陳 溪 馬登磊 李 林*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥學(xué)部 北京市神經(jīng)藥物工程技術(shù)研究中心，北京 100053； 2. 北京醫(yī)藥集團(tuán)職工大學(xué)藥學(xué)系，北京 100079)

精神分裂癥是以認(rèn)知力和情感深度分裂為特征的一種疾病，表現(xiàn)為最基本的人類行為受到影響，例如語(yǔ)言、思想、知覺和自我感知等，全球范圍內(nèi)患病率約為1%，嚴(yán)重影響患者及家人的生活[1]。該疾病癥狀主要包括有陽(yáng)性癥狀、陰性癥狀以及認(rèn)知方面的障礙。陽(yáng)性癥狀包括幻想、錯(cuò)覺、思維紊亂以及行為怪誕；陰性癥狀包括行為動(dòng)機(jī)低下、情感反應(yīng)淡漠、失語(yǔ)癥以及興奮能力低下。同時(shí)，大多數(shù)的精神分裂癥患者都有認(rèn)知能力損傷的癥狀，主要是與處理任務(wù)的信息缺失有關(guān)[2]。

白質(zhì)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，是神經(jīng)纖維聚集的地方，中樞神經(jīng)細(xì)胞的髓鞘損害，會(huì)引起白質(zhì)病變。精神分裂癥患者出現(xiàn)白質(zhì)神經(jīng)纖維的異常，如髓鞘的變化、軸突的紊亂等，而且多發(fā)性硬化等脫髓鞘疾病可出現(xiàn)精神障礙癥狀。研究[3]顯示，神經(jīng)白質(zhì)病變與精神障礙和一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。雙環(huán)己酮草酰二腙(cuprizone)是一種銅離子螯合劑，能夠螯合銅離子從而導(dǎo)致銅離子依賴的一系列酶如線粒體酶、細(xì)胞色素氧化酶以及單胺氧化酶等被抑制，從而選擇性誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞(髓鞘形成細(xì)胞)凋亡，引發(fā)髓鞘脫失[4]。若連續(xù)以含0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))cuprizone飼料飼喂小鼠5～6周，小鼠出現(xiàn)明顯的行為學(xué)改變，而且腦內(nèi)胼胝體部位的髓鞘會(huì)出現(xiàn)脫失[5]。該模型具有病程易控制，重現(xiàn)性高等特點(diǎn)，已用于抗精神分裂癥藥物的研究[6-7]。

研究[8]顯示，炎性反應(yīng)和免疫功能異常可能與精神分裂癥的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。在精神分裂癥患者和具有精神分裂高風(fēng)險(xiǎn)的患者大腦內(nèi)，小膠質(zhì)細(xì)胞更活躍，表明神經(jīng)炎性反應(yīng)是精神分裂的一個(gè)重要因素，并成為治療和預(yù)防精神分裂癥的一個(gè)新的潛在目標(biāo)。長(zhǎng)期暴露于慢性不可預(yù)知性應(yīng)激也可導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞的形狀及功能發(fā)生改變，而這種應(yīng)激及其誘發(fā)的炎性反應(yīng)同樣也是導(dǎo)致人類出現(xiàn)精神障礙的最首要原因之一[9]。

淫羊藿是我國(guó)常用的經(jīng)典中藥，具有溫陽(yáng)補(bǔ)腎、強(qiáng)筋健骨、祛風(fēng)除濕等功效。淫羊藿苷是淫羊藿的主要有效成分，具有很好的抗炎作用[10]。筆者[11]前期研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷能夠改善N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體拮抗劑MK-801致精神分裂癥小鼠模型的陰性癥狀和陽(yáng)性癥狀。本研究擬應(yīng)用cuprizone致脫髓鞘小鼠模型，研究淫羊藿苷對(duì)精神分裂癥樣行為學(xué)變化、腦白質(zhì)部位髓鞘脫失及神經(jīng)炎性反應(yīng)的影響，為抗精神分裂癥新藥的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物

淫羊藿苷(icariin，ICA)，高效液相色譜 (high performance liquid chromatography，HPLC)檢測(cè)純度為99.09%，購(gòu)自陜西寶雞市辰光生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

C57BL/6雄性小鼠，6周齡，體質(zhì)量(20±2)g，SPF級(jí)，購(gòu)自首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：11400700106244。小鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、模型+ICA低劑量(25 mg/kg)和高劑量(50 mg/kg)組，每組8只。

