李春君，高遠(yuǎn)，郇宇晨，徐杰，薛長(zhǎng)湖,2，唐慶娟*

（1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003）

（2.海洋國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266237）

蝦青素是一種非維生素A原脂溶性酮式類胡蘿卜素，以其優(yōu)異的抗氧化能力著稱[1]。蝦青素主要以蝦青素酯的形式存在于蝦蟹等海洋生物以及特定的微生物中。雨生紅球藻來(lái)源的蝦青素是人類目前作為膳食補(bǔ)充劑的主要來(lái)源[2]。藻源蝦青素主要以蝦青素酯的形式存在，其中蝦青素單酯的含量高達(dá)71%左右，游離蝦青素的含量?jī)H占約1%[3]。2010年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）將從雨生紅球藻來(lái)源的蝦青素列為“一般安全的”（Generally Recognized as Safe，GRAS）的物質(zhì)。同年，我國(guó)將含有較高含量蝦青素的雨生紅球藻列入“新資源食品”之中[4]。

作為一種脂溶性物質(zhì)，目前的研究認(rèn)為藻源蝦青素在機(jī)體內(nèi)的吸收方式與脂質(zhì)類似。根據(jù)葉黃素酯[5]及其他脂質(zhì)在體內(nèi)的吸收推測(cè)，蝦青素酯首先在相關(guān)酶的作用下水解成游離蝦青素。而游離蝦青素主要在小腸中的空腸段吸收，在小腸中，蝦青素與膽鹽、游離脂肪酸等形成混合膠束。蝦青素被吸收入腸上皮細(xì)胞后，會(huì)與其他脂類物質(zhì)、膽汁等形成乳糜微粒，經(jīng)淋巴和血液輸送到肝臟。在肝臟中，脂肪酶會(huì)消化乳糜微粒，之后被相關(guān)的脂蛋白重新分泌，進(jìn)一步分布到其他組織和器官中[6]。然而，蝦青素的口服生物利用度較低[7]，且在不同個(gè)體間存在著巨大的吸收差異[3]。近年來(lái)，也有相關(guān)的文獻(xiàn)指出，脂質(zhì)的吸收與腸道菌群間存在著密切的聯(lián)系[8]。有研究報(bào)道，藻源蝦青素會(huì)改變腸道菌群的結(jié)構(gòu)[9,10]，腸道菌群的差異可能是蝦青素在不同個(gè)體吸收間存在差異的原因。

益生元是一類人體不消化或者難消化的食物成份，能夠選擇性地刺激結(jié)腸中具有生理活性細(xì)菌的生長(zhǎng)。有益生元功能的物質(zhì)主要是一些非（或）消化性低聚糖，如低聚果糖、菊粉、低聚木糖、低聚殼聚糖（殼寡糖）等[11]。益生元可以促進(jìn)腸道內(nèi)對(duì)人體有益的細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，提高機(jī)體的免疫力，優(yōu)化菌群的平衡。益生元通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群可以影響機(jī)體的糖代謝[12]和脂代謝[13]。此外，益生元的補(bǔ)充還可以促進(jìn)機(jī)體對(duì)于鐵[14]、鈣[15]等礦物質(zhì)的吸收。

因此，本研究擬采用小鼠模型，在膳食中添加三種常見(jiàn)的益生元（低聚果糖、殼寡糖、菊粉）來(lái)探究其對(duì)藻源蝦青素在機(jī)體吸收內(nèi)的影響。本研究為提高藻源蝦青素的生物利用度、相關(guān)益生元蝦青素復(fù)合產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了科技支撐和新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雨生紅球藻來(lái)源的天然蝦青素油（蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%），云南愛(ài)爾發(fā)生物技術(shù)股份有限公司。菊粉、低聚果糖、殼寡糖，上海源葉生物科技有限公司；脂肪酶（Elisa）試劑盒，上海艾萊薩生物科技有限公司；甲醇（色譜純），德國(guó)Merck公司；甲基叔丁基醚（色譜純），賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Millipore Q純水機(jī)，美國(guó)Millipore公司；Neofuge 23R型高速冷凍離心機(jī)，上海力申科學(xué)儀器有限公司；CP224C電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；SPARK 10M酶標(biāo)儀，帝肯（上海）貿(mào)易有限公司；YMC-Carotenoid-C30色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），日本YMC株式會(huì)社；1260 Infinity高效液相色譜儀，配置極管陣列檢測(cè)器（DAD），安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；6890 Series氣相色譜儀，安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；NovaSeq6000測(cè)序平臺(tái)，美國(guó)Illumina公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物飼養(yǎng)與取樣

