唐桂均，李鶴賓，朱艷冰,3，姜澤東,3，倪輝,3，李清彪,3，陳艷紅,3*

（1.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建廈門 361021）（2.廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，福建廈門 361023）（3.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建廈門 361021）

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，EC 3.2.1.23）又稱乳糖酶（Lactase），是一種重要的生物催化劑[1]，歸屬于不同糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases，GH）家族：GH1、GH2、GH35、GH42和GH59[2]。β-半乳糖苷酶不僅可以通過(guò)水解乳糖中的β-1,4-D-半乳吡喃糖苷鍵以達(dá)到降解乳糖的作用，還可以通過(guò)轉(zhuǎn)糖苷生成具有益生作用的低聚半乳糖（GOS）[3,4]。

乳糖是乳品中重要的碳水化合物，它是以單體分子形式存在于乳品中的雙糖。人體無(wú)法直接吸收雙糖分子，雙糖攝入后，需分解成單糖才可被吸收利用。β-半乳糖苷酶可降解乳制品中的乳糖為半乳糖和葡萄糖，有利于人體的吸收，同時(shí)避免乳制品（如冰淇淋和某些類型的奶酪）在冷藏條件下形成乳糖結(jié)晶[5,6]，保證乳制品質(zhì)量。在工業(yè)生產(chǎn)中常利用β-半乳糖苷酶水解乳糖，具有反應(yīng)產(chǎn)物單一、不污染奶源，以及不破壞其他成分等優(yōu)點(diǎn)，因此該酶在食品行業(yè)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。此外，β-半乳糖苷酶還可以與葡萄糖氧化酶聯(lián)合使用制備生物傳感器，用于測(cè)定牛奶等乳制品中乳糖的含量[7]，也可以用于乳清中乳糖的水解，從而減緩乳清排放后對(duì)水造成的污染[8]。

β-半乳糖苷酶在植物、微生物及動(dòng)物體中較為常見(jiàn)，大部分β-半乳糖苷酶來(lái)源于微生物[8,9]。來(lái)源于微生物的β-半乳糖苷酶具有高產(chǎn)、低成本、酶源廣等優(yōu)點(diǎn)。在工業(yè)應(yīng)用中，β-半乳糖苷酶存在著穩(wěn)定性差、酶活力不高等問(wèn)題。因此，研究不同微生物來(lái)源的β-半乳糖苷酶，篩選具有優(yōu)良特性的酶具有重要意義[10]。不同來(lái)源的β-半乳糖苷酶具有不同的酶學(xué)特性，包括最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH、溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性等，這也決定了酶的不同用途。例如，黑曲霉來(lái)源的β-半乳糖苷酶在酸性條件下具有好的穩(wěn)定性和酶活力，可用于治療乳糖不耐癥[11]；絲狀真菌來(lái)源的β-半乳糖苷酶在堿性條件下酶活力良好，常用于面包發(fā)酵[12]。

在先前的研究中，從腐爛海帶中分離出海洋微泡菌ALW1[13]，并進(jìn)行了該菌株的基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)一個(gè)預(yù)測(cè)編碼β-半乳糖苷酶的基因（GenBank收錄號(hào)：Mw366919）。本研究對(duì)來(lái)自微泡菌的β-半乳糖苷酶進(jìn)行克隆、表達(dá)和純化，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，為微泡菌ALW1的β-半乳糖苷酶的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（pNP-Gal）、4-硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷（pNP-Glu）、4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）、4-硝基苯基-α-L-吡喃巖藻糖苷（pNP-α-L-F）、4-硝基苯基-β-D-吡喃巖藻糖苷（pNP-β-D-F）、4-硝基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷（pNPM）和4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷（pNP-xyl），Sigma-Aldrich公司；Ni-NTA agarose，GE Healthcare Life Sciences公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Epoch2T酶標(biāo)儀，美國(guó)博騰儀器有限公司；Avanti?J-25冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司；Unic3-18K冷凍離心機(jī)，Sigma-Aldrich公司；超聲破碎儀，上海虔鈞科學(xué)儀器有限公司；JS-680C凝膠成像系統(tǒng)，上海昕瑞有限公司。

