戴 力，王學(xué)華

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙 410128)

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禾谷類作物小孢子脫分化的生理生化機(jī)制

戴 力，王學(xué)華*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙 410128)

禾谷類作物小孢子脫分化是小孢子細(xì)胞外環(huán)境變化導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境改變，從而誘導(dǎo)代謝酶活性、代謝途徑以及調(diào)控基因表達(dá)的變化，最終脫離原有分化狀態(tài)發(fā)生發(fā)育途徑改變的過程。經(jīng)各種脅迫預(yù)處理后，離體小孢子內(nèi)發(fā)生了饑餓作用、內(nèi)源激素變化和抗氧化脅迫等一系列生理過程，使得正常發(fā)育的結(jié)構(gòu)和信息被破壞或消除，細(xì)胞質(zhì)發(fā)生重組，營養(yǎng)核去抑制化，最終實(shí)現(xiàn)脫分化。這一過程牽涉到復(fù)雜的生理與遺傳調(diào)控，其中起關(guān)鍵作用的酶和基因主要有：蛋白質(zhì)水解酶、乙烯和生長素作用相關(guān)酶類、氧化還原系統(tǒng)或抗脅迫系統(tǒng)相關(guān)酶類、花粉特異蛋白和細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白，以及它們的調(diào)控基因。對它們進(jìn)行一定的人為調(diào)控可有效地促進(jìn)禾谷類作物小孢子脫分化和胚胎誘導(dǎo)。

禾谷類作物；小孢子；脫分化；生理機(jī)制；遺傳模式；生化機(jī)制

作為禾谷類作物新品種培育和種質(zhì)資源改良創(chuàng)新的重要技術(shù)，禾谷類小孢子培養(yǎng)技術(shù)的研究在近年來取得了較大的進(jìn)展，然而其仍無法大規(guī)模應(yīng)用于科研和生產(chǎn)實(shí)踐。究其原因，主要是因?yàn)楹坦阮愋℃咦优咛フT導(dǎo)過程生理生化機(jī)制的復(fù)雜性，從而使得影響其培養(yǎng)體系建成的因素呈現(xiàn)出多樣性。當(dāng)大部分影響因素的作用機(jī)理未能明確時(shí)，便難以對其誘導(dǎo)和培養(yǎng)過程進(jìn)行有效的人為調(diào)控，因此也就無法根據(jù)人類的意愿去進(jìn)行大規(guī)模應(yīng)用。

小孢子培養(yǎng)又稱為小孢子胚胎誘導(dǎo)或單雄生殖，它是具有一定分化程度的花粉細(xì)胞經(jīng)過脫分化和再分化形成完整的單倍體花粉植株的過程。小孢子從花藥中分離出來后，具有較強(qiáng)生活力的活力小孢子會(huì)在一系列的環(huán)境刺激和自身生理生化機(jī)制的作用下脫分化變?yōu)榫哂谐掷m(xù)分裂能力的胚性小孢子，胚性小孢子分裂得到愈傷組織并在各種理化環(huán)境及營養(yǎng)激素因素的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)變?yōu)槟軌驅(qū)崿F(xiàn)再分化獲得植物器官或胚狀體的胚性愈傷組織，之后進(jìn)一步培育獲得獨(dú)立花粉植株；與此同時(shí)那些非活力小孢子、非胚性小孢子和愈傷組織則會(huì)相繼發(fā)生細(xì)胞凋亡而消失。因此，脫分化后獲得胚性小孢子以及誘導(dǎo)獲得胚性愈傷組織是禾谷類小孢子培養(yǎng)過程中的兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，同時(shí)也是有機(jī)體生理生化等代謝機(jī)制最為復(fù)雜的階段。尤其是脫分化過程，它直接決定了后續(xù)誘導(dǎo)過程的有效性，并且其機(jī)制也是相對最復(fù)雜的。本文在前人的研究基礎(chǔ)上對禾谷類作物小孢子脫分化及進(jìn)一步培養(yǎng)獲得愈傷組織(包括胚性和非胚性兩種)過程的生理生化及遺傳機(jī)制進(jìn)行歸納總結(jié)和討論，希望能夠有助于促進(jìn)小孢子培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展。

1 禾谷類作物小孢子脫分化的生理機(jī)制

小孢子脫分化是指小孢子離體后在各種環(huán)境因素(包括物理環(huán)境、營養(yǎng)環(huán)境和信號環(huán)境如激素環(huán)境等)的作用下獲得愈傷組織誘導(dǎo)潛力的過程。小孢子離體前后，在化學(xué)殺雄劑、低溫、高溫、甘露醇等不同脅迫處理下，細(xì)胞內(nèi)部會(huì)發(fā)生一系列生理變化，如水解酶活性增加，合成酶活性降低，核酸、蛋白質(zhì)和糖類等含量減少，線粒體退化，細(xì)胞自我吞噬作用，內(nèi)源激素含量變化，以及氧化脅迫和細(xì)胞程序性死亡等，從而使得小孢子內(nèi)部發(fā)生細(xì)胞質(zhì)重組和營養(yǎng)核分裂去抑制作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞脫分化。筆者根據(jù)前人眾多研究[1～11]總結(jié)歸納出其具體生理代謝機(jī)制網(wǎng)絡(luò)如圖1所示。