1.3 動(dòng)物造模方法

先適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境3 d，然后除了對(duì)照組給予正常飼料以外，其他各組均喂飼含0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))cuprizone的飼料進(jìn)行造模。造模的同時(shí)各組灌胃給予相應(yīng)劑量的藥物，每日一次，連續(xù)5周，然后進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。

1.4 Y-迷宮試驗(yàn)

Y迷宮由3個(gè)完全相同的臂組成。Y-迷宮試驗(yàn)的進(jìn)臂次數(shù)可反映小鼠的活動(dòng)情況，自發(fā)性交替反應(yīng)率可反映小鼠的空間工作記憶情況。自發(fā)性交替反應(yīng)(alternation)檢測(cè)方法：將小鼠放在一個(gè)臂的末端，記錄8 min內(nèi)動(dòng)物進(jìn)入各個(gè)臂的順序。Alternation被定義為連續(xù)進(jìn)入3個(gè)臂(如1，2，3或1，3，2)，最大alternation 為進(jìn)臂次數(shù)的總和-2，然后計(jì)算：自發(fā)性交替反應(yīng)率(%)=實(shí)際的alternation/最大alternation×100%。

1.5 曠場(chǎng)試驗(yàn)

曠場(chǎng)試驗(yàn)(open field test)的設(shè)備由曠場(chǎng)反應(yīng)箱、數(shù)據(jù)自動(dòng)采集和處理系統(tǒng)組成。曠場(chǎng)反應(yīng)箱底邊長(zhǎng)72 cm，高25～30 cm，內(nèi)壁為黑色，底面平均劃分為64個(gè)小方格。正上方架一數(shù)碼攝像頭，拍攝范圍覆蓋整個(gè)曠場(chǎng)內(nèi)部。首先將小鼠放入曠場(chǎng)反應(yīng)箱內(nèi)中心區(qū)域，同時(shí)開始進(jìn)行攝像和計(jì)時(shí)。記錄小鼠10 min內(nèi)的自發(fā)活動(dòng)總距離，距離越長(zhǎng)表示活動(dòng)性越高，可反映精神分裂癥高活動(dòng)性陽(yáng)性癥狀。

1.6 動(dòng)物腦組織取材與切片

小鼠麻醉后分別灌注0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液(以下簡(jiǎn)稱生理鹽水)及4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定液。固定后取出腦組織。脫水后在冰凍切片機(jī)(美國(guó)Thermo公司)中行冠狀位冰凍切片，切片厚度為40 μm。

1.7 油紅O染色

冰凍切片提前切片，呈于載玻片上，稍做晾干。把晾干的載玻片放在盛有水的濕盒中，保持環(huán)境濕潤(rùn)。配制油紅O工作液，靜止10 min后過濾使用，建議過濾兩次染色效果更佳。用60%(體積分?jǐn)?shù))乙醇分色1 min，流水漂洗1 min。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核15 s左右。鹽酸乙醇分色20 s，流水清洗1 min。放置稍做晾干，切不可太過干燥，甘油明膠封片。

1.8 免疫組織化學(xué)方法

應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein, MBP)表達(dá)、Iba-1標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞和GFAP標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞。小鼠腦冰凍切片提前切片，置于載玻片上，10%(體積分?jǐn)?shù))血清封閉。室溫封閉2 h 后，分別孵育一抗：兔抗MBP抗體(1∶2 000稀釋，美國(guó)Sigma公司)、抗Iba-1抗體(1∶500稀釋，日本W(wǎng)ako公司)、抗GFAP抗體(1∶100稀釋，美國(guó)Santa Cruz公司)，4 ℃過夜。PBST洗去一抗后，加入二抗(生物素結(jié)合的羊抗兔IgG抗體，1∶100稀釋，北京中杉金橋生物技術(shù)公司)及三抗(辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素抗體，1∶100稀釋，北京中杉金橋生物技術(shù)公司)。PBST漂洗后用DAB顯色液進(jìn)行顯色(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)。脫水，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察和拍照。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿苷對(duì)cuprizone模型小鼠行為學(xué)變化的影響

2.1.1 Y迷宮試驗(yàn)

與對(duì)照組相比，cuprizone模型小鼠的進(jìn)臂次數(shù)略有增高，ICA(25、50 mg/kg)灌胃給藥5周顯著減低了模型小鼠的進(jìn)臂次數(shù)(P<0.01，圖1A)。此外，模型小鼠的自發(fā)性交替反應(yīng)率明顯減低(P<0.01)，ICA(25 mg/kg)給藥可以明顯增高模型小鼠的自發(fā)性交替反應(yīng)率(P<0.05，圖1B)。

圖1 淫羊藿苷對(duì)cuprizone模型小鼠Y-迷宮試驗(yàn)的影響Fig.1 Effect of icariin (ICA) on Y-maze test in cuprizone model miceA: arm entrance; B: percentage of alternation behavior；*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs model group；##P<0.01 vs control group.