1.3 β-半乳糖苷酶的序列分析

利用DNAMAN軟件對(duì)β-半乳糖苷酶的基因序列進(jìn)行分析，使用ExPASy中的ProtParam分析β-半乳糖苷酶的理論分子量和pI，使用SignalP 5.0分析β-半乳糖苷酶的信號(hào)肽。利用BLAST對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性搜索，使用ClustalX2程序生成蛋白質(zhì)序列的比對(duì)。在碳水化合物活性酶（Carbohydrate-Active Enzyme，CAZy）數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索、下載來(lái)自不同家族的典型β-半乳糖苷酶的基因序列，利用ClustalX2和MEGA7.0軟件構(gòu)建β-半乳糖苷酶的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 β-半乳糖苷酶的基因工程表達(dá)菌株構(gòu)建

以微泡菌ALW1的基因組DNA為模板，使用PCR技術(shù)對(duì)β-半乳糖苷酶基因進(jìn)行擴(kuò)增。利用DNA回收試劑盒進(jìn)行純化后，使用EcoRI和SalI分別對(duì)目的基因和表達(dá)載體pET-28a(+)進(jìn)行雙酶切反應(yīng)。目的基因和表達(dá)載體使用DNA回收試劑盒純化后進(jìn)行連接反應(yīng)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coliDH5α中。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞均勻涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)16 h。經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后，對(duì)插入的序列進(jìn)行測(cè)序分析，將測(cè)序成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coliBL21中，獲得含有β-半乳糖苷酶基因重組表達(dá)質(zhì)粒的E. coliBL21（DE3）基因工程菌株。

1.5 β-半乳糖苷酶的表達(dá)和純化

將含微泡菌β-半乳糖苷酶基因的E. coliBL21（DE3）按1%（V/V）的接種量接種到250 mL LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素）中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600為0.8時(shí)，加入25 μL IPTG（0.5 mol/L），在18 ℃、180 r/min條件下誘導(dǎo)表達(dá)20 h。將發(fā)酵液在4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min，收集菌體沉淀，用10 mL緩沖液（50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、15 mmol/L咪唑，pH 8.0）重懸菌體，冰浴條件下對(duì)菌體進(jìn)行超聲破碎，然后在4 ℃、10 000 r/min條件下離心20 min，收集上清液，即為粗酶液。參照GE Healthcare Life Sciences公司的Ni-NTA使用說(shuō)明書純化重組蛋白。利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析目的蛋白的純度及其分子量大小。蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定參照Bradford法[14]，使用凝膠過(guò)濾層析法確定β-半乳糖苷酶的天然分子量[15]。

1.6 β-半乳糖苷酶的活力測(cè)定

以pNP-Gal為底物測(cè)定β-半乳糖苷酶的活力。配制2.5 mmol/LpNP-Gal底物溶液（溶于50 mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液，pH值4.5）。90 μL底物溶液中加入10 μL酶液（0.1 mg/mL），在30 ℃反應(yīng)10 min后，立即加入200 μL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，在405 nm處測(cè)定吸光度值。每組做三個(gè)平行，以滅活的酶液作為空白組。β-半乳糖苷酶的酶活力單位定義為：在上述條件下，每分鐘釋放1 μmolpNP所需的酶量為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.7 重組β-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.7.1 酶的底物特異性

用50 mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液（pH值4.5）配制2.5 mmoL/L的不同人工底物溶液，包括4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷、4-硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷、4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷、4-硝基苯基-α-L-吡喃巖藻糖苷、4-硝基苯基-β-D-吡喃巖藻糖苷、4-硝基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷和4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷，按1.6的方法測(cè)定酶對(duì)不同底物的活力，研究酶的底物特異性。

1.7.2 溫度對(duì)酶活力和穩(wěn)定性的影響

將β-半乳糖苷酶在不同溫度下（15、20、25、30、35、40和45 ℃）反應(yīng)10 min，測(cè)定酶的活力，研究酶的最適反應(yīng)溫度。為探究β-半乳糖苷酶的溫度穩(wěn)定性，將酶置于不同溫度（4、15、20、25、30和35 ℃）下放置2 h，每隔30 min取樣，測(cè)定酶的殘余活力。以未經(jīng)處理的酶活力定為100%。

