劉天紅，李紅艷，吳志宏，李 曉，孫元芹，盧 珺，姜曉東，王 穎

( 山東省海洋生物研究院，山東 青島 266100 )

響應(yīng)面法優(yōu)化羅氏海盤車生殖腺皂甙脫除技術(shù)研究

劉天紅，李紅艷，吳志宏，李 曉，孫元芹，盧 珺，姜曉東，王 穎

( 山東省海洋生物研究院，山東 青島 266100 )

利用紫外分光光度計(jì)全掃描模式確認(rèn)羅氏海盤車生殖腺皂甙檢測(cè)波長(zhǎng)，利用響應(yīng)面法對(duì)生殖腺皂甙脫除條件進(jìn)行優(yōu)化。利用響應(yīng)面Box-Bohnken法優(yōu)化生殖腺皂甙脫除條件，各條件取整數(shù)，超聲時(shí)間13 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)4.5%、脫除次數(shù)2，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，殘?jiān)性磉捌骄繛?.094 mg/g，與模型預(yù)測(cè)值接近，與處理前0.325 mg/g對(duì)比，脫除率達(dá)72.3%，說明海盤車生殖腺皂甙脫除模型建立成功。

海星生殖腺;皂甙脫除;超聲波脫除

羅氏海盤車(Asteriasrollestoni)，屬棘皮動(dòng)物門、海星綱、鉗棘目、海盤車科[1]。我國(guó)沿海有100多種，黃、渤海常見種類有多棘海盤車(A.amurensis)、羅氏海盤車、陶氏太陽(yáng)海星(Solasterdawsoni)等[2-3]。海星為肉食性動(dòng)物，繁殖能力和再生能力很強(qiáng)，喜愛吞食各種軟體動(dòng)物、棘皮動(dòng)物等，對(duì)沿海扇貝、牡蠣、貽貝、鮑魚等貝類養(yǎng)殖業(yè)具有較大危害[4]。海星的生殖腺味道鮮美，但含有皂甙[5-6]，限制其多途徑的高效利用及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。王兵等[7]從南海海星(Craspidastethesperus)中分離提取了總皂苷，并進(jìn)行抗腫瘤活性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)海星總皂苷能明顯抑制小鼠生肉瘤S180的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)H22腹水小鼠的生存時(shí)間，說明海星總皂苷具有顯著的抗腫瘤活性，可望用于惡性腫瘤的治療;郭承華等[8-10]研究了羅氏海盤車的皂甙制備方法，對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行其組織中海星皂甙分布及活性的研究；文震等[11-12]對(duì)不同方法制備的海星皂甙進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)，考察超臨界CO2萃取、乙醇萃取兩種方法制備的南海產(chǎn)多棘海星皂甙的溶血過程，采用分光光度法測(cè)定溶血指數(shù)，結(jié)合紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，評(píng)價(jià)其細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示，兩種方法制備的海星皂甙均具有明顯溶血作用，超臨界CO2萃取、溶劑萃取的海星皂甙溶血指數(shù)分別為19 231、12 821，超臨界CO2萃取的海星皂甙保持了更強(qiáng)的細(xì)胞毒性，這為海星皂甙制備工藝的選擇，探索其物質(zhì)基礎(chǔ)提供了參考依據(jù)。筆者利用響應(yīng)面法優(yōu)化羅氏海盤車生殖腺皂甙脫除條件，以期為羅氏海盤車變廢為寶、變害為利，提供有效的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)人參皂甙標(biāo)準(zhǔn)品Rg1：CAS號(hào),41753-43-9，純度≥98%，分子量1109.29；(2)羅氏海盤車:2013年5月采自青島八大峽海域，取其生殖腺；(3)醫(yī)用酒精；(4)甲醇A.R.級(jí)；(5)UV2450 紫外分光光度計(jì)(島津公司)。

由于羅氏海盤車生殖腺脫毒后，需應(yīng)用于食品和飼料開發(fā)，故脫毒劑不能采用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或其他有機(jī)試劑，使用超聲提取與乙醇提取相結(jié)合的脫除方式。

1.2 羅氏海盤車皂甙標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

1.2.1 皂甙溶液配制

稱取適量人參皂甙和自制羅氏海盤車粗皂甙粉末(1.2.4)分別溶于甲醇中，制得質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的人參皂甙溶液和羅氏海盤車皂甙溶液。