2 禾谷類作物小孢子脫分化的遺傳機(jī)制

植物花粉培養(yǎng)能力(簡稱花培能力)主要包括胚胎發(fā)生能力和植株再生能力，兩者受供體基因型影響很大，且彼此的遺傳作用機(jī)制相互獨(dú)立互不影響[12]。而小孢子脫分化是胚胎發(fā)生能力獲得的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)，兩者在某種程度上甚至可以等同。

圖1 禾谷類作物小孢子脫分化的生理機(jī)制

眾多研究表明，當(dāng)外界條件一致時(shí)，同一作物的不同基因型小孢子之間就會(huì)表現(xiàn)出遺傳差異。對玉米[13]、水稻[14]、大麥[15]和小黑麥[16]等禾谷類作物花粉培養(yǎng)能力遺傳機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，該性狀是由多基因控制的數(shù)量遺傳性狀，其遺傳模式復(fù)雜且不一致(表1)。

表1 幾種主要禾谷類作物的花培能力遺傳模式Table 1 Genetic models of microspore culture ability of several main cereal crops

由表1可知，禾谷類作物花粉的培養(yǎng)能力都受到基因的加性效應(yīng)的影響，且以此為主；大部分作物還受到顯性效應(yīng)的影響；而對于某些作物而言互作效應(yīng)也是不可忽視的，如水稻。另外，針對小黑麥的相關(guān)遺傳特性，孫娜等[16]提出在高廣義遺傳力(GCA)基礎(chǔ)上進(jìn)行高狹義遺傳力(SCA)配組，通過雜交可以選育出高花培能力的基因型。至于其他禾谷類作物是否也有相似的高花培能力基因型的選育方法，還有待于更多的遺傳研究。

然而，對于小孢子培養(yǎng)能力這類多基因控制的復(fù)雜性狀，其基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)往往呈現(xiàn)為“模塊化”的特性，通常是由主效基因和上下游基因及其相互作用的調(diào)控基因組合成一個(gè)功能單元，作為一個(gè)整體承擔(dān)相關(guān)功能的發(fā)揮和目標(biāo)性狀的形成。因此就當(dāng)前對于1～3個(gè)基因能夠起到很好改良作用的轉(zhuǎn)基因育種和常規(guī)育種技術(shù)而言，能夠?qū)ǚ叟囵B(yǎng)能力起到的改良作用是相當(dāng)有限的。相比較而言，當(dāng)前最新提出的一種新一代生物育種技術(shù)——分子模塊設(shè)計(jì)育種技術(shù)[17]則能夠很好地改良此性狀，因?yàn)樵摷夹g(shù)對多基因性狀的改良是針對于“模塊化”的整個(gè)功能單元而并非單一基因而進(jìn)行的。不過這一育種技術(shù)要應(yīng)用到小孢子培養(yǎng)能力性狀的改良中，則還需要首先對控制胚胎發(fā)生能力和植株再生能力的關(guān)鍵生理代謝過程、關(guān)鍵酶和關(guān)鍵基因及其上下游和調(diào)控相關(guān)基因擁有一定的了解。而這還有待于更多的研究者去探索。

此外，孫海鵬等[15]研究發(fā)現(xiàn)，不同花培能力大麥出愈率的明顯區(qū)別表現(xiàn)在多核花粉形成之后，而在此之前不同基因型間并無顯著差異；故其推測：不同基因型之間胚胎發(fā)生能力的差異很有可能是由其多核花粉成愈能力決定的，而非由小孢子脫分化啟動(dòng)能力控制，且可能與新細(xì)胞壁的合成能力有關(guān)。孫敬三等[18]和周嫦等[19]也認(rèn)為，多核花粉形成后，新細(xì)胞壁不能形成或不能及時(shí)形成是雄核發(fā)育失敗的原因之一。然而關(guān)于新細(xì)胞壁的形成與脫分化之間它們對花培的影響哪一個(gè)更重要或者一樣重要目前尚無直接的研究結(jié)果以做定論。筆者認(rèn)為兩者的重要性對于小孢子培養(yǎng)來說都是非常顯著的，可能脫分化要較細(xì)胞壁的形成更重要，因?yàn)樗切℃咦影l(fā)育途徑轉(zhuǎn)變的基礎(chǔ)。

3 禾谷類作物小孢子脫分化的生化機(jī)制

從分子生物學(xué)的角度看，花培能力遺傳模式的復(fù)雜可能與參與調(diào)控的基因數(shù)目和種類眾多有關(guān)。據(jù)報(bào)道有成百上千個(gè)不同種類的基因參與其中[20，21]，它們的表達(dá)或上調(diào)或下降，且在不同作物、不同基因型中的表達(dá)又各有差別。近年來，對小孢子胚胎誘導(dǎo)分子機(jī)制的研究不斷增多，且主要集中在對關(guān)鍵環(huán)節(jié)機(jī)制的探討，比如：小孢子脅迫前處理、花粉脫分化、發(fā)育途徑轉(zhuǎn)變以及白化苗的形成等；其中涉及到的基因種類眾多，包括形態(tài)特征、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞命運(yùn)決定、細(xì)胞壁變化、細(xì)胞保護(hù)、防御和毒性及脅迫反應(yīng)、新陳代謝、轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控、蛋白質(zhì)降解、質(zhì)體發(fā)育以及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等相關(guān)基因[22]。這里主要對在小孢子脫分化和愈傷組織形成過程中已知的幾個(gè)重要生理過程的重要調(diào)控基因及其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行歸納探討。主要包括如下幾個(gè)方面：