1.7.3 pH對(duì)酶活力和穩(wěn)定性的影響

用50 mmol/L不同pH值的緩沖液分別配制2.5 mmol/L的pNP-Gal底物溶液，在不同pH條件下測(cè)定酶的活力，研究酶的最適反應(yīng)pH。為探究β-半乳糖苷酶的pH穩(wěn)定性，將酶分別置于不同pH值的緩沖液中，在25 ℃下放置60 min后，測(cè)定酶的殘余活力。以未經(jīng)處理的酶活力定為100%。

1.7.4 酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

用50 mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液（pH值4.5）配制不同濃度（2.5、5、10、15、20、25 mmol/L）的pNP-Gal底物溶液。將β-半乳糖苷酶分別與不同濃度的底物反應(yīng)，測(cè)定酶的活力。利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，計(jì)算重組β-半乳糖苷酶的最大反應(yīng)速率（Vmax）與底物親和常數(shù)（Km）。

1.8 化學(xué)添加劑對(duì)酶穩(wěn)定性的影響

將β-半乳糖苷酶分別與不同金屬離子（K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Al3+和Fe3+）或其他化學(xué)試劑（Triton X-100、吐溫20、吐溫80、SDS、CTAB、β-ME、DTT、EDTA、尿素）混合，使化學(xué)添加劑達(dá)到不同的指定終濃度。酶與化學(xué)試劑25 ℃溫育30 min后，加入pNP-Gal底物，測(cè)定酶的殘余活力。以未添加化學(xué)試劑處理的酶活力定為100%。

1.9 β-半乳糖苷酶的三維建模及酶與pNP-Gal底物的分子對(duì)接

在PDB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)獲取模板，利用Modeller 9.18構(gòu)建β-半乳糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)，pNP-Gal的三維結(jié)構(gòu)在NCBI中的PubChem下載pdb文件。應(yīng)用AutoDock進(jìn)行酶與底物的分子對(duì)接，選擇構(gòu)象最佳的對(duì)接結(jié)果，使用Discovery Studio 2019軟件進(jìn)行分析和圖像顯示。

2 結(jié)果與討論

2.1 β-半乳糖苷酶的序列分析

微泡菌β-半乳糖苷酶基因的長(zhǎng)度為141 9 bp，編碼472個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)的理論分子量和pI分別為52.8 ku和5.29，該β-半乳糖苷酶不含有信號(hào)肽。蛋白序列的同源性分析表明，微泡菌β-半乳糖苷酶與來(lái)源于Actinoalloteichus hymeniacidonis（AOS64332.1）、Amycolatopsis albispora（AXB42219.1）、AActinoplanessp. N902-109（AGL19093.1）和Amycolatopsis albispora（AXB41531.1）的β-半乳糖苷酶分別具有51%、50%、49%和48%的相似性。蛋白質(zhì)序列比對(duì)分析顯示，β-半乳糖苷酶含有GH1家族的β-半乳糖苷酶典型的氨基酸序列NEP（185-187位氨基酸）和ENG（370-372位氨基酸），其中Glu186預(yù)測(cè)為酸堿催化殘基，Glu370預(yù)測(cè)為親核催化殘基；差異序列主要集中于蛋白質(zhì)中間區(qū)域及C末端（圖1）。采用系統(tǒng)進(jìn)化分析來(lái)確定微泡菌β-半乳糖苷酶所屬家族。利用碳水化合物活性酶家族（CAZy）數(shù)據(jù)庫(kù)中5個(gè)糖苷水解酶（GH）家族的16個(gè)特征性β-半乳糖苷酶構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。該酶與來(lái)自Acidilobussp. 7（AMD30575.1）和Acidilobus saccharovorans345-15（ADL19795.1）的β-半乳糖苷酶在同一分支，它們是GH1家族的代表成員。這些結(jié)果表明，本研究中微泡菌β-半乳糖苷酶歸屬于GH1家族。