1.2.2 人參皂甙與羅氏海盤車皂甙溶液全掃描對(duì)比

分別取1 mL人參皂甙溶液和羅氏海盤車皂甙溶液放入10 mL比色管揮干試劑，加入2 mL濃硫酸，迅速置于60 ℃水浴60 min，流水冷卻后定容至10 mL，UV2450全掃描。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別移取0、0.1、0.3、0.5、0.7、1 mL皂甙溶液至10 mL比色管揮干試劑，加2 mL濃硫酸，迅速置于60 ℃水浴60 min，流水冷卻后定容至10 mL，波長(zhǎng)282 nm處測(cè)吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)線。

1.2.4 皂甙提取檢測(cè)

參考文獻(xiàn)[9，13]的檢測(cè)方法，將全部生殖腺加入300 mL的85%的乙醇超聲10 min，抽濾后保留濾液，濾渣重復(fù)上述過程2次，合并濾液，減壓濃縮至50 mL，加入等體積的蒸餾水，加入3倍體積的石油醚脫脂，用水飽和正丁醇對(duì)水層萃取，減壓濃縮得皂甙浸膏，凍干得到粗皂甙粉末，制成羅氏海盤車皂甙溶液，在波長(zhǎng)282 nm下檢測(cè)吸光值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線折算為皂甙含量。

1.2.5 不同處理?xiàng)l件對(duì)羅氏海盤車皂甙脫除的影響

(1)超聲波時(shí)間對(duì)羅氏海盤車皂甙脫除的影響

取新鮮羅氏海盤車生殖腺，加入300 mL體積分?jǐn)?shù)為 3%的乙醇分別超聲5、10、15、20 min，抽濾后保留濾渣，濾渣重復(fù)上述過程2次，留取濾渣按1.2.4檢測(cè)皂甙。

(2)乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)羅氏海盤車生殖腺皂甙脫除的影響

取羅氏海盤車生殖腺，分別加入300 mL體積分?jǐn)?shù)為 1%、3%、5%、7%的乙醇，超聲10 min，抽濾后保留濾渣，濾渣重復(fù)上述過程2次，留取濾渣按1.2.4進(jìn)行檢測(cè)皂甙。

(3)抽提次數(shù)對(duì)羅氏海盤車生殖腺皂甙脫除的影響

取羅氏海盤車生殖腺，加入300 mL體積分?jǐn)?shù)為 3%的乙醇，超聲10 min，抽濾后保留濾渣，濾渣重復(fù)上述過程2次、3次、5次，留取濾渣按1.2.4進(jìn)行檢測(cè)皂甙。

1.2.6響應(yīng)面法優(yōu)化羅氏海盤車生殖腺皂甙脫除條件

選擇超聲波時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、抽提次數(shù)作為影響羅氏海盤車生殖腺皂甙脫除主要因素，按照響應(yīng)面法設(shè)計(jì)，每個(gè)因素取3個(gè)水平，以殘?jiān)性磉暗暮繛轫憫?yīng)值，利用響應(yīng)面經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，建立最?yōu)脫除條件。試驗(yàn)水平和因素設(shè)計(jì)見表1。

圖1 人參皂甙標(biāo)準(zhǔn)品Rg全掃描圖譜

圖2 羅氏海盤車皂甙全掃描圖譜

圖3 人參皂甙標(biāo)準(zhǔn)品Rg和羅氏海盤車皂甙全掃描圖譜重疊圖

2 結(jié)果與分析

2.1 人參皂甙和羅氏海盤車粗皂甙全波長(zhǎng)掃描

人參皂甙Rg和羅氏海盤車皂甙分別在波長(zhǎng)283 nm處有響應(yīng)值，并且二者均為濃硫酸水浴法，與文獻(xiàn)[13]海星皂甙在波長(zhǎng)282 nm處有響應(yīng)值較為接近，故選定282 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)(圖1～圖3)。利用人參皂甙作為標(biāo)準(zhǔn)品，按照皂甙提取檢測(cè)方法測(cè)得新鮮羅氏海盤車生殖腺粗皂甙含量為0.325 mg/g(圖1～圖3)。

2.2 單因素對(duì)羅氏海盤車皂甙脫除的影響

羅氏海盤車生殖腺脫除殘?jiān)械脑磉昂侩S著超聲波時(shí)間的延長(zhǎng)、乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加、提取次數(shù)的增加而降低(圖4)；超聲波時(shí)間對(duì)殘?jiān)性磉昂坑绊憳O其顯著(P<0.001)，乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取次數(shù)對(duì)殘?jiān)性磉昂坑绊戯@著(P<0.05)(圖5)；乙醇體積分?jǐn)?shù)越高和提取次數(shù)越多，脫除效果越好，但在實(shí)際研究中，考慮到時(shí)間和成本問題，故在響應(yīng)面優(yōu)化時(shí)各條件見表1。