2.1.2 曠場(chǎng)試驗(yàn)

與對(duì)照組相比，cuprizone模型小鼠10 min內(nèi)的自發(fā)活動(dòng)總距離顯著延長(zhǎng)(P<0.01)，ICA(25、50 mg/kg)灌胃給藥能夠明顯縮短模型小鼠的自發(fā)活動(dòng)總距離(P<0.05,圖2)。

圖2 ICA對(duì)cuprizone模型小鼠自發(fā)活動(dòng)總距離的影響(曠場(chǎng)試驗(yàn))Fig.2 Effect of ICA on the total distance of spontaneous activity in cuprizone model mice (open field test)##P<0.01 vs control group; *P<0.05, **P<0.01 vs model group; ICA: icariin.

2.2 ICA對(duì)cuprizone模型小鼠胼胝體部位髓鞘脫失的影響

2.2.1 油紅O染色

正常對(duì)照組小鼠胼胝體著色面積廣，著色程度高，而cuprizone模型組的著色面積和著色程度都顯著

降低。灌胃給予ICA(25、50 mg/kg)能夠顯著增加模型小鼠胼胝體的油紅O著色面積和著色程度(圖3)。

2.2.2 免疫組織化學(xué)染色

采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腦內(nèi)MBP的表達(dá)。與正常對(duì)照組相比，cuprizone模型組小鼠胼胝體部位MBP表達(dá)明顯降低。ICA(25、50 mg/kg)能夠顯著升高模型小鼠腦內(nèi)MBP表達(dá)(圖4)。

2.3 ICA對(duì)cuprizone模型小鼠腦內(nèi)神經(jīng)炎性反應(yīng)的影響

2.3.1 小膠質(zhì)細(xì)胞

采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)以Iba-1標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞。與正常對(duì)照組相比，cuprizone模型組小鼠胼胝體部位小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P<0.01)；ICA(50 mg/kg)灌胃給藥能夠明顯減少模型小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量(P<0.01,圖5)。

圖5 ICA對(duì)cuprizone模型小鼠胼胝體部位小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響Fig.5 Effect of ICA on microglia activation in the corpus callosum of cuprizone model miceA: representative immunohistochemical images, microglia labeled with Iba-1. Scale bar=50 μm; B: number of microglia. ##P<0.01 vs control group，**P<0.01 vs model group; ICA: icariin.

2.3.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞

采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)以GFAP標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞。與正常對(duì)照組相比，cuprizone模型組小鼠胼胝體部位星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P<0.01)。 ICA(50 mg/kg)灌胃給藥能夠明顯減少模型小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量(P<0.01，圖6)。

圖6 ICA對(duì)cuprizone模型小鼠胼胝體部位星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響Fig.6 Effect of ICA on astrocytes in the corpus callosum of cuprizone model miceA: representative immunohistochemical images, astrocytes labeled with GFAP. Scale bar=50 μm. B: number of astrocytes. ##P<0.01 vs control group，**P<0.01 vs model group; ICA: icariin.

3 討論

Cuprizone介導(dǎo)的脫髓鞘模型在胼胝體、海馬、嗅球、視交叉、腦干、小腦、紋狀體、皮質(zhì)、扣帶回等腦區(qū)可見到明顯的脫髓鞘病灶[12]?；诒灸Ｐ托∈笮袨閷W(xué)改變以及病理改變與精神分裂癥患者具有一致性，使得cuprizone誘導(dǎo)的脫髓鞘模型成為研究精神分裂癥白質(zhì)損傷及治療研究的動(dòng)物模型[13]。