圖1 微泡菌β-半乳糖苷酶與其他β-半乳糖苷酶蛋白序列的比對(duì)分析Fig.1 Alignment of β-galactosidase from Microbulbifer sp.with other β-galactosidase protein sequences

圖2 β-半乳糖苷酶的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of β-galactosidase

2.2 β-半乳糖苷酶的表達(dá)和純化

pET-28a(+)表達(dá)質(zhì)粒插入外源基因后，可表達(dá)出帶有多聚組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白。含有微泡菌β-半乳糖苷酶基因的E. coliBL21（DE3）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和純化后，SDS-PAGE分析顯示，與經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的含pET-28a(+)陰性菌（圖3，泳道1）相比，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的含重組質(zhì)粒的陽(yáng)性菌在蛋白理論分子量大小的位置附近有明顯的蛋白表達(dá)條帶（圖3，泳道2），說(shuō)明有目的蛋白表達(dá)。β-半乳糖苷酶大量誘導(dǎo)表達(dá)后，利用超聲進(jìn)行菌體破碎，上清過(guò)Ni-NTA Agarose親和層析柱，獲得重組β-半乳糖苷酶，重組酶的分子質(zhì)量約為64 ku（圖3，泳道3）。使用Sephacryl S-200凝膠過(guò)濾層析法測(cè)定純化的重組酶分子量為64.6 ku。這些結(jié)果表明，微泡菌β-半乳糖苷酶是單亞基蛋白質(zhì)。

圖3 β-半乳糖苷酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)Fig.3 Expression of β-galactosidase gene in E. coli

2.3 微泡菌β-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1β-半乳糖苷酶的底物特異性

根據(jù)酶與不同底物反應(yīng)生成pNP的含量不同來(lái)研究β-半乳糖苷酶的底物特異性。如表1所示，相比于4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷，微泡菌β-半乳糖苷酶對(duì)4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷、4-硝基苯基-α-L-吡喃巖藻糖苷的相對(duì)酶活力分別為153.79%和158.16%，對(duì)4-硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷、4-硝基苯基-α-L-吡喃巖藻糖苷、4-硝基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷、4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷無(wú)活力。結(jié)果表明，微泡菌β-半乳糖苷酶對(duì)具有立體化學(xué)偏好的芳基-β-糖苷具有特異性作用。

表1 β-半乳糖苷酶的底物特異性Table 1 Substrate specificity of β-galactosidase

2.3.2 溫度對(duì)β-半乳糖苷酶活力和穩(wěn)定性的影響

圖4 溫度對(duì)β-半乳糖苷酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity and stability of β-galactosidase

溫度對(duì)微泡菌β-半乳糖苷酶活力的影響結(jié)果（圖4a）顯示，β-半乳糖苷酶的最適溫度為30 ℃，在20～40 ℃之間相對(duì)活性保持在60%以上，在45 ℃時(shí)，相對(duì)活性急劇下降至13.75%。溫度對(duì)β-半乳糖苷酶穩(wěn)定性的影響結(jié)果（圖4b）顯示，隨著時(shí)間變化，酶的穩(wěn)定性呈下降趨勢(shì)。溫度≤25 ℃時(shí)，酶活力下降較慢，在4 ℃和25 ℃放置2 h后，酶分別具有78.26%和38.35%的相對(duì)酶活力。溫度為30 ℃和35 ℃時(shí)，酶活力下降顯著，在30 ℃和35 ℃放置30 min后，相對(duì)酶活力迅速分別降至53.05%和7.58%。目前商業(yè)β-半乳糖苷酶大多為中溫酶，而乳品加工中許多工藝以及貯運(yùn)均在低溫下進(jìn)行[16]。朱五二等[17]研究的鹽單胞菌S62來(lái)源低溫β-半乳糖苷酶生成低聚半乳糖的最適反應(yīng)溫度為40 ℃。Turkiewicz等[18]的研究中，Pseudoalteromonassp.22b來(lái)源的低溫β-半乳糖苷酶最適反應(yīng)溫度為40 ℃。與上述報(bào)道的低溫β-半乳糖苷酶相比，本研究中微泡菌β-半乳糖苷酶的最適反應(yīng)溫度相對(duì)較低，且在低溫條件下仍能保留較高的酶活力，因此本研究的β-半乳糖苷酶在乳品加工中具有應(yīng)用潛力。

