蔡擴(kuò)軍，李愛巧，何生，楊啟元，徐敏，楊小亮，王濤

（1.烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心，新疆烏魯木齊830063；2.烏魯木齊市米東區(qū)畜牧獸醫(yī)站，烏魯木齊831400）

豬圓環(huán)病毒2型烏魯木齊分離株全基因序列遺傳變異分析

蔡擴(kuò)軍1，李愛巧1，何生2，楊啟元1，徐敏1，楊小亮1，王濤1

（1.烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心，新疆烏魯木齊830063；2.烏魯木齊市米東區(qū)畜牧獸醫(yī)站，烏魯木齊831400）

為分析烏魯木齊市豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）遺傳變異情況，對疑似感染PCV2組織樣品的全基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆和測序，并進(jìn)行序列比對與遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明，測序的5株P(guān)CV2基因組3株全長為1 766 bp，2株全長為1 767 bp，5株P(guān)CV2核苷酸序列同源性在96.1%～99.5%之間，與GenBank國內(nèi)外已發(fā)表的17株P(guān)CV2基因核苷酸序列同源性在94.5%～99.7%之間；遺傳進(jìn)化樹顯示，3株屬于新出現(xiàn)的PCV2d亞型毒株，2株屬于國內(nèi)優(yōu)勢流行的PCV2b亞型毒株。

豬圓環(huán)病毒2型；遺傳變異；分析

豬圓環(huán)病毒病是由豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）引起的豬的一種傳染病，可引起一系列相關(guān)的臨診病癥，其中包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、皮炎腎病綜合征、母豬繁殖障礙等，還可能與增生性腸炎、壞死性間質(zhì)性肺炎、仔豬先天性震顫等有關(guān)[1]。其臨床表現(xiàn)多種多樣，主要特征為體質(zhì)下降、消瘦、貧血、黃疸、生長發(fā)育不良、腹瀉、呼吸困難、母豬繁殖障礙、內(nèi)臟器官及皮膚的廣泛病理變化，特別是腎臟、脾臟及全身淋巴結(jié)的高度腫大、出血和壞死。PCV2主要侵害機(jī)體的免疫系統(tǒng)，該病可導(dǎo)致豬群產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫抑制，從而容易繼發(fā)或并發(fā)其他疾病[2]。自1997年加拿大首次報道以來，該病已遍及世界各養(yǎng)豬國家和地區(qū)[3]。我國于1999年首次發(fā)現(xiàn)，目前該病已在我國豬群中廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失，并引起了高度關(guān)注[4-5]。

PCV2為圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬成員，病毒粒子為二十面體對稱結(jié)構(gòu)，含有單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA，基因組全長為1 767 bp或1 768 bp，含有11個閱讀框[6-7]。而近年來不斷有PVC2基因組為1 766 bp新毒株的文獻(xiàn)報道[7-8]，該病毒的基因組不斷地發(fā)生變異，造成的危害日益嚴(yán)重[9]。鑒于此，本文通過對烏魯木齊市PCV2流行毒株的全基因組序列進(jìn)行測序，并跟國內(nèi)外代表毒株進(jìn)行比對分析，對流行毒株的變異規(guī)律和分子流行病學(xué)特征進(jìn)行探究和分析，以期為本地區(qū)PCV2防治提供必要的分子流行病學(xué)信息。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2016年3月15日至4月20日在新疆烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心進(jìn)行。

1.2 病料樣品

疑似感染PCV2豬的肺臟、淋巴結(jié)、扁桃體等組織病料。

1.3 主要試劑

病毒核酸純化試劑盒、Premix Taq（TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye）購自TaKaRa公司。

1.4 引物設(shè)計

上游引物：5'-CCCGTTGGAATGGTACTCCTCAA CTG-3'；下游引物：5'-CGGGGTCTGATTGCTGGTAA TCAGAAT-3'。預(yù)計擴(kuò)增目的片段大小1766~1768bp。