3.1 外界逆境脅迫耐受基因

外界的逆境脅迫可以使花粉中的小孢子孤立化，并誘導(dǎo)其細(xì)胞內(nèi)發(fā)生各種生理生化代謝反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)脫分化，同時(shí)也能夠提高小孢子的誘導(dǎo)質(zhì)量。對于能夠在脅迫中存活下來并繼續(xù)分裂得到愈傷組織的小孢子而言，其自身的逆境脅迫耐受機(jī)制起到了十分重要的作用；其機(jī)制受到各種耐受相關(guān)基因的調(diào)控。當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的脅迫耐受相關(guān)基因主要有PR蛋白基因、氧化脅迫相關(guān)蛋白基因、熱激蛋白基因、抗氧化脅迫和解毒蛋白基因等，它們被發(fā)現(xiàn)在受到甘露醇預(yù)處理的小孢子中發(fā)生表達(dá)[23]。由于氧化脅迫與抗氧化脅迫的特殊性，后面將對其進(jìn)行單獨(dú)討論，這里主要討論與外界脅迫因素應(yīng)對相關(guān)的基因，如PR蛋白基因和熱激蛋白基因等。

PR蛋白包括兩種葡聚糖內(nèi)切β-1，3-葡萄糖苷酶，三種甘露醇脫氫酶(ELI1、2和3)以及一種類滲透蛋白(osmotin-like protein)。β-1，3-葡萄糖苷酶按照其作用方式和產(chǎn)物可分為內(nèi)切、端解和葡萄糖苷酶，是纖維素酶系的組成部分，其功能是分解細(xì)胞壁糖類，在細(xì)胞分裂、小孢子發(fā)生及細(xì)胞壁生物合成等很多方面具有重要作用。在植物體內(nèi)，β-1，3-葡萄糖苷酶基因的表達(dá)能夠被熱處理、機(jī)械處理以及乙酰水楊酸鈉和多聚腺苷酸等100多種化學(xué)物質(zhì)所誘導(dǎo)[24]。因此筆者推測，在小孢子培養(yǎng)過程中該蛋白可能被高溫預(yù)處理或機(jī)械分離小孢子過程所誘導(dǎo)，然后通過影響細(xì)胞壁的形成或小孢子細(xì)胞的分裂來作用于小孢子的脫分化過程。它可能是小孢子脫分化的促進(jìn)或保障性因素而非誘導(dǎo)性因素。

此外有研究表明，β-1，3-葡萄糖苷酶基因和甘露醇脫氫酶基因在小孢子胚胎發(fā)育的兩個(gè)階段特異性表達(dá)，并且它們在高誘導(dǎo)系中的最高表達(dá)時(shí)期為脫分化時(shí)期。可見其對于小孢子脫分化的重要性。同時(shí)推測其作用可能不僅限于逆境脅迫的耐受，也許與小孢子發(fā)育途徑的改變存在著某些關(guān)系。

與小孢子胚胎誘導(dǎo)相關(guān)的熱激蛋白(HSPs)主要是HSP70和HSP81-2，它們可能在提高小孢子脅迫耐受性能的同時(shí)間接參與孢子體途徑的轉(zhuǎn)化[25]。Sánchez-Díaz等[22]也發(fā)現(xiàn)，熱激蛋白基因與小麥小孢子發(fā)育程序重調(diào)及早期胚胎誘導(dǎo)相關(guān)。HSP70主要作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)的折疊、裝配、轉(zhuǎn)運(yùn)等，并能恢復(fù)或加速清除細(xì)胞內(nèi)變性的蛋白質(zhì)而穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)，參與細(xì)胞保護(hù)；其中的一些還能被除高溫脅迫外的其他條件所誘導(dǎo)，如水分、低溫和鹽脅迫等[26，27]。此外，Muoz-Amatriaín等[21]還發(fā)現(xiàn)，它們的表達(dá)對最終的綠苗產(chǎn)量也有著重要的作用。

筆者認(rèn)為外界逆境脅迫相關(guān)基因可能主要通過兩個(gè)方面的作用來影響小孢子的脫分化和小孢子胚胎的誘導(dǎo)：提高小孢子的逆境耐受能力來提高活力小孢子數(shù)目和誘導(dǎo)小孢子發(fā)生發(fā)育途徑的改變來提高胚性小孢子數(shù)目。因此，如何挖掘和利用外界脅迫、脅迫相關(guān)基因或蛋白以及小孢子脫分化或胚胎誘導(dǎo)之間的關(guān)系，提升小孢子脫分化效率和胚胎誘導(dǎo)率，還有待于更多的研究探索。

