汪婷，李一唯，柳媛媛，禹文文，胡富寧，羅曉靜，魯奕男，張曉霞*，王浩,5*

（1.寧夏醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，寧夏銀川 750004）（2.寧夏醫(yī)科大學中醫(yī)學院，寧夏銀川 750004）（3.寧夏醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院，寧夏銀川 750004）（4.寧夏醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院，寧夏銀川 750004）（5.寧夏常見傳染病防治重點實驗室，寧夏銀川 750004）

多囊卵巢綜合征（Polycystic Ovary Syndrome，PCOS）是育齡期女性常見的內(nèi)分泌紊亂疾病[1]。依據(jù)鹿特丹診斷標準，我國漢族育齡期女性患病率約為5.6%[2,3]，患者主要表現(xiàn)為高雄激素血癥、卵巢多囊性改變和排卵障礙[4]。如果不及時治療，還會增加患糖尿病、心血管疾病等慢性代謝性疾病的風險[5]。然而，PCOS發(fā)病機制復雜，確切發(fā)病機制尚不清楚，二甲雙胍等常用藥物在治療PCOS的同時往往伴隨一定的胃腸道反應和肝、腎損傷[6]。因此，尋找更加安全有效的治療方案至關(guān)重要。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，在飲食中添加益生元Omega-3多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acids，PUFAs）有助于改善PCOS患者內(nèi)分泌紊亂[4,7]，提示Omega-3 PUFAs對PCOS具有潛在益處。亞麻籽油（Flaxseed Oil，F(xiàn)O）是omega-3α-亞麻酸（α-linolenic Acid，ALA）最主要的植物來源，具有降血壓、降血脂、抗炎等多種功效，被譽為“液體黃金”[8,9]。動物和臨床研究證實，ALA來源的FO和魚油干預能夠有效降低PCOS血脂和睪酮水平，改善胰島素代謝紊亂[10,11]。本團隊前期研究[4]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)O攝入8 w后PCOS大鼠血漿和卵巢的促炎因子白細胞介素（Interleukin，IL）-6、IL-1β和腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factorα，TNF-α）顯著降低，抑炎因子IL-10增加，提示富含ALA的FO對PCOS炎癥的調(diào)節(jié)作用。但是，F(xiàn)O調(diào)控炎癥因子釋放的機制尚不清楚，有待進一步研究。

眾所周知，PCOS是一種慢性低度炎癥性疾病，患者常表現(xiàn)為促炎性細胞因子升高和炎癥細胞的改變[12]。髓源性抑制細胞（Myeloid-derived Suppressor Cells，MDSCs）是病理條件下調(diào)節(jié)免疫反應的關(guān)鍵因子，主要分布在骨髓、外周血、脾、肝、肺或各種器官的腫瘤中[13]。研究發(fā)現(xiàn)，MDSCs能夠通過負調(diào)控2型輔助性T細胞（Helper T cell 2，Th2）減輕過敏性哮喘小鼠的呼吸道炎癥[14]，提示MDSCs具有抗炎和免疫抑制作用。調(diào)節(jié)性T細胞（Regulatory T cell，Treg）能夠通過細胞與細胞間接觸釋放IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）發(fā)揮抗炎效應[15]。此外，巨噬細胞（Macrophages，Mψs）也具有免疫調(diào)控作用[16]，其中M1型Mψs能夠分泌大量促炎性細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α[17]，M2型Mψs主要分泌IL-10抑制炎癥反應[17]。因此，本研究猜測FO可能通過調(diào)節(jié)炎癥細胞MDSCs、Treg和Mψs影響PCOS炎癥因子的釋放。

根據(jù)以往研究[18]，采用經(jīng)典的來曲唑造模法建立PCOS大鼠模型，給予FO灌胃干預，探討其對PCOS大鼠免疫細胞MDSCs、Treg和Mψs的作用，以期為臨床防治PCOS提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要儀器設備

奧林巴斯BX51顯微鏡，日本Olympus；CytoFLEX流式細胞儀，美國Beckman。

1.1.2 試劑和材料

來曲唑，江蘇恒瑞；質(zhì)量分數(shù)1%羧甲基纖維素（Carboxymethyl Cellulose，CMC）溶液，上海源葉；FO（ALA含量＞56%），寧夏六盤珍坊；瑞氏-吉姆薩染色試劑盒，珠海貝索生物；大鼠流式抗體CD11b-FITC和His48-FITC，美國Thermo公司；CD4-PE、CD25-BV421（APC）、CD45-PC7和CD86-FITC，美國BD公司；Foxp3-FITC，美國eBioscience公司；CD68-APC，英國Abcam公司；CD163-PE，北京博奧森生物；破膜/固定試劑盒，美國BD公司；大鼠免疫熒光抗體CD68-CY3，武漢賽維爾；一次性負壓真空采血管，山東君諾；大鼠飼料，北京科澳。