1.5 全基因組的擴(kuò)增與測序

按照病毒核酸純化試劑盒說明書提取PCV2陽性樣品的DNA。按照Premix Taq說明書對提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系50 μL：Premix Taq 25 μL；上下游Primer（25 μmol/L）各1 μL；Template DNA 2 μL；RNase Free ddH2O添加至50 μL。反應(yīng)程序為：94℃30 s、56℃30 s、72℃2 min，32個循環(huán)；72℃10 min，取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，并選擇符合目的條帶大小、條帶單一且明亮的PCR陽性產(chǎn)物送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。

1.6 基因序列遺傳進(jìn)化分析

應(yīng)用生物學(xué)分析軟件GenBank Blast和DNAStar對擴(kuò)增的核苷酸序列與GenBank中登錄的PCV2全基因序列進(jìn)行同源性比較，利用Mega 5.0軟件，NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（boot strap值為1 000循環(huán)）。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增結(jié)果

用RT-PCR法從9份疑似感染PCV2的樣品中擴(kuò)增出7份與預(yù)期片段大小相符的特異性片段，2份可疑樣品，擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

圖1 PCV2全基因PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果

2.2 目的基因的序列測定結(jié)果

送出測序的5株P(guān)CV2樣品3株基因組全長1 766 bp，2株1 767 bp，登錄NCBI利用Blast對測序結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果表明，擴(kuò)增得到的5條序列為PCV2基因序列，分別命名為WLMQ-1株（1 766 bp）、WLMQ-2株（1 767 bp）、WLMQ-3株（1 767 bp）、WLMQ-4株（1 766 bp）、WLMQ-5株（1 766 bp）。

2.3 PCV2全基因組核苷酸同源性對比分析

5株P(guān)CV2全基因組核苷酸序列之間的同源性為96.1%～99.5%；與1010 PCV2a Canada、DBNSX07、DK1980 PCV-2cDenmark、PCV2 LG、PCV2 WuHan、PCV2-09CQ、PCV2-09HeN、PCV2-09HLJ、PCV2-HB、PCV2-QD、PCV2-SC、PCV2-SD、PCV2-SH、PCV2-SHZ、PCV2-SZ、PCV2b France、TJ PCV2d毒株核苷酸序列同源性分別為95.3%～96.2%、96.0%～99.5%、94.7%～95.4%、95.5%～95.8%、95.5%～95.8%、96.2%～99.7%、96.5%～98.8%、95.8%～99.4%、96.2%～99.2%、95.9%～99.5%、94.5%～95.5%、96.3%～98.0%、95.8%～99.4%、95.9%～99.5%、95.1%～95.8%、96.2%～99.7%、96.8%～98.4%。具體比對結(jié)果見圖2。

圖2 PCV2分離株全基因組核苷酸同源性比較

2.4 PCV2全基因序列遺傳進(jìn)化關(guān)系

將5株P(guān)CV2全基因序列與國內(nèi)外已登錄的17株P(guān)CV2全基因序列構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹（圖3），結(jié)果顯示，WLMQ-1、WLMQ-5分離株與PCV2-09CQ、 PCV2-SHZ、TJ PCV2d同屬于PCV2d亞型；WLMQ-2、WLMQ-3與PCV2b France、DBN-SX07同屬于PCV2b亞型；5株分離株與PCV2a亞型親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與PCV2c亞型親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖3 PCV2全基因序列遺傳進(jìn)化關(guān)系

3 討論

PCV是迄今發(fā)現(xiàn)的一種最小的動物病毒[10]。目前已知的PCV有2個血清型，即PCV1和PCV2[11]。PCV1沒有致病性，PCV2具有致病性。PCV2全基因組存在1 767 bp或1 768 bp兩種不同的長度。本研究測序的5株毒株中3株序列長度為1 766 bp，屬于變異毒株，提示該地區(qū)PCV2在分子水平上已經(jīng)出現(xiàn)了的變異。這也在分子水平上闡明了在烏魯木齊地區(qū)PCV2流行毒株的復(fù)雜性和多樣性，而導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能與近年來新疆大力發(fā)展養(yǎng)豬業(yè)而從不同地區(qū)引進(jìn)了隱性感染PCV2的種豬有一定關(guān)系。