3.2 饑餓作用相關(guān)基因

小孢子內(nèi)的饑餓作用是在離體或脅迫作用下誘導(dǎo)發(fā)生的，其中牽涉到一系列的酶和蛋白質(zhì)及其調(diào)控基因。當(dāng)前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的調(diào)控基因主要包括糖類和脂質(zhì)退化和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因、產(chǎn)能相關(guān)蛋白的基因、蛋白質(zhì)水解相關(guān)基因以及氨基酸分解中氨再吸收過程相關(guān)基因。它們很可能是小孢子脫分化過程的關(guān)鍵誘導(dǎo)因素。

糖類和脂質(zhì)的退化和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因主要有β-D-木糖酶基因、α-半乳糖苷酶基因、脂肪酶基因和蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因等[21]。能夠產(chǎn)生相關(guān)蛋白的基因則包括兩種氧化還原酶基因和一種質(zhì)子依賴的寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。Muoz-Amatriaín等[20]發(fā)現(xiàn)，高胚胎誘導(dǎo)品種在小孢子胚胎誘導(dǎo)過程中具有活躍的糖類和脂質(zhì)的降解代謝，這有利于蔗糖含量的增加。

蛋白質(zhì)水解相關(guān)基因主要是天冬氨酸蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶和26S蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基的編碼基因。較多研究發(fā)現(xiàn)，單雄生殖過程中，小孢子經(jīng)脅迫處理后其內(nèi)部會(huì)出現(xiàn)一種全面的蛋白質(zhì)水平下調(diào)的現(xiàn)象，蛋白質(zhì)組學(xué)方法證明，此時(shí)小孢子內(nèi)部發(fā)生了蛋白質(zhì)磷酸化和糖基化等一系列的改變[28]。從而有假說認(rèn)為，花粉特異蛋白的下調(diào)和蛋白質(zhì)分解的增加可能在小孢子脫分化過程中起到重要作用。而進(jìn)一步的研究則充分證明了這一點(diǎn)。它們發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)水解基因的誘發(fā)與小孢子胚胎的誘導(dǎo)潛力息息相關(guān)[29]，并且還能影響最終的綠苗產(chǎn)量[21]。此外，Harada等[30]早在1986年便發(fā)現(xiàn)，阻礙花粉特異基因的轉(zhuǎn)錄有利于單雄生殖的起始。這可能與花粉特異蛋白的合成量下調(diào)有關(guān)。

在植物細(xì)胞中，營養(yǎng)饑餓或匱乏會(huì)導(dǎo)致“饑餓基因”的活躍轉(zhuǎn)錄，而它們的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與細(xì)胞組成成分的降解和營養(yǎng)物質(zhì)的再活化密切相關(guān)。饑餓期間，與碳水化合物再活化相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，同時(shí)氮素循環(huán)相關(guān)酶的活性也相應(yīng)增強(qiáng)。氮素循環(huán)牽涉到相關(guān)蛋白質(zhì)的降解，這一過程包括多種不同類型的植物蛋白酶和泛素-26S蛋白酶體途徑。對體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞脫分化時(shí)總是伴隨著蛋白酶基因和泛素-26S蛋白酶體途徑相關(guān)蛋白基因的增量表達(dá)。另外，對大麥小孢子胚胎誘導(dǎo)的研究也發(fā)現(xiàn)，其誘導(dǎo)潛力與半胱氨酸蛋白酶1的前體、天冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶FtsH和一個(gè)泛素-26S調(diào)控微粒的編碼基因的表達(dá)水平具有一定的相關(guān)性[31]。這些結(jié)果表明，蔗糖耗盡時(shí)蛋白質(zhì)降解對于氮素的遷移和小孢子的脫分化具有重要作用，這一過程一方面可能導(dǎo)致與先前分化狀態(tài)相關(guān)的蛋白質(zhì)的選擇性破壞，另一方面可能還有利于新物質(zhì)的合成，從而使得小孢子的發(fā)育途徑發(fā)生改變。

碳水化合物再活化及氮素循環(huán)除與糖類、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的水解有關(guān)外，還與氨基酸的分解過程密切相關(guān)。氨基酸分解中的氨再吸收過程則與小孢子的饑餓作用及脫分化之間存在著一定的聯(lián)系。這一過程相關(guān)基因主要包括谷氨酰胺合成酶(GS2)基因、天門冬酰胺合成酶(AS)基因和與芳香族氨基酸相關(guān)的shikimate激酶基因[21]。

