劉鴿，張培生，于會(huì)舉，張倩，屈勇剛

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子832003）

北疆地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)豬圓環(huán)病毒2型免疫抗體水平檢測(cè)與分析

劉鴿，張培生，于會(huì)舉，張倩，屈勇剛

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子832003）

為了解新疆北疆地區(qū)2014年1月至2016年4月期間的豬場(chǎng)豬圓環(huán)病毒2型免疫抗體水平及PCV2野毒感染情況，試驗(yàn)從北疆地區(qū)的18個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)中采集血樣984份，檢出免疫抗體陽(yáng)性個(gè)體902份，占91.67%。18個(gè)試驗(yàn)豬場(chǎng)中有11個(gè)豬場(chǎng)的抗體陽(yáng)性率在90%以上，占61.11%，免疫抗體陽(yáng)性率超過(guò)85%的豬場(chǎng)有17個(gè)；種公豬的抗體陽(yáng)性率最高，為98.78%。研究結(jié)果表明：北疆地區(qū)的豬圓環(huán)病毒2型免疫抗體陽(yáng)性率較高，整體免疫水平較好，但也存在豬圓環(huán)病毒2型野毒感染或免疫失敗的情況；0～30 d仔豬的免疫抗體陽(yáng)性率雖然較高，但有隨日齡增大而免疫水平下降的趨勢(shì)。希望試驗(yàn)研究成果在一定程度上對(duì)養(yǎng)豬企業(yè)的生產(chǎn)工作有所幫助。

PCV2；ELISA；抗體水平；陽(yáng)性率

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus,PCV）是引起豬圓環(huán)病毒病的病原。PCV屬圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬的單股負(fù)鏈DNA病毒，該病毒是目前發(fā)現(xiàn)的動(dòng)物病毒中最小的一種。據(jù)抗原性和基因組成的不同，PCV可以分為兩個(gè)血清型：PCV1、PCV2，兩個(gè)血清型PCV均在豬群中存在，但只有PCV2具有致病性[1-2]。豬群被PCV2感染后，不但引起豬圓環(huán)病毒病，還可引起免疫抑制，造成其他豬病的繼發(fā)感染[3]，引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、肺炎、母豬繁殖障礙、肥育豬皮炎腎病綜合征等[4]。豬圓環(huán)病毒病最早在20世紀(jì)90年代初發(fā)現(xiàn)于加拿大，1996年在歐洲一些國(guó)家暴發(fā)，現(xiàn)在在世界上普遍流行。目前，我國(guó)各地豬場(chǎng)感染PCV2情況十分普遍，有的可高達(dá)96%[5]。隨著養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的不斷擴(kuò)大，對(duì)PCV2的研究越來(lái)越受到人們的重視[6]。PCV抗體在豬群中普遍存在，采用豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測(cè)試劑盒可快速、準(zhǔn)確地對(duì)豬群進(jìn)行檢測(cè)。

新疆養(yǎng)豬事業(yè)在近幾年有了飛速發(fā)展，規(guī)?；?、集約化程度越來(lái)越高，尤其是從2015年下半年開(kāi)始。北疆地區(qū)養(yǎng)豬量占全疆的絕大部分，因此研究北疆豬病情況對(duì)全疆有較為準(zhǔn)確的參考作用。在2014年1月至2016年4月期間，本試驗(yàn)研究從北疆地區(qū)（巴州、克拉瑪依、沙灣、石河子、瑪納斯、奇臺(tái)等不同區(qū)域）的18個(gè)現(xiàn)代規(guī)模豬場(chǎng)采樣，進(jìn)行豬圓環(huán)病毒2型免疫抗體檢測(cè)并做出分析，希望對(duì)各養(yǎng)豬企業(yè)的生產(chǎn)工作有所幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品來(lái)源2014年1月至2016年4月期間，從新疆北疆地區(qū)（巴州、克拉瑪依、沙灣、石河子、瑪納斯、奇臺(tái)等不同區(qū)域）的18個(gè)現(xiàn)代規(guī)模豬場(chǎng)采集984份血樣，其中包括不同類型豬群（0～30 d仔豬、后備母豬、經(jīng)產(chǎn)母豬、種公豬）。