最新的研究結(jié)果把PCV2分為了PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e等5種基因型亞群[12-13]，國內(nèi)外PCV2分子流行病學(xué)的分析結(jié)果表明，PCV2基因型發(fā)生了由PCV2a到PCV2b的轉(zhuǎn)換，我國PCV2存在的基因型有PCV2a、PCV2b、PCV2d，以PCV2b流行毒株為主，是造成PCV2流行的主要病因[7，14]。全基因組核苷酸同源性比較發(fā)現(xiàn)，5株烏魯木齊PCV2分離株核苷酸序列同源性在96.1%～99.5%之間，與國內(nèi)外已發(fā)表的17株P(guān)CV2基因核苷酸序列同源性也在94.5%～99.7%之間。從本次遺傳進(jìn)化樹可以看出，烏魯木齊地區(qū)的PCV2基因型3株為PCV2d亞型，2株為PCV2b亞型，據(jù)此推測烏魯木齊地區(qū)PCV2的流行株情況可能與全國流行情況存在一定差異，PCV2d亞型可能逐步成為該地區(qū)PCV2流行毒株的優(yōu)勢基因型，這給本地區(qū)PCV2感染的防控帶來了難度，應(yīng)引起足夠的重視。另外，遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，烏魯木齊地區(qū)正在使用的疫苗株DBN-SX07屬于PVC2b亞型，只與5株病毒中的2株處在同一分支上，說明目前使用的疫苗可能與流行的毒株不是最佳匹配，其疫苗效果可能不是十分理想，需尋求更加合適的疫苗。

[1]Allan G M,McNeilly F,Kennedy S,et al.J Vet Diagn Invest[J], 1998,10(1):3-10.

[2]陳溥言，王川慶，劉秀梵，等.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].第5版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013：231-234.

[3]Allan G M,Ellis J A.J Vet Diagn Invest[J],2000,12(1):3-14.

[4]郎洪武，張廣川，吳發(fā)權(quán)，等.中國獸醫(yī)科技[J]，2000，30（3）：3-5.

[5]于周，李俊，程凱慧，等.中國獸醫(yī)雜志[J]，2009，45（1）：19-20.

[6]Mankertz A,Persson F,Mankertz J,et al.Virol[J],1997,71(3): 2562-2566.

[7]Ge X,Wang F,Guo X,et al.Virus Res[J],2012,164(1-2):100-106.

[8]郭龍軍，陸月華，危艷武，等.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報[J]，2009，31（11）：856-859.

[9]Segalés J,Allan G M,Domingo M.Anim Health Res Rev[J],2005, 6(2):119-142.

[10]Hamel A L,Lin L L,Nayar G P S.J Virol[J],1998,72(6): 5262-5267.

[11]Meehan B M,McNeilly F,Todd D,et al.J Gen Virol[J],1998, 79(9):2171-2179.

[12]Segalés J,Olvera A,Grau-Roma L,et al.Vet Rec[J],2008, 162(26):867-868.

[13]Wang F,Guo X,Ge X,et al.VirusRes[J],2009,145(1):151-156.

[14]LiW,WangX,MaT,etal.Virus Genes[J],2010,40(2):244-251.

（編輯：富春妮）

S858.282.65+9.2

A

1002-1957(2016)05-0097-03

2016-08-04

新疆維吾爾自治區(qū)科技廳科技援疆項目（201491165）；烏魯木齊市科技局應(yīng)用開發(fā)研究計劃（Y141210013）

蔡擴(kuò)軍（1985-），男，河南虞城人，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動物疫病診療工作.E-mail:caikuojun@163.com

李愛巧（1966-），女，農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣研究員，主要從事動物疫病防控工作.E-mail:laq4616369@126.com