1.2 實驗設計及模型建立

6周齡SPF級雌性SD大鼠32只（193±10 g）購買并飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（寧）2015-0001，相關(guān)研究通過了寧夏醫(yī)科大學倫理委員會的批準（批準號：2016-017）。大鼠適應性飼養(yǎng)1 w后隨機分為陰性對照組、模型組、FO對照組和FO干預模型組。采用來曲唑造模法建立PCOS大鼠模型[18]。首先，模型組和FO干預模型組灌胃攝入量為每天1 mg/kg（以小鼠質(zhì)量為基準計）來曲唑（溶于質(zhì)量分數(shù)1% CMC溶液），連續(xù)灌胃給藥21 d；陰性對照組和FO對照組灌胃等量質(zhì)量分數(shù)1% CMC溶液；期間采集大鼠陰道涂片進行瑞氏-吉姆薩染色，根據(jù)鏡下細胞形態(tài)和種類評估造模是否成功。造模成功后，F(xiàn)O對照組和FO干預模型組每天灌胃攝入1 mL/kg（以小鼠質(zhì)量為基準計）的FO[19]；陰性對照組和模型組灌胃等量生理鹽水，持續(xù)灌胃干預8 w。末次灌胃后禁食8 h，稱重并麻醉大鼠，收集大鼠外周血、脾臟、骨髓、卵巢等相關(guān)樣本處理后用于后續(xù)檢測。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 陰道涂片及染色

從造模第1天開始到第21天，每天上午9:00收集各組大鼠陰道涂片，參照瑞氏-吉姆薩染色試劑盒說明書立即進行染色，隨后在光學顯微鏡下觀察各組大鼠陰道脫落細胞形態(tài)和種類的變化。

1.3.2 流式細胞術(shù)檢測大鼠外周血、脾臟和骨髓中MDSCs

新鮮全血置于抗凝管中離心，分離出血漿和血細胞，下層血細胞通過密度梯度離心法分離出外周血單個核細胞[20]。新鮮脾臟組織研磨后300目濾膜過濾，加入紅細胞裂解液裂紅、洗滌，分離出單個核細胞。取適量預冷的RPMI 1640反復沖洗大鼠雙側(cè)脛骨和股骨的骨髓腔，收集全部的沖洗液300目濾膜過濾，加入紅細胞裂解液裂紅、洗滌，分離出單個核細胞。所有細胞懸液濃度均調(diào)整為每毫升1×106個細胞。隨后，吸取上述細胞懸液各100 μL加入流式管中，分別加入1 μL抗大鼠FITC標記的His48以及PE標記的CD11b表面抗體，震蕩混勻；4 ℃避光孵育30 min，孵育結(jié)束后加入1 mL PBS清洗細胞；棄上清，加入300 μL RPMI 1640重懸，立即上機檢測。

1.3.3 流式細胞術(shù)檢測大鼠外周血和脾臟中Treg

外周血和脾臟中單個核細胞的分離方法如上所述，所有細胞懸液濃度均調(diào)整為每毫升1×106個細胞。隨后，吸取上述細胞懸液各100 μL加入流式管中，分別加入1 μL抗大鼠PE標記的CD4以及APC標記的CD25表面抗體，震蕩混勻；4 ℃避光孵育30 min，孵育結(jié)束后加入1 mL PBS清洗細胞；棄上清，加入300 μL破膜固定液孵育30 min；孵育結(jié)束后加入1 mL透化液清洗細胞；棄上清，加入1 μL抗大鼠FITC標記的Foxp3抗體，吹打混勻；后續(xù)方法同前，上機檢測。

1.3.4 流式細胞術(shù)檢測卵巢Mψs、M1型Mψs和M2型Mψs

大鼠卵巢組織在解剖鏡下用注射器針頭刺破卵泡，使顆粒細胞釋放入預冷的RPMI 1640中[21]；加入0.25%胰蛋白酶1 mL置于37 ℃培養(yǎng)箱中消化12 min；終止消化后300目濾膜過濾，加入紅細胞裂解液裂紅、洗滌，分離出單個核細胞，調(diào)整細胞懸液濃度為每毫升1×106個細胞。吸取各組細胞懸液100 μL加入流式管中，分別加入1 μL抗大鼠PC7標記的CD45、APC標記的CD68、FITC標記的CD86以及PE標記的CD163表面抗體，震蕩混勻；后續(xù)方法同前，上機檢測。