第一組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：24只雄性C57BL/6J小鼠（SPF級(jí)，四周齡）購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0001]，該實(shí)驗(yàn)規(guī)程已獲得中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院動(dòng)物倫理審查會(huì)批準(zhǔn)（倫理實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)：SPXY2020061603）。適應(yīng)性暫養(yǎng)一周后根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分成4組：正常組（NCA）、菊粉組（InA）、殼寡糖組（ChA）、低聚果糖組（FOA），每組6只。正常組飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料（AIN93G標(biāo)準(zhǔn)飼料），其他各組飼料在標(biāo)準(zhǔn)飼料的基礎(chǔ)上添加2%相應(yīng)的受試物，飼養(yǎng)2周后將小鼠禁食10 h，之后單次灌胃溶解在大豆油中的天然蝦青素油，參考周慶新等[16]的灌胃劑量，為50 mg/kg（以小鼠體質(zhì)量為基準(zhǔn)計(jì)）。喂養(yǎng)條件：溫度22±2 ℃，濕度65%±15%。每?jī)商煊涗浺淮误w質(zhì)量和攝食量，灌胃結(jié)束之后于0～4 h、4～8 h、8～12 h、12～24 h、24～36 h、36～48 h、48～72 h取小鼠糞便。處死小鼠后取小腸，肝臟等組織，-80 ℃冰箱保存。

第二組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：120只雄性C57BL/6J小鼠（SPF級(jí)，四周齡）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006]，該實(shí)驗(yàn)規(guī)程已獲得中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院動(dòng)物倫理審查會(huì)批準(zhǔn)（倫理實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)：SPXY2020082601）。適應(yīng)性暫養(yǎng)一周后根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分成2組：正常組（NCA）、菊粉組（InA），每組60只。正常組飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料（AIN93G標(biāo)準(zhǔn)飼料），菊粉組飼料在標(biāo)準(zhǔn)飼料的基礎(chǔ)上添加2%菊粉，兩組之間僅飼料組成存在差異。飼養(yǎng)兩周，兩組小鼠禁食10 h后，灌胃溶解在大豆油中的天然蝦青素油，灌胃劑量參考Gao等[3]的實(shí)驗(yàn)設(shè)置，均為100 mg/kg（以小鼠體質(zhì)量為基準(zhǔn)計(jì)）。在灌胃0、2、4、8、12、16、20、24、48、72 h后，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取6只小鼠，摘眼球取血并處死。血液于室溫放置30 min后，離心分離血清，于-80 ℃保存。分離小鼠肝臟。實(shí)驗(yàn)全部樣品凍于-80 ℃保存。

1.3.2 不同時(shí)間糞便中蝦青素含量及生物可接受率的測(cè)定

第一組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的小鼠單次灌胃藻源蝦青素后，正常進(jìn)食進(jìn)水，在0～4 h、4～8 h、8～12 h、12～24 h、24～36 h、36～48 h、48～72 h收集小鼠糞便，真空冷凍干燥。研磨并充分混勻，記錄總重。稱取約60 mg于10 mL離心管中，加入1 mL甲醇和2 mL氯仿溶液，渦旋5 min，靜置10 min。加入1 mL水，渦旋5 min，8 000 r/min離心10 min。離心后小心吸取下層有機(jī)相，重復(fù)提取3次，合并提取液，氮?dú)獯蹈伞Ｓ? mL色譜級(jí)甲醇/甲基叔丁基醚（1:1，V/V）復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，置于棕色液相樣品瓶中。參考之前測(cè)定蝦青素的方法于3 d內(nèi)進(jìn)行高效液相色譜（HPLC）分析[17]，測(cè)定糞便中游離蝦青素含量及蝦青素總量。實(shí)驗(yàn)過(guò)程盡量低溫避光操作。

參考Failla等[18]提出的方法，生物可接受率的計(jì)算公式如公式（1）。

式中：

S——生物可接受率，%；

G——灌胃量，g；

P——總排泄量，g。

1.3.3 脂肪酶活力的測(cè)定

取小腸中的空腸段（4 cm左右）準(zhǔn)確稱量其質(zhì)量，按照1∶9（m/V）的比例加入生理鹽水，在低溫條件下機(jī)械勻漿，制成10%的勻漿。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 血清中蝦青素代謝時(shí)間曲線的測(cè)定