1.1.2 試驗(yàn)所需材料和必備儀器豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測(cè)試劑盒（武漢科前生物，20130101）、自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek）、一次性獸用采血器（5 mL）、微量移液器（Eppendorf公司）、恒溫培養(yǎng)箱、平板震蕩儀等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 采集試驗(yàn)樣品方法試驗(yàn)樣品采集過(guò)程保證規(guī)范性操作。用5 mL一次性獸用采血器從豬的前腔靜脈一次性采血3～4 mL/頭，室溫靜置，析出血清，收納于放有冰袋的保溫箱或采樣箱中，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析。從每份血樣中吸取1 mL血清于已經(jīng)滅菌處理的EP管（1.5 mL）中，做到逐管準(zhǔn)確標(biāo)記，在適當(dāng)規(guī)程的離心機(jī)中離心（合適的離心條件：4 000 r/min，時(shí)間為8~10 min），放到-20℃冰箱中保存?zhèn)溆没蚣纯虣z測(cè)。也要盡快對(duì)放到冰箱中的待檢血清進(jìn)行檢測(cè)，以防較長(zhǎng)的時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成大的影響。

1.2.2 豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測(cè)方法將濃縮的洗滌液恢復(fù)到室溫，搖動(dòng)（目的是使沉淀的鹽溶解），作20倍稀釋（稀釋好的洗滌液可在2~8℃存放7 d）。待檢血清按1∶40的體積稀釋，對(duì)照血清按1∶4的體積稀釋。用洗滌液對(duì)需要用到的抗原包被板微孔洗滌2次后，分別取稀釋好的100 μL待檢血清和對(duì)照血清加于對(duì)應(yīng)抗原包被板微孔中。要求陰、陽(yáng)對(duì)照各設(shè)兩孔，每個(gè)待檢樣各設(shè)一孔。搖勻，經(jīng)37℃恒溫箱中溫育30 min，洗滌5次。移取100 μL酶標(biāo)二抗于各孔中，再次在37℃中孵育30 min后，再次洗滌5次。接下來(lái)，分別在每個(gè)孔中各加50 μL底物A和50 μL底物B，在室溫條件下避光10 min后，在每孔中加50 μL終止液。在10 min之內(nèi)測(cè)OD630nm值（測(cè)定前在平板震蕩器上輕輕震蕩一下）。

1.2.3 試驗(yàn)結(jié)果判定用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的OD630nm值。本試驗(yàn)成立必須滿足的條件是：陽(yáng)性對(duì)照孔的平均OD630nm值≥0.7，陰性對(duì)照孔的平均OD630nm值＜0.3。

待測(cè)樣品OD630nm值＞0.42，則該血清判為陽(yáng)性；若0.42≥OD630nm值≥0.38，則該血清樣品被判為可疑；待檢血清OD630nm值＜0.38，則判為陰性。

1.2.4 試驗(yàn)結(jié)果分析用統(tǒng)計(jì)分析中最為常見(jiàn)的SPSS軟件、Excel軟件對(duì)本試驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行準(zhǔn)確的統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算PCV2抗體陽(yáng)性率、可疑率、陰性率，陽(yáng)性個(gè)體的平均OD630nm值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 試驗(yàn)豬場(chǎng)的豬圓環(huán)病毒2型免疫抗體陽(yáng)性率、可疑率、陰性率

豬場(chǎng)編號(hào)A~R分別代表18個(gè)現(xiàn)代規(guī)模豬場(chǎng)。試驗(yàn)采集的984份血清樣品中檢出豬圓環(huán)病毒2型免疫陽(yáng)性抗體的有902份，其陽(yáng)性率為91.67%。統(tǒng)計(jì)18個(gè)試驗(yàn)豬場(chǎng)的試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性率最高的為96.48%，陽(yáng)性率最低的為84.21%；陽(yáng)性率超過(guò)90%的豬場(chǎng)有11個(gè)，占試驗(yàn)豬場(chǎng)的61.11%；陽(yáng)性率超過(guò)85%的豬場(chǎng)有17個(gè)（也就是說(shuō)，18個(gè)豬場(chǎng)中只有1個(gè)豬場(chǎng)的抗體陽(yáng)性率低于85%），占試驗(yàn)豬場(chǎng)的94.44%，但所有試驗(yàn)豬場(chǎng)的抗體陽(yáng)性率均在84%以上；984份血清樣品中檢出6份可疑血清樣品，占所有試驗(yàn)血清樣品的0.61%；檢出抗體陰性的血清樣品有76份。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 免疫抗體陽(yáng)性個(gè)體的平均OD630nm值