上述研究結(jié)果綜合說明了小孢子饑餓作用對單雄生殖的誘導(dǎo)作用。然而也有研究發(fā)現(xiàn)，在某些低小孢子胚胎誘導(dǎo)系也出現(xiàn)了蛋白質(zhì)水解和氨基酸異化作用增強(qiáng)的現(xiàn)象[21]。因此筆者認(rèn)為，“饑餓”對小孢子脫分化的促進(jìn)作用與“饑餓過程”相比，可能“饑餓程度”對其影響更大。輕度饑餓或蛋白質(zhì)水解可能并不足以完全消除花粉特異蛋白，從而仍無法成功誘導(dǎo)小孢子發(fā)生脫分化；而過度的蛋白質(zhì)水解卻又可能會(huì)導(dǎo)致基本代謝體系的破壞，從而導(dǎo)致小孢子細(xì)胞死亡或活力下降，也不利于小孢子胚胎的誘導(dǎo)；可能只有適度的蛋白質(zhì)水解程度才能較好地促進(jìn)小孢子單雄生殖的誘導(dǎo)。這也許從另一個(gè)角度體現(xiàn)了小孢子胚胎誘導(dǎo)的復(fù)雜性。

因此，對于饑餓作用促進(jìn)小孢子脫分化的機(jī)制，可做出如下解釋：糖類和脂質(zhì)的降解是細(xì)胞自身在營養(yǎng)缺乏條件下的一種求生機(jī)制，它的結(jié)果一方面是維持了細(xì)胞基本的生命代謝過程，保證小孢子的生活力；另一方面也為下一步的蛋白質(zhì)水解過程奠定了基礎(chǔ)。即當(dāng)前兩種能量儲存物質(zhì)幾乎消耗殆盡時(shí)，細(xì)胞便只能通過進(jìn)一步水解代謝蛋白質(zhì)以提供維持基本生命過程所需要的能量，而相對于維持基本結(jié)構(gòu)與代謝的蛋白質(zhì)而言，小孢子的分化狀態(tài)維持相關(guān)蛋白則成為“冗余蛋白”或“冗余能耗”，因此首先被分解消耗，如果在這類“冗余”蛋白被消耗完時(shí)細(xì)胞能夠從外界獲取一定的營養(yǎng)或能量支持，終止蛋白質(zhì)水解的進(jìn)一步繼續(xù)，小孢子細(xì)胞則會(huì)在此時(shí)發(fā)生脫分化，進(jìn)行細(xì)胞分裂與繁殖。否則，便會(huì)導(dǎo)致基本代謝蛋白和體系的破壞，從而降低細(xì)胞的生活力甚至發(fā)生細(xì)胞死亡。

另外，培養(yǎng)早期脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ECLTP)基因被認(rèn)為與大麥小孢子發(fā)育途徑轉(zhuǎn)變有關(guān)[22]。ECLTP是一種非特異性脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其同源物脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白群(LTPs)能于離體培養(yǎng)下在薄膜片段之間轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪，且在不同時(shí)間、組織和細(xì)胞類型中的表達(dá)可能不同[32]。ECLTP對于小孢子脫分化的具體作用當(dāng)前仍不清楚，只知道其表達(dá)圖式與胡蘿卜的LTP cDNA EP2(胚胎誘導(dǎo)蛋白2)相似。EP2是胡蘿卜體胚誘導(dǎo)體系中胚胎誘導(dǎo)蛋白的標(biāo)記，被認(rèn)為與利用角質(zhì)單體進(jìn)行角質(zhì)合成的活動(dòng)有關(guān)[32]。

3.3 內(nèi)源激素變化相關(guān)基因

植物激素作為一類重要的信號物質(zhì)，其在細(xì)胞的生長發(fā)育與生理代謝中起到非常重要的調(diào)控作用，并且在不同的生理過程中，起主要作用的激素類型各有不同。眾多研究表明，在幾類植物激素中，生長素和乙烯對小孢子脫分化過程的調(diào)控起到了主要作用，而且其二者既可以單獨(dú)作用于小孢子的發(fā)育途徑改變，也能夠通過相互作用來調(diào)控小孢子的分化狀態(tài)。根據(jù)前人對體胚或小孢子胚胎誘導(dǎo)的研究，筆者推測它們之間可能存在著如下關(guān)系：

機(jī)械創(chuàng)傷、外源激素(如生長素等)作用和其他一些生物或非生物脅迫可誘導(dǎo)小孢子內(nèi)部乙烯合成關(guān)鍵酶ACS基因的表達(dá)，合成大量的乙烯，過量的乙烯一方面通過影響DNA甲基化酶基因的表達(dá)和酶活性使DNA的甲基化發(fā)生變化[33]，從而調(diào)控與小孢子脫分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性；另一方面過量的乙烯通過干擾由YUC基因介導(dǎo)的生長素區(qū)域性合成來破壞生長素信號的極性分布，從而破壞細(xì)胞的極性，促使細(xì)胞實(shí)現(xiàn)脫分化，而這在胚胎形成后期卻表現(xiàn)為阻礙胚胎的形成[34]。此外有研究發(fā)現(xiàn)，ETO1基因發(fā)生突變會(huì)引起乙烯的過量合成；乙烯響應(yīng)基因CTR1突變也會(huì)明顯降低YUC基因的表達(dá)，干擾生長素的極性分布，從而有利于胚性愈傷組織的形成，但不利于體胚的分化[34]。