2.3.3 pH對(duì)β-半乳糖苷酶活力和穩(wěn)定性的影響

圖5 pH對(duì)β-半乳糖苷酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of pH on the activity and stability of β-galactosidase

pH對(duì)微泡菌β-半乳糖苷酶活力的影響如圖5a所示。β-半乳糖苷酶的最適pH為4.5，pH值在4.0～5.5時(shí)，相對(duì)酶活力在55%以上。為探究β-半乳糖苷酶的pH穩(wěn)定性，在不同pH條件下對(duì)酶處理1 h。結(jié)果表明（圖5b），β-半乳糖苷酶在pH值4.0～5.0范圍內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，殘余酶活力在80%以上。在以往的報(bào)道中，Erwiniasp. E602來(lái)源β-半乳糖苷酶[19]的最適反應(yīng)pH值為7.0，在pH 4.0下處理1 h后的殘余酶活力為55%；Paracoccus marcusiiKGP來(lái)源β-半乳糖苷酶[20]的最適反應(yīng)pH為8.0，在pH 4.0下處理30 min后無(wú)酶活力。而本研究中微泡菌β-半乳糖苷酶的最適pH相對(duì)較低，且在酸性條件下具有優(yōu)良的穩(wěn)定性。

2.3.4β-半乳糖苷酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

圖6 β-半乳糖苷酶作用于pNP-Gal的雙倒數(shù)曲線Fig.6 The lineweaver-burk of β-galactosidase acting on pNP-Gal

以pNP-Gal為底物，研究微泡菌β-半乳糖苷酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。當(dāng)β-半乳糖苷酶與不同濃度的pNP-Gal進(jìn)行反應(yīng)后，通過(guò)計(jì)算反應(yīng)初速度繪制出雙倒數(shù)曲線（圖6），計(jì)算出微泡菌β-半乳糖苷酶的Km和Vmax分別為10.98 mmol/L和7.48 U/mg，高于來(lái)自Akkermansia muciniphila[21]的β-半乳糖苷酶的Km和Vmax。

2.3.5 不同來(lái)源β-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)比較

不同來(lái)源β-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)見(jiàn)表2，可以看出，相較于其他來(lái)源的酶，本研究中微泡菌來(lái)源β-半乳糖苷酶的最適反應(yīng)溫度較低，而且酶的溫度穩(wěn)定性不高；該酶在酸性條件下起作用，并在pH值4.0～5.0的條件下具有優(yōu)良的耐酸性，使其更適用于酸性乳清和干酪的水解。動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較分析顯示，微泡菌來(lái)源β-半乳糖苷酶具有較高的Km值，該酶的Vmax值高于Lactobacillus plantarumFMNP01和Akkermansia muciniphila來(lái)源的β-半乳糖苷酶，低于Erwiniasp. E602、Paracoccus marcusiiKGP和Lactobacillus curieaeM2011381來(lái)源的β-半乳糖苷酶。

表2 不同來(lái)源β-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)Table 2 Enzymatic properties of β-galactosidases from different sources

2.4 化學(xué)添加劑對(duì)β-半乳糖苷酶穩(wěn)定性的影響

金屬離子能通過(guò)調(diào)節(jié)催化過(guò)程或酶的結(jié)構(gòu)對(duì)酶活力產(chǎn)生影響[24]。將微泡菌β-半乳糖苷酶利用不同金屬離子處理后，測(cè)定酶的剩余活力。由圖7可得，測(cè)試的金屬離子（包括K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Al3+和Fe3+）對(duì)β-半乳糖苷酶活力存在不同程度的抑制作用。其中，10 mmol/L的K+、Ca2+、Mn2+處理后，β-半乳糖苷酶保留80%的相對(duì)酶活力；Zn2+和Cu2+處理后，β-半乳糖苷酶幾乎喪失其酶活力，這與來(lái)自Alteromonassp. ML117和Akkermansia muciniphila的β-半乳糖苷酶的研究結(jié)果相似[21,25]。