參照周慶新等[16]的方法，并進(jìn)行適當(dāng)修改。吸取200 μL血清置于4 mL離心管中，加2 mL甲醇后渦旋30 s混勻。再加入2 mL的氯仿，渦旋30 s，靜置10 min。加1.8 mL水，渦旋混勻至呈現(xiàn)乳白色。8 000 r/min條件下離心10 min，使其分層，吸管吸取下相。重復(fù)萃取三次，合并下層有機(jī)相，氮?dú)獯蹈?。?00 μL以1∶1（V/V）混合的甲醇和甲基叔丁基醚混合液復(fù)溶。濾膜過(guò)濾后進(jìn)入液相小瓶中，盡快進(jìn)行HPLC-DAD分析。

1.3.5 肝臟中蝦青素代謝曲線的測(cè)定

取0.1 g肝臟樣品置于組織勻漿器中，加入1.2 mL甲醇。研磨均勻后，加入2.4 mL氯仿。繼續(xù)研磨均勻，渦旋30 s，旋轉(zhuǎn)混勻儀旋轉(zhuǎn)30 min使其充分混勻。加入0.96 mL超純水，渦旋30 s。離心機(jī)8 000 r/min離心10 min，吸管吸取下層有機(jī)相，置于另一離心管中。原離心管上層加入2.4 mL氯仿再次提取，合并下層有機(jī)相后用氮?dú)獯蹈伞４蹈珊笥?00 μL的甲基叔丁基醚和甲醇混合液（1∶1，V/V）復(fù)溶，濾膜過(guò)濾后進(jìn)入液相小瓶中。盡快進(jìn)行HPLC-DAD分析。

1.3.6 糞便SCFA含量的測(cè)定

稱取小鼠糞便樣品約0.2 g，加入1 200 μL超純水，充分震蕩1 min，混勻。加入濃H2SO4調(diào)節(jié)pH值（2～3），室溫下放置5 min，每分鐘震蕩一次，5 000g離心10 min。收集上清液，取500 μL上清，加入50 μL稀釋100倍（V/V）的內(nèi)標(biāo)二乙基丁酸和500 μL無(wú)水乙醚，充分混勻。5 000g離心10 min，吸取1.0 μL乙醚層用于氣相色譜分析[19]。

1.3.7 16S rRNA測(cè)序分析

利用試劑盒提取糞便中的DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度。以稀釋后的基因組DNA為模板，采用細(xì)菌515F/926R引物擴(kuò)增16S rRNA的V4～V5高變區(qū)序列。PCR產(chǎn)物使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。根據(jù)PCR產(chǎn)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行等量混樣，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。對(duì)目的條帶使用Qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit和Q-PCR定量，文庫(kù)合格后，使用NovaSeq6000進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣本數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列后使用FLASH對(duì)每個(gè)樣本的reads進(jìn)行拼接，得到的拼接序列為原始Tags數(shù)據(jù)（Raw Tags）。拼接得到的Raw Tags，需要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的過(guò)濾處理，得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)（Clean Tags）。Tags序列通過(guò)與物種注釋數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)嵌合體序列，并去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)（Effective Tags）。利用Uparse軟件對(duì)所有樣本的全部 Effective Tags進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性（Identity）將序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units）。最后，對(duì)各樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，以樣本中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理。后續(xù)的Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

文中的數(shù)據(jù)均以Mean±SEM（±s）表示，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。作圖均采用GraphPad Prism 8.0專業(yè)軟件，組間差異采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。以p＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.01為極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種益生元對(duì)于正常小鼠體質(zhì)量、攝食量的影響

研究表明，一些益生元如低聚果糖等對(duì)于調(diào)節(jié)肥胖小鼠血糖、血壓，降低膽固醇有較好的效果[20]。在本實(shí)驗(yàn)中，將3種益生元喂給正常小鼠。結(jié)果顯示，在兩周的時(shí)間內(nèi)，補(bǔ)充菊粉、殼寡糖和低聚果糖不會(huì)顯著影響正常小鼠的體質(zhì)量和攝食量（如圖1所示）。其中，正常組小鼠體質(zhì)量比初始時(shí)上升了23.09%，菊粉組上升了20.28%，殼寡糖組上升了21.46%，而低聚果糖組僅上升了18.31%。與正常組小鼠相比，飼喂了三種益生元的小鼠體質(zhì)量存在下降的趨勢(shì)，其中低聚果糖下降趨勢(shì)較大。

