá)與Omi/HtrA2表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.643 1，P<0.05)(圖2)。

圖2 Omi/HtrA2與衰老標(biāo)志物表達(dá)呈正相關(guān)Fig.2 Positive correlation between senescence markers and Omi/HtrA2A-C： The positive correlation between senescence markers p53，p21，p16 and Omi/HtrA2. n=13-14 per group; Omi: overexpressed cardiac-specific Omi/HtrA2 transgenic mice group.

2.3 Omi/HtrA2特異性抑制劑UCF101改善Omi/HtrA2引起的細(xì)胞衰老

與對照組H9c2細(xì)胞系相比，穩(wěn)轉(zhuǎn)Omi/HtrA2細(xì)胞p53表達(dá)增加(0.936±0.108vs0.586±0.036,P<0.05)，p21表達(dá)增加(0.292±0.008vs0.155±0.019,P<0.01)，p16表達(dá)顯著增加(0.436±0.069vs0.138±0.083,P<0.01)。

Omi/HtrA2特異性抑制劑UCF101處理Omi/HtrA2穩(wěn)轉(zhuǎn)H9c2細(xì)胞48 h后，結(jié)果顯示：與Omi組細(xì)胞相比，Omi+UCF101組衰老標(biāo)志物p53表達(dá)降低(0.682±0.031vs0.936±0.108,P<0.01)，p21表達(dá)降低(0.215±0.022vs0.292±0.008,P<0.05)，p16表達(dá)降低(0.220±0.055vs0.436±0.069,P<0.05)(圖3)。

圖3 Omi/HtrA2特異性抑制劑UCF101改善Omi/HtrA2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞衰老Fig.3 The cellular senescence was ameliorated in Omi/HtrA2 overexpressed H9c2 cells treated by Omi/HtrA2 inhibitor UCF101A-C: Western blotting shows the expression of senescence markers p53, p21 and p16 decreased in Omi/HtrA2+UCF101 group compared with Omi group. D: The β-Galactosidase staining results show the senescent cells decreased in Omi+UCF101group compared with that in Omi group. Scale bar: 100 μm. *P<0.05, **P<0.01 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs Omi group; Control group: H9c2 cells; Omi group: Omi/HtrA2 overexpressed H9c2 cells; Omi+UCF101 group: Omi/HtrA2 overexpressed H9c2 cells treated by UCF101. n=4 per group.

3 討論

我國已進(jìn)入老齡化社會(huì)，而且老齡化程度正在逐年加劇。在我國老年群體中存在多種年齡相關(guān)疾病，如心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、代謝性疾病等，其發(fā)病率隨年齡增長顯著增加[2]。細(xì)胞衰老是機(jī)體整體衰老的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，因此研究細(xì)胞衰老的機(jī)制十分重要。

文獻(xiàn)[20]報(bào)道，對衰老細(xì)胞的清除可從器官及整體水平逆轉(zhuǎn)衰老。但心肌組織屬于永久性細(xì)胞，不可再生，因此無法通過清除衰老細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)心肌衰老。已知心血管疾病的致死率在我國居首位[21]，且衰老是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[22]，因此，研究心肌衰老的機(jī)制十分重要。

目前已知多種因素參與衰老的誘發(fā)，越來越多的證據(jù)[8]表明，在多種細(xì)胞衰老的機(jī)制中，線粒體功能障礙是衰老的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。線粒體作為真核細(xì)胞的“能力工廠”，通過氧化磷酸化分解葡萄糖和脂肪酸產(chǎn)生能量(ATP)。同時(shí)，線粒體還參與降解細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白[23]、鈣鐵的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)及凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，對細(xì)胞代謝及存活至關(guān)重要[9]。線粒體質(zhì)量調(diào)控包括線粒體生物發(fā)生[24]，線粒體內(nèi)蛋白酶修復(fù)損傷線粒體[25]及線粒體自噬降解損傷線粒體[26]等。線粒體質(zhì)量調(diào)控異常導(dǎo)致?lián)p傷線粒體的過度積累，加重氧化應(yīng)激損傷從而誘發(fā)細(xì)胞衰老的發(fā)生[27]。因此，線粒體質(zhì)量異常是細(xì)胞衰老的重要誘因[28-29]。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究[30]了一種線粒體質(zhì)量調(diào)控蛋白Omi/HtrA2，Omi/HtrA2由核基因編碼，定位于線粒體膜間隙發(fā)揮伴侶蛋白的作用，調(diào)控線粒體質(zhì)量。在線粒體破裂或線粒體外膜通透性增加時(shí)，釋放入胞質(zhì)，與抗凋亡蛋白XIAP結(jié)合，激活Caspase3，促進(jìn)凋亡的發(fā)生[31]。文獻(xiàn)[32]報(bào)道，Omi/HtrA2的缺乏嚴(yán)重影響線粒體質(zhì)量，且Omi/HtrA2活性喪失誘發(fā)小鼠早衰。同時(shí)，Omi/HtrA2的表達(dá)增加也可影響線粒體功能，參與線粒體損傷[19]。這提示Omi/HtrA2對線粒體質(zhì)量的調(diào)控具有雙重作用，但Omi/HtrA2對細(xì)胞衰老是否也具有雙重作用？Omi/HtrA2表達(dá)增加是否影響細(xì)胞衰老，Omi/HtrA2表達(dá)增加是否可作為衰老的標(biāo)志仍不十分清楚。