體胚誘導(dǎo)的研究表明，IAA的合成有利于胚性細(xì)胞的產(chǎn)生[35]。研究發(fā)現(xiàn)[34，35]，在生長素缺失的情況下，生長素響應(yīng)因子(ARFs)會(huì)被轉(zhuǎn)錄抑制因子AUX/IAA蛋白結(jié)合而使其活性受到抑制，從而無法調(diào)節(jié)生長素響應(yīng)基因的表達(dá)；而當(dāng)生長素出現(xiàn)時(shí)，生長素會(huì)促使泛素與AUX/IAA蛋白結(jié)合，使之發(fā)生降解而釋放出具有活性的ARF蛋白。ARF蛋白一方面與生長素應(yīng)答因子AuxRE結(jié)合，調(diào)節(jié)生長素響應(yīng)基因的表達(dá)，另一方面ARF基因MP可直接激活PIN1基因的轉(zhuǎn)錄，而其產(chǎn)物PIN蛋白的極性定位則可決定生長素的極性運(yùn)輸與梯度分布，從而促進(jìn)WUS基因的表達(dá)。與LEC2等基因一樣，WUS基因是胚胎形成過程中的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因，它們主要通過功能缺失突變或過量表達(dá)的方式來調(diào)控遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄過程，從而促進(jìn)體細(xì)胞向胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)變[36]。LEC2基因可以直接調(diào)控生長素合成基因YUC4的表達(dá)，同時(shí)還激活了生長素響應(yīng)基因的表達(dá)，從而激活了生長素信號途徑[37]。

此外，增加培養(yǎng)基中外源生長素的濃度也可以增加乙烯合成關(guān)鍵酶基因ACS(ACS2、6、8)的轉(zhuǎn)錄水平，從而使乙烯的合成增加[35]。乙烯也可以通過誘導(dǎo)鄰氨基苯甲酸合成酶的α亞基相關(guān)基因(ASA1、WEI2和TIR7)和β亞基相關(guān)基因(ASB1和WEI7)的表達(dá)，來影響催化色氨酸合成的第一個(gè)關(guān)鍵步驟，從而影響生長素的合成[34]。

3.4 氧化脅迫相關(guān)基因

氧化脅迫是由于外界脅迫所引發(fā)的一種細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境的惡化，它在小孢子脫分化及其胚胎的誘導(dǎo)過程中起到了非常關(guān)鍵的作用。重度氧化脅迫能夠降低小孢子活力，使脂質(zhì)和蛋白質(zhì)發(fā)生過氧化作用，導(dǎo)致核酸損傷、內(nèi)折以及質(zhì)體和線粒體受損，不利于小孢子的成活和脫分化。而輕度氧化脅迫則可作為細(xì)胞分裂循環(huán)和生長發(fā)育的第二信使，并誘發(fā)小孢子發(fā)育重調(diào)。而有機(jī)體內(nèi)部的抗氧化脅迫和解毒蛋白則可以減輕氧化脅迫的危害程度，保護(hù)細(xì)胞活力，促進(jìn)小孢子的發(fā)育重調(diào)。

抗氧化脅迫和解毒蛋白主要包括NAD(P)H：苯醌還原酶(NQR)、細(xì)胞色素P450核黃素合成蛋白ribA和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)[22]。其中研究較多的是培養(yǎng)早期谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(ECGST)基因(主要有GSTF2和GSTA2)，它可能在保護(hù)被培養(yǎng)的小孢子免受氧化脅迫危害中起到重要作用[32]。GSTF2編碼一種φ(F)類谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，GSTA2則編碼一種病原菌誘導(dǎo)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶[22]。研究發(fā)現(xiàn)，GST基因的上調(diào)在小孢子胚胎誘導(dǎo)不同階段都有發(fā)現(xiàn)[23]。GSTF2和GSTA2在小孢子獲得“星狀”結(jié)構(gòu)或經(jīng)歷第一次分裂時(shí)發(fā)生表達(dá)[22]。在小麥和小黑麥的花粉培養(yǎng)中，GSTF2分別在培養(yǎng)開始后的第5和第4天，即小孢子胚胎誘導(dǎo)的早期開始表達(dá)，在小黑麥小孢子胚胎低和高誘導(dǎo)系中其最高表達(dá)時(shí)期分別在第4天和第8天；而其同類物GSTA2在小黑麥上述兩個(gè)誘導(dǎo)系中的最高表達(dá)時(shí)期都在第8天[8，22]；且在大麥和小黑麥中，經(jīng)脅迫誘導(dǎo)后GSTs基因的表達(dá)會(huì)發(fā)生上調(diào)[8，21～23]。Zur等[8]認(rèn)為，GSTs的高水平表達(dá)對于離體培養(yǎng)的前8 d尤為重要，它可能與最初的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)形成有關(guān)；并猜想GSTs這一能夠催化谷胱甘肽(GSH)結(jié)合到各種底物上，并具有GSH依賴性過氧化物酶功能的酶，在雄配子體發(fā)育途徑的更高階段中起到重要的作用。也有研究者認(rèn)為，GST的誘導(dǎo)表達(dá)與生長活躍階段的發(fā)育中的胚胎免受脅迫危害有關(guān)，與單雄生殖潛力的獲得無關(guān)[28，32]。而Sánchez-Díaz等[22]則認(rèn)為該基因與大麥小孢子發(fā)育程序重調(diào)階段有關(guān)。