圖1 菊粉、殼寡糖、低聚果糖對(duì)于正常小鼠體質(zhì)量和攝食量的影響Fig.1 Effects of inulin, chito-oligosaccharides and fructose-oligosaccharides on body weight and food intake in normal mice

2.2 三種益生元對(duì)于藻源蝦青素在小鼠體內(nèi)生物可接受率的影響

生物可接受率是指某種物質(zhì)有機(jī)會(huì)可以被生物機(jī)體利用的量占總攝入總量的百分比[21]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常小鼠單次灌胃劑量為50 mg/kg（以小鼠質(zhì)量為基準(zhǔn)計(jì)）的藻源蝦青素之后，其生物接受率約在40%～50%之間。這與Gao等[3]研究發(fā)現(xiàn)藻源蝦青素在機(jī)體內(nèi)的生物可接受率的結(jié)果較為一致。與正常組相比，菊粉、殼寡糖對(duì)于藻源蝦青素在機(jī)體內(nèi)的生物可接受率并無(wú)顯著影響（圖2）。然而，在膳食中添加低聚果糖之后，顯著降低了蝦青素的生物可接受率，降低至32.92%。低聚果糖的添加不利于藻源蝦青素在機(jī)體內(nèi)的吸收（p＜0.01）。四組小鼠的生物可接受率的變化趨勢(shì)與體質(zhì)量增加量變化趨勢(shì)較為一致，與其他四組小鼠相比，低聚果糖組小鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)最小，可能與低聚果糖促使腸道蠕動(dòng)增快，食物在腸道中停留時(shí)間縮短有關(guān)[22]，這大大不利于藻源蝦青素在機(jī)體內(nèi)的吸收利用。然而，膳食中添加菊粉和殼寡糖對(duì)藻源蝦青素生物利用度的影響有待進(jìn)一步探究。

圖2 菊粉、殼寡糖、低聚果糖對(duì)于藻源蝦青素在正常小鼠體內(nèi)生物可接受率的影響Fig.2 Effects of inulin, chito-oligosaccharides and oligosaccharides on bioacceptability of algae-derived astaxanthin in normal mice

2.3 三種益生元對(duì)不同時(shí)間小鼠糞便中蝦青素含量及小腸脂肪酶的影響

單次灌胃藻源蝦青素后，在不同時(shí)間點(diǎn)取四組小鼠的糞便冷凍干燥后記錄總質(zhì)量，研磨混勻并取約60 mg提取糞便中的蝦青素并進(jìn)行液相分析[3]。由圖3a可知與對(duì)照組相比，菊粉組和殼寡糖組在不同時(shí)間點(diǎn)糞便中蝦青素的量并無(wú)顯著差異，而低聚果糖組在24～36 h時(shí)，小鼠體內(nèi)蝦青素的減少量高于正常組，在該時(shí)間內(nèi)糞便中的蝦青素大量排出。藻源蝦青素需要先水解為游離蝦青素才能夠被機(jī)體吸收和利用[1,16]，因此對(duì)糞便中游離蝦青素含量進(jìn)行了分析。由表1和圖3b可知，各組小鼠糞便中的游離蝦青素的含量隨著時(shí)間的變化逐漸升高，而在8～12 h內(nèi)，各組糞便中游離蝦青素的含量均呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)。菊粉組和殼寡糖組在48 h內(nèi)游離蝦青素的含量均高于正常組。菊粉組小鼠糞便中游離蝦青素含量在各時(shí)間點(diǎn)均高于正常組，菊粉組在8～12 h內(nèi)的游離蝦青素含量與正常組在12～24 h的含量相當(dāng)。同時(shí)，在12～24 h內(nèi)，菊粉組小鼠糞便中游離蝦青素的含量顯著高于對(duì)照組，提高了43.23%（p＜0.05）。上述結(jié)果表明，在膳食中添加菊粉，可提高小鼠糞便中游離蝦青素的含量。