1.3.5 免疫熒光檢測卵巢Mψs

參照前人研究[22]，進行卵巢Mψs免疫熒光染色。卵巢石蠟切片在65 ℃恒溫箱中烘烤2 h后脫蠟至水，隨后進行抗原修復，加入牛血清白蛋白常溫封閉30 min；滴加兔抗大鼠CD68抗體（1:200），濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜；滴加CY3標記的山羊抗兔抗體（1:200），避光室溫孵育60 min；滴加含DAPI的封片劑；在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0和GraphPad Prism 6.01軟件處理實驗數(shù)據(jù)。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，多組間差異比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗法。以p＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 卵巢病理組織形態(tài)學

PCOS患者臨床表現(xiàn)多樣化且病因復雜，建立與臨床表現(xiàn)吻合度高且創(chuàng)傷性小的動物模型對疾病的深入研究至關(guān)重要。大量研究證明，來曲唑造模法誘導的PCOS大鼠模型動情周期紊亂，卵巢組織呈多囊性改變，很大程度上具備了臨床PCOS患者的病理生理特點，廣泛用于PCOS動物研究[23]。因此，本研究選用6周齡雌性SD大鼠通過來曲唑灌胃法建立模型。

陰道涂片法對實驗動物無創(chuàng)傷性且具有準確、實用等優(yōu)點，是判定大鼠動情周期最常用的方法之一[24]。因此，每日采集大鼠陰道涂片進行染色以判定各組大鼠的動情周期是否正常以及各周期持續(xù)的時間。如圖1所示，動情周期包括四個階段，動情前期：多為有核上皮細胞、少量無核的角化上皮細胞（圖1a）；動情期：全部為無核的角化上皮細胞（圖1b）；動情后期：可見有核上皮細胞、角化上皮細胞及白細胞（圖1c）；動情間期：大量白細胞及少量黏液（圖1d）。結(jié)果顯示，陰性對照組和FO對照組大鼠陰道涂片可見周期性變化，一個周期約為4～5 d（圖1e～1g），該結(jié)果提示有排卵。模型組和FO干預模型組大鼠在來曲唑干預12 d后逐漸失去規(guī)律的動情周期，干預18 d后處于持續(xù)的動情間期（圖1f～1h）。以往有研究證實，SD大鼠在來曲唑誘導16 d后處于持續(xù)的動情間期[25]，本研究結(jié)果與之類似，說明來曲唑誘導的PCOS大鼠出現(xiàn)了排卵障礙。此外，結(jié)合本課題前期研究，模型組大鼠卵巢組織中黃體消失、卵泡發(fā)育異常、呈多囊樣改變的結(jié)果[26]，表明來曲唑誘導的PCOS大鼠模型建立成功。

圖1 光鏡下大鼠陰道脫落細胞染色圖和動情周期統(tǒng)計圖Fig.1 Staining of vaginal exfoliative cells under light microscope and statistical chart of estrus cycles in rats

2.2 FO干預增加PCOS大鼠外周血、脾臟、骨髓細胞中MDSCs比例

前期研究證實，PCOS進程與慢性低度炎癥密切相關(guān)，富含ALA的FO干預后通過降低促炎因子水平和增加抗炎因子產(chǎn)生改善了PCOS炎癥狀態(tài)[4]。然而，F(xiàn)O調(diào)控炎癥因子釋放的機制尚不清楚。MDSCs主要分布在骨髓、外周血、脾、肝、肺等組織器官中，在調(diào)節(jié)炎癥過程中具有雙向作用，既可以防止過度的炎癥反應，同時又能維持一種慢性低度炎癥狀態(tài)[27]。有研究發(fā)現(xiàn)，在感染和炎癥過程中，未成熟的髓樣細胞（Immature Myeloid Cells，IMC）可以通過不同的激活信號（如炎癥刺激）分化為MDSCs，并誘導MDSCs在炎癥組織富集，從而維持慢性炎癥反應[28]。然而，當MDSCs在外周血、脾以及炎癥組織中持續(xù)增殖后，又能夠抑制其向成熟的髓系細胞分化，從而抑制炎癥反應，觸發(fā)炎癥消退和啟動修復過程，發(fā)揮免疫抑制功能[29]。據(jù)此，本研究對外周血、脾臟、骨髓中的MDSCs進行了分析。