此外，還有一種表達(dá)合成一類被稱為植物防御素或δ-硫堇蛋白的小分子富半胱氨酸蛋白家族的基因——Tad1[8]，有研究認(rèn)為，在各種胚胎誘導(dǎo)體系中，它是小孢子來源胚胎發(fā)生程序所特有的[22]。

3.5 細(xì)胞周期相關(guān)基因

對于小孢子脫分化而言，其最重要的標(biāo)志就是細(xì)胞重新進(jìn)入分裂周期，它幾乎可以等同于脫分化本身。植物細(xì)胞分裂周期受到細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(CDKs)和其相關(guān)基因的特異性調(diào)控以及在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的定位調(diào)控，CDKs相應(yīng)地受到細(xì)胞周期蛋白、CDK活化激酶和抑制激酶以及幾種CDK抑制劑的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)這些調(diào)節(jié)器中很大一部分的半衰期都受到泛素-26S蛋白酶體途徑的影響，使蛋白質(zhì)降解與植物細(xì)胞周期調(diào)控相聯(lián)系。而在正?；ǚ郯l(fā)育過程中，細(xì)胞周期的調(diào)控是穩(wěn)定進(jìn)行的；小孢子細(xì)胞進(jìn)行不對稱分裂之后，營養(yǎng)細(xì)胞滯留在細(xì)胞周期的G1階段，同時(shí)生殖細(xì)胞發(fā)展到有絲分裂并進(jìn)一步分裂形成兩個(gè)精細(xì)胞。通過脅迫誘導(dǎo)的單雄生殖能夠克服營養(yǎng)細(xì)胞的這種發(fā)育調(diào)控性細(xì)胞周期停滯，從而使得脅迫處理時(shí)的營養(yǎng)細(xì)胞能夠重新進(jìn)入S階段，并在此后的培養(yǎng)過程中進(jìn)入到G2/M轉(zhuǎn)化期。據(jù)此推測，泛素途徑組成成分的誘發(fā)和蛋白酶基因的表達(dá)可能與小孢子胚胎誘導(dǎo)潛力獲得期間的有絲分裂調(diào)控有關(guān)[31]。其他研究也發(fā)現(xiàn)，在體胚誘導(dǎo)的成胚潛力獲得期間，蛋白酶基因在細(xì)胞分裂相關(guān)基因之前活化，這似乎能夠在某種程度上證明上述推測的合理性。

此外，F(xiàn)BL17基因和RBR基因也可能與小孢子的脫分化有關(guān)。FBL17表達(dá)產(chǎn)物能夠降解細(xì)胞分裂周期抑制因子KRP6和KRP7，從而激活CDKA，使DNA合成得以發(fā)生[38]。至于其能否促進(jìn)小孢子的脫分化，還有待于直接的驗(yàn)證。另有研究發(fā)現(xiàn)，防止細(xì)胞過度增殖的RBR基因發(fā)生突變后，由小孢子分裂而來的營養(yǎng)細(xì)胞也能夠進(jìn)行再分裂，而通常情況下，營養(yǎng)細(xì)胞是停止繼續(xù)分裂的[38]。故推測，RBR的表達(dá)可能會(huì)阻礙小孢子的脫分化。而能否通過認(rèn)為調(diào)控使之發(fā)生表達(dá)缺少從而促進(jìn)分化小孢子重新進(jìn)入細(xì)胞周期，也還有待于研究。

4 研究展望

禾谷類作物小孢子脫分化是一定外界條件誘導(dǎo)小孢子內(nèi)部生理代謝和基因表達(dá)發(fā)生改變，脫離原有分化狀態(tài)之后發(fā)生發(fā)育途徑改變的過程。小孢子細(xì)胞外環(huán)境的變化導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境的改變，主要包括營養(yǎng)環(huán)境和信號環(huán)境或激素環(huán)境，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)代謝酶活性、代謝途徑以及調(diào)控基因表達(dá)的變化。因此，要對小孢子脫分化過程進(jìn)行有效的人為調(diào)控，則可能需要從如下幾方面入手：

(1)為細(xì)胞脫分化的發(fā)生提供適當(dāng)?shù)耐獠繝I養(yǎng)、激素和物理環(huán)境。因此，首先便需要對內(nèi)部環(huán)境對外部環(huán)境變化的響應(yīng)機(jī)制具有準(zhǔn)確的了解，比如高溫、低溫、滲透脅迫以及化學(xué)藥劑等如何影響禾谷類小孢子細(xì)胞內(nèi)部的營養(yǎng)和激素代謝，它們與小孢子脫分化之間有什么聯(lián)系等。