有文獻(xiàn)報(bào)道指出，脂肪酶可以水解蝦青素酯[23]。因此，檢測(cè)了空腸中的脂肪酶活力。由圖3c可知，三種益生元組小鼠腸道脂肪酶活力并無(wú)顯著性變化，反而有下降的趨勢(shì)，這與文獻(xiàn)報(bào)道益生元可以降低模型組小鼠脂肪酶的活力類似[24,25]。機(jī)體內(nèi)的脂肪酶活力并不是導(dǎo)致菊粉組小鼠糞便游離蝦青素含量升高的原因。

圖3 菊粉、殼寡糖、低聚果糖對(duì)不同時(shí)間小鼠糞便蝦青素的含量及小腸脂肪酶的影響Fig.3 Effects of inulin, chitosaccharide and oligosaccharide on astaxanthin content in feces and lipase in small intestine of mice at different time

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠糞便中游離蝦青素的相對(duì)含量（%）Table 1 Relative contents of free astaxanthin in feces of mice at different time points (%)

2.4 菊粉對(duì)蝦青素血清和肝臟代謝曲線的影響

由于菊粉組小鼠糞便中的游離蝦青素含量較高，因此進(jìn)行了第二批動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以探究菊粉的攝入對(duì)藻源蝦青素生物利用度的影響。單次灌胃藻源蝦青素后，檢測(cè)72 h內(nèi)兩組小鼠的血清和肝臟中的蝦青素含量。如圖4a和圖4b所示，菊粉組小鼠血清和肝臟中的蝦青素濃度變化趨勢(shì)與正常組一致。飼喂菊粉后，該組小鼠對(duì)于藻源蝦青素的生物利用度有所提高。表2和表3分別是血清和肝臟的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。由表2可知，兩組小鼠的血清中蝦青素峰值濃度差別不大，達(dá)峰時(shí)間均在20 h，菊粉組小鼠的曲線下面積（AUC）比正常組提高10.84%。與一般的類胡蘿卜素不同，藻源蝦青素的達(dá)峰時(shí)間高達(dá)20 h，這與以往的研究一致[3]，推測(cè)這可能是由于蝦青素酯需要先水解為游離蝦青素才能被機(jī)體吸收和利用。由表3可知，蝦青素在肝臟中的變化趨勢(shì)與血清相一致，菊粉組小鼠的曲線下面積（AUC）顯著高于正常組小鼠，比正常組提高了36.37%。以上結(jié)果提示，膳食添加菊粉改善了藻源蝦青素在機(jī)體內(nèi)的吸收和利用。

圖4 菊粉對(duì)血清和肝臟中蝦青素代謝曲線的影響Fig.4 Effects of inulin on astaxanthin metabolism curves in serum and liver

表2 血清中的AUC0-t值Table 2 AUC0-t values in serum

表3 肝臟中的AUC0-t值Table 3 AUC0-t values in liver

2.5 菊粉對(duì)小鼠糞便短鏈脂肪酸和菌群多樣性的影響

Cao等[26]指出腸道菌群的結(jié)構(gòu)可能會(huì)影響蝦青素的吸收。而菊粉是一種益生元，會(huì)促使腸道菌群結(jié)構(gòu)和短鏈脂肪酸發(fā)生改變[27]，在排除了相關(guān)酶等因素的影響后，推測(cè)腸道菌群的改變可能是導(dǎo)致菊粉組小鼠對(duì)蝦青素的生物利用度較高的原因。因此，對(duì)正常組小鼠和飼喂菊粉兩周的小鼠的糞便進(jìn)行短鏈脂肪酸檢測(cè)和16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序。

如圖5a所示，在6種短鏈脂肪酸中，飼喂菊粉可以顯著極顯著增加乙酸含量，升高了139.54%（p＜0.01），丙酸的含量提高了40.04%（p＜0.05）。丁酸的含量也有所增加。該結(jié)果提示，菊粉的攝入可以增加相關(guān)產(chǎn)短鏈脂肪酸菌的數(shù)量[28]。Gao等[3]研究推測(cè)菌群的結(jié)構(gòu)和豐度變化會(huì)影響蝦青素的吸收。然而，短鏈脂肪酸的變化與蝦青素吸收之間的聯(lián)系有待深入研究。