18個(gè)試驗(yàn)豬場(chǎng)中，檢出豬圓環(huán)病毒2型免疫抗體陽(yáng)性個(gè)體的平均OD630nm值均在0.700以上；平均OD630nm值在0.85以上的有15個(gè)豬場(chǎng)，占所有試驗(yàn)豬場(chǎng)的83.33%；平均OD630nm值在0.95以上的有11個(gè)豬場(chǎng)，占試驗(yàn)豬場(chǎng)的61.11%；有5個(gè)豬場(chǎng)的豬圓環(huán)病毒2型免疫抗體陽(yáng)性個(gè)體的平均OD630nm值大于1.000。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 試驗(yàn)豬場(chǎng)豬圓環(huán)病毒2型免疫抗體ELISA檢測(cè)結(jié)果

表2 試驗(yàn)豬場(chǎng)豬圓環(huán)病毒2型免疫抗體陽(yáng)性個(gè)體的OD630nm值

2.3 北疆地區(qū)試驗(yàn)豬場(chǎng)不同類別豬群的豬圓環(huán)病毒2型免疫抗體水平

統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，984份試驗(yàn)樣品中檢出902份豬圓環(huán)病毒2型免疫抗體陽(yáng)性血清樣品，陽(yáng)性率為91.67%；0～30 d仔豬、后備母豬、經(jīng)產(chǎn)母豬、種公豬的抗體陽(yáng)性個(gè)體數(shù)分別為258、239、324、81份，而其免疫抗體陽(yáng)性率依次為95.56%、80.74%、96.43%、98.78%。從統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，豬群結(jié)構(gòu)中抗體陽(yáng)性率最高的為98.78%，是種公豬；最低的為后備母豬，免疫抗體陽(yáng)性率為80.74%，但免疫抗體陽(yáng)性率都高于80%；4種豬群結(jié)構(gòu)中抗體陽(yáng)性率大于95.00%的有3種，占總豬群結(jié)構(gòu)的75%。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同類別豬群抗體陽(yáng)性率

2.4 試驗(yàn)豬場(chǎng)所有0～30 d仔豬豬圓環(huán)病毒2型免疫抗體陽(yáng)性率

試驗(yàn)采集的270份0～30 d仔豬血樣中，有258份呈免疫抗體陽(yáng)性，陽(yáng)性率為95.56%。其中，0～10 d、11～20 d、21～30 d仔豬樣品數(shù)均為90份，其陽(yáng)性數(shù)依次為89、86、83份，對(duì)應(yīng)的抗體陽(yáng)性率依次為98.89%、95.56%、92.22%?？梢园l(fā)現(xiàn)，0～10 d仔豬的抗體陽(yáng)性率最高，為98.89%；21～30 d仔豬抗體陽(yáng)性率最低，為92.22%；0～30 d仔豬的抗體陽(yáng)性率隨日齡增長(zhǎng)有下降趨勢(shì)，但抗體陽(yáng)性率均高于92.00%。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 0～30 d仔豬豬圓環(huán)病毒2型免疫抗體陽(yáng)性率

3 討論

3.1 北疆試驗(yàn)豬群的豬圓環(huán)病毒2型免疫抗體水平較高

使用豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)984份血清樣品，發(fā)現(xiàn)有902份呈陽(yáng)性，免疫抗體陽(yáng)性率為91.67%，其有較高的整體免疫水平，高于河南、湖南一些地區(qū)的免疫抗體水平[7-8]。試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，18個(gè)豬場(chǎng)中有11個(gè)豬場(chǎng)的抗體陽(yáng)性率在90%以上，占61.11%，也就是超過(guò)一半豬場(chǎng)的抗體水平較高；抗體陽(yáng)性率最低的豬場(chǎng)為84.21%，也在84%以上；免疫抗體陽(yáng)性率超過(guò)85%的豬場(chǎng)有17個(gè)。984份血清中發(fā)現(xiàn)6份可疑血清，可疑率為0.61%，不足1%，處于較低水平，需對(duì)這些血清重復(fù)檢測(cè)，以確定其準(zhǔn)確的陰、陽(yáng)性。檢出15個(gè)豬場(chǎng)豬圓環(huán)病毒2型免疫抗體陽(yáng)性個(gè)體的平均OD630nm值在0.85以上，5個(gè)豬場(chǎng)的平均OD630nm值大于1.000。檢出76份陰性血清，陰性率為7.72%，不足10%，且每個(gè)試驗(yàn)豬場(chǎng)均檢出豬圓環(huán)病毒2型免疫抗體陰性個(gè)體。這就說(shuō)明：北疆地區(qū)的豬圓環(huán)病毒2型免疫抗體陽(yáng)性率較高，整體免疫水平較好，但也存在豬圓環(huán)病毒2型野毒感染或免疫失敗的情況，應(yīng)加強(qiáng)防控措施。