圖2 FO干預對PCOS大鼠外周血、脾臟、骨髓MDSCs比例的影響Fig.2 Effects of FO intervention on the proportion of MDSCs in peripheral blood, spleen and bone marrow of PCOS in rats

圖2結(jié)果顯示，骨髓中MDSCs比例最高，外周血中次之，脾臟中MDSCs相對較少（圖2a～2c）。陰性對照組外周血、脾臟、骨髓中MDSCs細胞比例分別是11.14%、3.02%和19.37%（圖2d～2f）。與陰性對照組相比，模型組外周血、脾臟和骨髓中MDSCs顯著高至20.53%、4.48%和23.88%（p＜0.05，圖2d～2f）。已有研究證實，脫氫表雄酮加高脂誘導的PCOS小鼠外周血、脾臟和肝臟中MDSCs比例增加，且與炎癥因子呈現(xiàn)顯著相關(guān)性，本研究結(jié)果與之一致[12]。結(jié)合前期研究[4]，本研究推測可能是促炎性細胞因子升高促進了MDSCs在大鼠外周血、脾臟、骨髓中募集。有趣的是，與模型組下相比，膳食FO干預后外周血、脾臟、骨髓中MDSCs仍持續(xù)升高至25.87%、5.63%和28.36%（p＜0.05，圖2d～2f），可能是FO干預后MSDCs大量增殖進一步發(fā)揮了免疫抑制作用。一項研究[20]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)O攝入5 w后能夠顯著增加2型糖尿?。═ype 2 Diabetes Mellitus，T2DM）大鼠外周血和脾臟中MDSCs比例，降低促炎因子IL-1β和TNF-α釋放。由此說明，F(xiàn)O干預可能通過促進PCOS大鼠外周血、脾臟、骨髓中MDSCs增殖改善炎癥因子釋放。

2.3 FO干預增加PCOS大鼠外周血和脾臟中Treg比例

Treg細胞是CD4+T細胞的一種特異性譜系，能夠適應局部微環(huán)境的變化進行遷移、增殖、存活和分化，在維持免疫穩(wěn)態(tài)和限制過度免疫反應中發(fā)揮著重要作用[30]。研究發(fā)現(xiàn)，Treg細胞激活能夠產(chǎn)生抗炎因子IL-10和TGF-β來抑制幼稚T細胞增殖[31]，發(fā)揮抗炎效應。因此，研究Treg細胞的變化和作用可能為防治PCOS提供新的分子靶點。

采用CD4、CD25和Foxp3標記Treg細胞[32]。如圖3所示，陰性對照組外周血和脾臟中Treg細胞比例分別是2.85%和1.50%。與陰性對照組相比，模型組外周血和脾臟中Treg細胞顯著降低至1.29%和0.76%（p＜0.01，圖3c～3d），與本課題前期研究PCOS大鼠抗炎細胞因子IL-10降低相一致[4]。臨床研究[33]發(fā)現(xiàn)，PCOS患者外周血Treg細胞較對照組顯著降低，同時伴隨著慢性低度炎癥，這與本研究結(jié)果相一致。與模型組相比，F(xiàn)O干預后外周血和脾臟中Treg細胞升高至2.06%和1.07%（p＜0.05，圖3c～3d），但仍低于陰性對照組。結(jié)合前期研究推測[4]，F(xiàn)O干預后在一定程度上增加了Treg細胞比例，進而刺激抗炎因子IL-10產(chǎn)生，增強抗炎作用，維持免疫穩(wěn)態(tài)。

2.4 FO干預降低PCOS大鼠卵巢中Mψs比例

Mψs是機體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，廣泛分布在各個組織與器官，具有極強的異質(zhì)性和可塑性[16]。在不同微環(huán)境下Mψs可極化為M1型Mψs和M2型Mψs[34]，M1型Mψs通過分泌促炎性細胞因子和趨化因子參與正向免疫應答[34]，在炎癥反應的啟始階段起關(guān)鍵作用，同時引起組織損傷[34]；M2型Mψs分泌IL-10和TGF-β等發(fā)揮負向免疫調(diào)控作用[17]，促進炎癥消除和組織損傷修復。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Mψs在LPS等炎癥刺激物的誘導下激活，迅速合成并釋放大量炎癥介質(zhì)、炎癥細胞因子和黏附分子等，引起M1/M2極化失衡，從而引發(fā)全身組織炎癥和代謝功能障礙[35]。然而，至今仍沒有公認的分子標志來鑒定和區(qū)分不同類型的Mψs[36]。目前，報道最多的譜系標志是CD45+CD68+為Mψs，CD45+CD68+CD86+為M1型Mψs，CD45+CD68+CD163+為M2型Mψs[37]，故本研究采用其作為檢測標志分子。