隨后，對(duì)兩組小鼠糞便進(jìn)行擴(kuò)增子測(cè)序（n=9）。兩組小鼠的糞便菌群的α多樣性并無(wú)顯著差異（圖5b）。韋恩圖（圖5c）的結(jié)果顯示，兩組之間均有741個(gè)相同的OTUs，而菊粉組特有141個(gè)特有的OTUs，對(duì)照組特有187個(gè)特有的OTUs?；赨nweighted Unifrac距離進(jìn)行主坐標(biāo)（PCoA）分析（圖5d）。結(jié)果顯示，菊粉組和對(duì)照組小鼠的菌群組成結(jié)構(gòu)具有一定的差異，提示菊粉在一定程度上改變了小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)，從而可能影響蝦青素在機(jī)體的吸收。

圖5 飼喂菊粉對(duì)小鼠糞便短鏈脂肪酸和菌群多樣性的影響Fig.5 Effects of inulin feeding on fecal short-chain fatty acids and microbial diversity in mice

2.6 菊粉對(duì)正常小鼠腸道菌群組成的影響

圖6 飼喂菊粉對(duì)小鼠腸道菌群的影響Fig.6 Effects of inulin feeding on intestinal microflora in mice

兩組小鼠屬水平上的腸道菌群相對(duì)豐度柱形圖如圖6a所示，菊粉可以使正常小鼠菌群中杜氏桿菌屬（Dubosiella）的相對(duì)豐度從16.30%增加至27.84%，提高了70.80%。雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）的相對(duì)豐度從3.76%增加至4.20%，提高了11.70%，阿克曼氏菌屬（Akkermansia）的相對(duì)豐度從0.56%增加至1.05%，提高了87.50%，羅氏菌屬（Roseburia）的相對(duì)豐度從0.94%增加至2.04%，提高了117.02%。因此，菊粉的攝入可以上調(diào)有益菌屬的相對(duì)豐度，這與Guo等[29]研究結(jié)果中菊粉對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)趨勢(shì)較為一致。Yao等[30]研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌可以促進(jìn)機(jī)體吸收異黃酮，而異黃酮與蝦青素性質(zhì)較為類似，提示菊粉可能是通過(guò)上調(diào)相關(guān)有益菌的豐度從而促進(jìn)蝦青素的吸收。為了進(jìn)一步鑒定出兩組中顯著差異的菌屬，通過(guò)Lefse分析對(duì)兩組小鼠的腸道細(xì)菌進(jìn)行比較，結(jié)果如圖6b～6e所示。圖6b是兩組小鼠顯著性差異菌的進(jìn)化分支圖。圖6c～6e顯示的是屬水平上菊粉組顯著性上調(diào)的菌屬。菊粉可以顯著上調(diào)Thermovirga、UBA1819和Gracilimonas菌的相對(duì)豐度（p＜0.05）。提示菊粉可能是通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)菌的豐度來(lái)改善蝦青素在機(jī)體內(nèi)的吸收。然而，由于缺乏腸道菌對(duì)蝦青素吸收影響的研究，相關(guān)結(jié)果有待進(jìn)一步深入探討。

3 結(jié)論

本文在膳食中添加3種益生元（低聚果糖、菊粉、殼寡糖），探究其對(duì)藻源蝦青素吸收的影響。結(jié)果表明，菊粉和殼寡糖對(duì)蝦青素的生物可接受率并無(wú)顯著差異，低聚果糖顯著降低了蝦青素的生物可接受率。菊粉的攝入可以提高小鼠糞便中游離蝦青素的含量，而在膳食中添加菊粉可以適當(dāng)提高藻源蝦青素的生物利用度，菊粉組肝臟中的代謝曲線下面積（AUC）顯著高于對(duì)照組。菊粉組小鼠糞便中短鏈脂肪酸（SCFAs）的含量升高，杜氏桿菌屬、阿克曼氏菌屬、雙歧桿菌屬的相對(duì)豐度較高。綜上，菊粉可能是通過(guò)上調(diào)與吸收有關(guān)的如雙歧桿菌等有益菌屬的相對(duì)豐度來(lái)改善藻源蝦青素在機(jī)體內(nèi)的吸收利用。然而，由于目前有關(guān)腸道菌群與蝦青素吸收之間的研究相對(duì)較少，相關(guān)有益菌屬和短鏈脂肪酸的上調(diào)與藻源蝦青素在機(jī)體內(nèi)的吸收機(jī)制有待深入研究。本研究為開(kāi)發(fā)菊粉和藻源蝦青素的復(fù)合產(chǎn)品提供了理論支撐，為提高蝦青素的生物利用度提供了新思路。