本文探討Omi/HtrA2表達(dá)增加是否促進(jìn)細(xì)胞衰老。通過Western blotting法檢測衰老標(biāo)志物表達(dá)水平及β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞率反映衰老指標(biāo)的改變。已知細(xì)胞周期不可逆停滯是細(xì)胞衰老的重要標(biāo)志。衰老標(biāo)志物有p53、p21和p16。p53/p21信號(hào)通路通過調(diào)控細(xì)胞周期激活細(xì)胞衰老的發(fā)生[33]。已知p53在多種損傷刺激下活化，激活下游衰老標(biāo)志物p21和有絲分裂關(guān)鍵蛋白E2F7，共同參與G1細(xì)胞周期的阻滯。p16隨年齡呈指數(shù)型增加，是最強(qiáng)的衰老標(biāo)志物之一。獨(dú)立于p53/p21通路，通過阻止DNA復(fù)制的啟動(dòng)，參與細(xì)胞周期G1/S檢查點(diǎn)的阻斷。β-半乳糖苷酶是細(xì)胞衰老的重要標(biāo)志物，在細(xì)胞周期被抑制后，β-半乳糖苷酶活性增加，是目前檢測細(xì)胞衰老的金標(biāo)準(zhǔn)[34]。

在本研究中，為驗(yàn)證心肌中過表達(dá)Omi/HtrA2是否促進(jìn)細(xì)胞衰老，筆者構(gòu)建心肌特異性過表達(dá)Omi/HtrA2小鼠，Omi/HtrA2表達(dá)顯著增加。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，心肌組織中特異性過表達(dá)Omi/HtrA2，衰老標(biāo)志物表達(dá)顯著增加，且表達(dá)增加的Omi/HtrA2與衰老標(biāo)志物p53、p21、p16呈正相關(guān)。本課題組在細(xì)胞水平構(gòu)建Omi/HtrA2穩(wěn)轉(zhuǎn)H9c2細(xì)胞系，過表達(dá)Omi/HtrA2后，衰老標(biāo)志物及β-gal染色陽性率增加，通過UCF101抑制Omi/HtrA2功能，可改善衰老指標(biāo)。本文證實(shí)Omi/HtrA2表達(dá)增加促進(jìn)心肌衰老。已知，Omi/HtrA2活性喪失也可加速小鼠早衰，這提示Omi/HtrA2對衰老的影響具有雙重作用，即Omi/HtrA2活性喪失引起早衰，但Omi/HtrA2過度表達(dá)也會(huì)引起細(xì)胞衰老。因此Omi表達(dá)失衡均會(huì)引起細(xì)胞衰老，保持Omi/HtrA2的水平平衡是保障Omi/HtrA2發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用的關(guān)鍵機(jī)制。

那么Omi/HtrA2表達(dá)增加可能通過何種機(jī)制介導(dǎo)衰老的發(fā)生？文獻(xiàn)[18]報(bào)道，Omi/HtrA2缺乏引起線粒體功能障礙，加劇細(xì)胞衰老。那么Omi/HtrA2作為伴侶蛋白降解錯(cuò)誤折疊的線粒體蛋白。Omi/HtrA2表達(dá)過度增加可能在線粒體內(nèi)對線粒體膜間隙蛋白降解過度，影響線粒體功能；此外，已知線粒體動(dòng)力學(xué)即線粒體分裂融合的平衡是把控線粒體質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一[35]。Omi/HtrA2還可與線粒體內(nèi)膜蛋白OPA1相互作用[36]，調(diào)控線粒體融合，這提示Omi/HtrA2表達(dá)過度增加可能通過影響線粒體動(dòng)力學(xué)，引起線粒體分裂融合失衡，進(jìn)而影響線粒體質(zhì)量，參與衰老的發(fā)生。

本課題組前期研究[37]顯示，心肌中Omi/HtrA2的表達(dá)隨年齡增加，且老年時(shí)增加的p53通過激活Omi/HtrA2的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)其在心肌中的表達(dá)。本文證實(shí)Omi/HtrA2過度表達(dá)還可進(jìn)一步加重心肌衰老，形成心肌衰老損傷的惡性循環(huán)，提示維持Omi/HtrA2水平的穩(wěn)態(tài)對維持心肌功能，減緩衰老進(jìn)程具有重要作用。

本文證實(shí)Omi/HtrA2過度表達(dá)促進(jìn)心肌衰老，為Omi/HtrA2表達(dá)增加對細(xì)胞衰老的影響提供了病理生理學(xué)依據(jù)。