圖4結(jié)果顯示，陰性對照組卵巢Mψs、M1型Mψs以及M2型Mψs比例分別是8.09%、1.54%和2.27%（圖4d～4f）。與陰性對照組相比，模型組卵巢Mψs和M1型Mψs顯著升高至18.30%和2.85%（p＜0.01，圖4d～4e），M2型Mψs升高至2.73%，但差異無統(tǒng)計學意義（p＞0.05，圖4f）。動物研究發(fā)現(xiàn)，脫氫表雄酮誘導的PCOS小鼠脾臟Mψs和M1型Mψs顯著增加，并伴隨全身炎癥反應和排卵障礙[38]，本研究結(jié)果與之類似，提示卵巢Mψs增加與PCOS全身慢性炎癥密切相關(guān)。與模型組相比，膳食FO干預后，卵巢Mψs和M1型Mψs比例均降低至13.51%和2.27%（p＜0.05，圖4d～4e），但仍高于陰性對照組；M2型Mψs升高至2.64%，但無統(tǒng)計學意義（p＞0.05，圖4f）。動物研究發(fā)現(xiàn)，omega-3 PUFA通過與G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein-coupled Receptors，GPR）120相互作用抑制Mψs遷移和浸潤，進而減輕小鼠的血管炎癥、動脈血栓形成和新生內(nèi)膜增生[39]。上述結(jié)果提示，F(xiàn)O干預能夠抑制PCOS大鼠卵巢Mψs和M1型Mψs增殖，但對M2型Mψs作用不明顯，推測FO干預可能通過抑制Mψs和M1型Mψs增殖改善PCOS大鼠炎癥。

圖4 FO干預對PCOS大鼠卵巢Mψs、M1型Mψs和M2型Mψs比例的影響Fig.4 Effects of FO intervention on the percentage of Mψs, M1 Mψs and M2 Mψs of ovary in PCOS rats

注：a：卵巢中Mψs免疫熒光；b：卵巢中Mψs熒光強度的定量分析；*p＜0.05，***p＜0.001。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，卵巢組織中定居的單核Mψs可誘導PCOS患者卵巢顆粒細胞凋亡[40]。卵巢中Mψs分泌的各種細胞因子還會影響卵泡的生長發(fā)育、排卵以及黃體的形成和功能，提示卵巢Mψs參與PCOS進程[41]。因此，本研究進一步通過免疫熒光對卵巢Mψs進行定量、定位分析。圖5b結(jié)果顯示，陰性對照組Mψs熒光強度為0.62%，模型組Mψs熒光強度較陰性對照組顯著升高至2.55%（p＜0.001，圖5b），說明PCOS大鼠卵巢出現(xiàn)了Mψs浸潤，與前人脫氫表雄酮誘導的PCOS大鼠卵巢組織中Mψs浸潤的報道相一致[42]。與模型組相比，膳食FO干預后Mψs熒光強度降低至1.59%（p＜0.05，圖5b），但仍高于陰性對照組，該結(jié)果與流式結(jié)果趨勢一致，推測FO干預后可能通過改善Mψs在卵巢的浸潤降低PCOS的慢性低度炎癥狀態(tài)。綜上所述，F(xiàn)O干預能夠降低卵巢Mψs水平，以其為靶點可能為治療PCOS提供新的思路。

此外，近年來研究發(fā)現(xiàn)，γδT細胞、固有淋巴樣細胞（Innate Lymphoid Cells，ILCs）和Th17細胞等炎癥細胞也參與了炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展[43,44]。本研究推測，F(xiàn)O對PCOS大鼠MSDCs、Treg和Mψs的調(diào)節(jié)作用只是改善炎癥的機制之一，其他免疫細胞也可能參與了PCOS發(fā)展進程。

3 結(jié)論

本研究在前期研究證實富含ALA的FO能夠改善PCOS大鼠炎癥的基礎(chǔ)上，進一步探討其對炎癥相關(guān)免疫細胞MSDCs、Treg和Mψs的作用。本研究證實了來曲唑誘導的PCOS大鼠存在動情周期紊亂和炎癥細胞改變，F(xiàn)O攝入能夠促進MDSCs在外周血、脾臟和骨髓細胞中富集，增加PCOS大鼠外周血和脾臟中Treg比例以及抑制卵巢中Mψs和M1型Mψs增殖，進而發(fā)揮負調(diào)控作用，改善PCOS炎癥狀態(tài)。本研究為臨床進一步探索PCOS的作用靶點提供了新的方案和思路。