Y-迷宮試驗(yàn)和曠場(chǎng)試驗(yàn)是用來(lái)評(píng)價(jià)精神分裂癥動(dòng)物模型行為學(xué)變化的常用方法[14]。Y-迷宮的自發(fā)交替行為可用于檢測(cè)精神分裂癥模型小鼠的空間工作記憶能力(反映認(rèn)知功能)，進(jìn)臂次數(shù)檢測(cè)模型小鼠的高活動(dòng)性(反映陽(yáng)性癥狀)。曠場(chǎng)試驗(yàn)的活動(dòng)總距離亦可用于檢測(cè)精神分裂癥模型小鼠的高活動(dòng)性(反映陽(yáng)性癥狀)[4]。本研究結(jié)果顯示，cuprizone模型小鼠在Y-迷宮試驗(yàn)中的自發(fā)交替反應(yīng)率降低，反映出記憶功能減退；在曠場(chǎng)試驗(yàn)中的活動(dòng)總距離延長(zhǎng)，反映出高活動(dòng)性陽(yáng)性癥狀，表明模型成功模擬了精神分裂癥的癥狀。對(duì)模型小鼠給予ICA，能夠顯著增高Y-迷宮試驗(yàn)的自發(fā)性交替反應(yīng)率，并減少Y-迷宮試驗(yàn)的進(jìn)臂次數(shù)、縮短曠場(chǎng)試驗(yàn)中的活動(dòng)總距離，表明ICA能夠明顯改善模型小鼠的記憶功能障礙和高活動(dòng)性陽(yáng)性癥狀，提示ICA具有抗精神分裂癥潛能。由于目前臨床缺乏改善認(rèn)知障礙的抗精神病藥物，ICA的改善記憶作用尤其值得關(guān)注。

大腦白質(zhì)位于皮質(zhì)深面，有髓神經(jīng)纖維是大腦白質(zhì)的主要組成部分，有髓纖維由髓鞘及其包覆的神經(jīng)軸突構(gòu)成。近年來(lái)，隨著影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展，軸突損傷造成的各腦區(qū)間聯(lián)系紊亂成為精神分裂癥病因?qū)W的重要假說[15]。磁共振-彌散張量成像研究[1,3]顯示，精神分裂癥患者腦內(nèi)白質(zhì)體積減小，出現(xiàn)髓鞘脫失、軸突紊亂等白質(zhì)纖維的異常，提示髓鞘病變與精神分裂癥的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。髓鞘損傷可造成高級(jí)認(rèn)知功能障礙，進(jìn)而影響患者的認(rèn)知功能。MBP是軸突髓鞘化的標(biāo)志性蛋白，是髓鞘的主要組成成分。研究[16]顯示，精神分裂癥患者大腦前額葉皮質(zhì)存在MBP等髓鞘形成相關(guān)蛋白的低表達(dá)。本研究采用油紅O染色和MBP免疫組織化學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)cuprizone模型小鼠腦白質(zhì)胼胝體部位出現(xiàn)明顯的髓鞘脫失，MBP表達(dá)減少，該結(jié)果與Zhang等[17]的報(bào)道一致。而ICA能夠明顯改善模型小鼠胼胝體部位的髓鞘脫失狀況，增高M(jìn)BP的表達(dá)，這可能是ICA改善cuprizone模型小鼠行為學(xué)變化的重要機(jī)制之一。

近年來(lái)的證據(jù)[18]表明，炎性反應(yīng)及免疫功能異常很可能與精神分裂癥的發(fā)病有密切關(guān)系。圍產(chǎn)期的感染是精神分裂癥的高發(fā)因素，對(duì)圍產(chǎn)期的小鼠注射細(xì)菌內(nèi)毒素(脂多糖)能夠作為精神分裂癥動(dòng)物模型的造模手段，也為炎性反應(yīng)參與精神分裂癥的發(fā)生提供了有力的證據(jù)。炎性反應(yīng)可以通過能夠抑制神經(jīng)發(fā)生、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡、抑制髓鞘的形成等，參與精神分裂癥的機(jī)制。同時(shí)，臨床研究[19]的結(jié)果也顯示抗炎藥物能夠改善精神分裂癥患者的部分癥狀，進(jìn)而使精神分裂癥的炎性反應(yīng)假說受到關(guān)注。本研究中，cuprizone模型小鼠胼胝體部位小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多。ICA能夠明顯減少模型小鼠胼胝體部位小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，抑制炎性細(xì)胞活化。結(jié)果提示，ICA的抗神經(jīng)炎性反應(yīng)作用可能是其治療精神分裂癥的作用機(jī)制之一。

綜上所述，對(duì)于cuprizone誘導(dǎo)的精神分裂癥模型小鼠，ICA能夠改善高活動(dòng)性陽(yáng)性癥狀和認(rèn)知功能障礙，并能夠改善髓鞘脫失的病理改變，拮抗神經(jīng)炎性反應(yīng)，可能成為具有抗精神分裂癥潛能的候選藥物。