其他化學(xué)添加劑對(duì)微泡菌β-半乳糖苷酶穩(wěn)定性的影響結(jié)果如表3所示。β-半乳糖苷酶對(duì)非離子型去垢劑吐溫80和低濃度的吐溫20具有良好的穩(wěn)定性，當(dāng)吐溫20濃度為1%時(shí)，酶活力提高到157.09%；非離子型去垢劑Triton X-100對(duì)酶活力具有抑制作用。離子型去垢劑SDS和CTAB存在時(shí)，β-半乳糖苷酶幾乎喪失活性。還原試劑DTT對(duì)β-半乳糖苷酶活力具有促進(jìn)作用；低濃度的β-ME還原試劑對(duì)酶活力沒(méi)有影響，但高濃度下呈現(xiàn)中等抑制作用。金屬螯合劑EDTA對(duì)β-半乳糖苷酶表現(xiàn)出中等抑制作用，表明它可能是一種對(duì)二價(jià)陽(yáng)離子有一定要求的金屬酶，而對(duì)于來(lái)自Bacillus subtilis的β-半乳糖苷酶[26]，EDTA則不會(huì)影響其活力。變性劑尿素強(qiáng)烈抑制β-半乳糖苷酶的活力，2.5 mol/L尿素處理后，酶的活力完全喪失。

圖7 金屬離子對(duì)β-半乳糖苷酶穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effects of metal ions on the stability of β-galactosidase

表3 其他化學(xué)添加劑對(duì)β-半乳糖苷酶穩(wěn)定性的影響Table 3 Effects of other chemical reagents on the stability of β-galactosidase

2.5 β-半乳糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)及酶與底物的相互作用

將微泡菌ALW1的β-半乳糖苷酶進(jìn)行三維建模，在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源搜索，模板的PDB登入號(hào)為1UYQ，氨基酸殘基的范圍為24-471，與模板序列相似度為42.9%。微泡菌β-半乳糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)中觀察到糖苷水解酶GH1家族典型的（α/β）8桶結(jié)構(gòu)域，其中催化殘基Glu186和Glu370被標(biāo)記（圖8a）。

為進(jìn)一步從分子水平上認(rèn)知β-半乳糖苷酶與底物相互作用模式，利用分子對(duì)接研究了pNP-Gal在活性位點(diǎn)處的作用模式。pNP-Gal與β-半乳糖苷酶的分子對(duì)接結(jié)果如圖8b所示，酸/堿催化殘基Glu186和親核催化殘基Glu370在糖環(huán)兩側(cè)，Tyr314、Thr315、Glu370和Glu431與pNP-Gal形成氫鍵（圖8b，綠色線條），Tyr314還與底物形成Pi-Pi T型作用力（圖8b，紫色線條）。

圖8 微泡菌β-半乳糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)（a）及酶與底物的分子對(duì)接（b）Fig.8 The tertiary structure of β-galactosidase from Microbulbifer sp. (a) and molecular docking of β-galactosidase and pNP-Gal substrate (b)

3 結(jié)論

本研究將來(lái)自微泡菌ALW1菌株的β-半乳糖苷酶進(jìn)行表達(dá)和純化，研究其酶學(xué)性質(zhì)。微泡菌β-半乳糖苷酶歸屬于GH1家族，在溫度低于25 ℃時(shí)具有良好的溫度穩(wěn)定性，在酸性條件（pH值4.0～5.5）下表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性。β-半乳糖苷酶對(duì)還原試劑DTT、一些非離子型去垢劑（吐溫80和吐溫20）顯示良好的穩(wěn)定性。分子對(duì)接提供了微泡菌β-半乳糖苷酶與pNP-Gal底物相互作用模式的深入了解，對(duì)微泡菌β-半乳糖苷酶的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。