3.2 試驗(yàn)豬場(chǎng)的不同類別豬群間存在差異

統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0～30 d仔豬、后備母豬、經(jīng)產(chǎn)母豬、種公豬的不同類別豬群中豬圓環(huán)病毒2型免疫抗體水平存在差異，種公豬的抗體陽(yáng)性率最高，為98.78%；其次為經(jīng)產(chǎn)母豬，為96.43%；后備母豬的抗體陽(yáng)性率僅為80.74%，也低于0～30 d仔豬的抗體陽(yáng)性率（95.56%）。4種豬群結(jié)構(gòu)中有3/4的豬群免疫抗體陽(yáng)性率大于95.00%。研究0～30 d仔豬豬圓環(huán)病毒2型免疫抗體陽(yáng)性率發(fā)現(xiàn)：0～10 d仔豬的免疫抗體陽(yáng)性率最高，為98.89%；其次為11～20 d仔豬，為95.56%；21～30 d仔豬的抗體陽(yáng)性率最低，為92.22%。不難發(fā)現(xiàn)：0～30 d仔豬的免疫抗體陽(yáng)性率雖然較高，但有隨日齡增大而免疫水平下降的趨勢(shì)，可能與母源抗體有一定關(guān)系。

3.3 加強(qiáng)豬群管理，把好疾病預(yù)防關(guān)

本試驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，北疆地區(qū)的豬圓環(huán)病毒2型免疫抗體水平較高，但鑒于PCV2在國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)流行較廣，建議采取及時(shí)有效的免疫預(yù)防工作，搞好豬場(chǎng)的環(huán)境消毒工作，防患于未然[9]。對(duì)種公豬和繁殖母豬做到全免，根據(jù)各豬場(chǎng)自身特點(diǎn)，在適當(dāng)時(shí)間對(duì)仔豬進(jìn)行免疫接種，應(yīng)科學(xué)積極地調(diào)整本豬場(chǎng)的免疫程序[10]。

[1]Allan G M,McNeilly F,Cassidy J P,et al.Pathogenesis of porcine circovirus:experimental infections of colostrum deprived piglets and examination of pig foetal material[J].Vet Microbiol,1995,44:49-64.

[2]Tischer I,Mields W.Studies on epidemiology and pathogenicity of porcine circovirus[J].Arch Virol,1986,91:271-276.

[3]Dupout K,Nielsens O,Baekbo P,et al.Genomic analysis of PCV2 isolates from Danish archives and a current PMWS case-control supports a shift in genotypes with time[J].Vet Micrbiol,2008,128:56-64.

[4]陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].第5版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006：231-233.

[5]甘孟侯，楊漢春.中國(guó)豬病學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2005：440-461.

[6]郭春艷，葛俊偉，李一經(jīng).豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的原核表達(dá)[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009（6）：79-84.

[7]胡慧，王亞賓，陳麗穎，等.河南地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型感染的血清流行病學(xué)調(diào)查[J].畜牧與獸醫(yī)，2010（10）：71-74.

[8]盧寄軍，王祝榮，張進(jìn).湖南省豬圓環(huán)病毒2型流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2012（2）：42-43.

[9]韓雪，蔡林，倪建強(qiáng).2009年我國(guó)豬群中豬圓環(huán)病毒2型感染情況調(diào)查[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012（32）：941-944.

[10]孟紀(jì)萍，王建梅，武曉虎，等.豬圓環(huán)病毒2型和豬瘟病毒抗體檢測(cè)與分析[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2012（29）：39-40.

（編輯：郭玉翠）

S858.285.3

A

1002-1957(2016)05-0105-03

2016-05-24

新疆石河子市農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目（2013NY04）

劉鴿（1986-），男，山東淄博人，在讀碩士研究生，主要從事動(dòng)物傳染病診斷與防治工作.E-mail：1539881644@qq.com

屈勇剛（1971-），男，陜西渭南人，副教授，主要從事動(dòng)物傳染病診斷與防治工作.E-mail：quyonggang@shzu.edu.cn