(2)促進(jìn)或抑制關(guān)鍵功能蛋白作用和酶類的活性。在小孢子脫分化的代謝系統(tǒng)中，具有可調(diào)控性的關(guān)鍵酶可能主要是激素作用相關(guān)的酶和氧化還原系統(tǒng)或抗脅迫系統(tǒng)相關(guān)的酶。前者主要包括：乙烯合成關(guān)鍵酶1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶ACS和IAA合成關(guān)鍵酶黃素氮加氧酶家族YUCCA蛋白，以及與生長素運(yùn)輸和極性分布相關(guān)的生長素外運(yùn)載體PIN蛋白和與生長素響應(yīng)相關(guān)的生長素受體蛋白TIR1和ABP1；后者主要包括熱激蛋白HSP和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶。對于這些關(guān)鍵代謝酶或功能蛋白，它們的活性或作用如何影響小孢子的脫分化過程還有待進(jìn)一步的明確，同時(shí)如何對其進(jìn)行人為調(diào)控從而影響細(xì)胞的脫分化也還需要更多的探索。此外，植物蛋白酶和泛素-26S蛋白酶體活性的可調(diào)控性對于小孢子脫分化研究而言可能也具有較大價(jià)值。

(3)對關(guān)鍵調(diào)控基因或“基因模塊”進(jìn)行表達(dá)調(diào)控和遺傳改良。表達(dá)調(diào)控主要是對某些基因進(jìn)行人為處理使之發(fā)生過量或沉默表達(dá)。在小孢子脫分化中，對花粉特異蛋白基因和細(xì)胞分裂抑制調(diào)控基因的表達(dá)進(jìn)行人為干擾可能有利于脫分化的進(jìn)行；特別是花粉特異蛋白基因，它的表達(dá)結(jié)果使小孢子細(xì)胞維持在分化狀態(tài)，可能是通過控制細(xì)胞內(nèi)環(huán)境(包括營養(yǎng)和信號環(huán)境)狀態(tài)來控制代謝基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，它就行一個(gè)“總開關(guān)”控制著下游各種與分化和脫分化相關(guān)的代謝途徑和網(wǎng)絡(luò)，而細(xì)胞分裂抑制調(diào)控基因可能就是它下游代謝支路中的另一個(gè)比較重要的“開關(guān)”，控制著細(xì)胞的分裂狀況。因此對它們進(jìn)行抑制表達(dá)，也許可以很好地促進(jìn)小孢子的脫分化。根據(jù)系統(tǒng)論的觀點(diǎn)，如果將整個(gè)脫分化代謝網(wǎng)絡(luò)看成一個(gè)整體或“功能模塊”的話，那么其下的饑餓作用代謝、內(nèi)源激素代謝、氧化脅迫和抗氧化脅迫代謝等則均為組成這一整體的“部分”，它們各自也是一個(gè)“亞功能模塊”或“功能單元”，因此其各自的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也可以看成一個(gè)相對獨(dú)立的“基因模塊”，所以對以關(guān)鍵酶或蛋白的關(guān)鍵調(diào)控基因?yàn)橹攸c(diǎn)的“基因模塊”進(jìn)行遺傳改良可能對于小孢子脫分化的促進(jìn)效果要更優(yōu)于對單獨(dú)某個(gè)或幾個(gè)基因進(jìn)行改良。因此對于這幾個(gè)“功能單元”內(nèi)部的代謝和調(diào)控機(jī)制進(jìn)行相對獨(dú)立的“點(diǎn)”、“線”和“面”的研究，然后再將之相互聯(lián)系起來，以探討其對小孢子脫分化的作用，則顯得尤為必要。其中對抗脅迫系統(tǒng)和氧化還原系統(tǒng)的遺傳改良效果較“功能單元”而言可能要相對較好。

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Physiology and Biochemical Mechanism of Microspore Dedifferentiation in Cereal Crops

DAI Li，WANG Xuehua*

(College of Agronomy，Hunan Agriculture University，Changsha，Hunan 410128，China)

Microspore dedifferentiation of cereal crops is a process that with the changing of the extracellular environment，the intracellular environment altered，thus inducing the activity of metabolic enzymes，the metabolic pathway and the regulator gene expression to change，finally breaking away from the original state of differentiation and altering developmental way.After various stress pretreatments，a series of physiological events occurred in the isolated microspores，such as starvation effect，endogenous hormone changes，antioxidant stress，which made the structure and information of the normal development destroyed or elimilated，the cytoplasm restructured，and the division of the vegetative nucleus derepressed，and ultimately realizes the dedifferentiation.This process involves complex physiological and genetic regulation，and in which have many key enzymes and genes which have great effects in the microspore dedifferentiation，for example，the protein hydrolases，ethylene and auxin role related enzymes，oxidation-reduction system or anti-stress system related enzymes，pollen specific proteins，cell division related proteins，and their regulator genes.And making some artificial regulation to them may be able to promote the microspore dedifferentiation and embryo induction in cereal crops effectually.

cereal crops；microspore；dedifferentiation；physiology mechanism；genetic model；biochemical mechanism

2016-05-17

戴 力(1992-)，男，碩士研究生，Email：14789935821@163.com。*通信作者：王學(xué)華，教授，博士生導(dǎo)師，從事作物栽培與耕作學(xué)研究，Email：13873160151@163.com。

國家科技支撐計(jì)劃(2013BAD07B11)。

Q943.1

A

1001-5280(2016)05-0585-09

10.16848/j.cnki.issn.1001-5280.2016.05.24