圖4 超聲波時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取次數(shù)對(duì)海星生殖腺皂甙脫除效果的影響

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化羅氏海盤車生殖腺皂甙脫除條件

用Design Expert 8.0優(yōu)化乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲波時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)羅氏海盤車皂甙脫除的影響，按照響應(yīng)面設(shè)計(jì)法每個(gè)因素取3個(gè)水平，以殘?jiān)泻Ｐ窃磉昂繛轫憫?yīng)值，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并建立二次響應(yīng)面經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，確定羅氏海盤車皂甙最佳脫除條件(圖5)。試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲波時(shí)間與提取次數(shù)的響應(yīng)面

運(yùn)行編號(hào)A:超聲時(shí)間/minB:乙醇體積分?jǐn)?shù)/%C:抽提次數(shù)皂甙含量/mg·g-115.003.002.000.293210.001.004.000.218310.003.003.000.075410.005.002.000.068510.003.003.000.063610.003.003.000.077715.003.004.000.052815.003.002.000.103910.003.003.000.087105.003.004.000.2661115.001.003.000.2471210.005.004.000.0811315.005.003.000.0841410.001.002.000.218155.001.003.000.3131610.003.003.000.080175.005.003.000.290

2.4 方差分析

利用軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，對(duì)表1的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析后得到模型的二次多元回歸方程為：

皂甙含量=0.060-0.093×A-0.072×B-0.017×C-0.047×A×B-0.011×A× C-9.250E-003×B×C+0.10×A2+0.060×B2+0.013×C2

表2 方差分析

通過Design Expert 8.0軟件對(duì)回歸方程求解，在試驗(yàn)的因素水平范圍內(nèi)預(yù)測(cè)羅氏海盤車皂甙最佳脫除條件為：超聲時(shí)間13.31 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)4.41%、脫除次數(shù)2.30，殘?jiān)性磉昂?.080 mg/g。在此條件下，各條件取整數(shù)，超聲時(shí)間13 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)4.5%、脫除次數(shù)2次，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，殘?jiān)性磉捌骄禐?.094 mg/g，與模型預(yù)測(cè)值接近，與處理前0.325 mg/g對(duì)比，脫除率達(dá)72.3%，說明羅氏海盤車皂甙脫除模型建立成功。

3 討 論

3.1 濃硫酸水浴法測(cè)定不同來(lái)源的皂甙

文中采用的是人參皂苷Rg1 作為羅氏海盤車皂甙檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品，人參皂甙屬于四環(huán)三萜類化合物, Rg1是原人參三醇型皂苷[14]的一種，該化合物與濃硫酸在一定的溫度下呈現(xiàn)粉色，在λ=283 nm有響應(yīng)值，筆者提取的羅氏海盤車粗皂甙利用濃硫酸水浴法所呈現(xiàn)的現(xiàn)象與人參皂苷Rg1一樣，且在λ=282 nm有響應(yīng)值。已有研究表明海星皂甙是海星主要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，由糖原和苷元兩部分組成[15]，部分苷元屬于四環(huán)三萜類化合物，在濃硫酸和一定溫度下反應(yīng)后，在紫外光下有吸收值。

3.2 脫除劑選擇和脫除效率

郭承華等[9]對(duì)比甲醇和乙醇提取羅氏海盤車總皂甙，產(chǎn)率分別是0.09%和0.11%，由此可見，乙醇的提取效率更高一些；并且利用甲醇為提取劑從羅氏海盤車(煙臺(tái)，3～6月)提取皂甙0.503 mg/g，高于本研究的0.325 mg/g，可能和地域差異引起個(gè)體差異有關(guān)，但甲醇提取可能會(huì)在生殖腺后續(xù)食品加工中有殘留，影響食品品質(zhì)。因本研究最終目的是將羅氏海盤車生殖腺皂甙脫除后用于食品開發(fā)，所以，只能選擇乙醇作為脫除劑。滕瑜等[16]利用淡堿對(duì)海星生殖腺進(jìn)行脫毒，但沒有提及脫除效果。王長(zhǎng)云等[4]利用自配的0.2%～0.3%脫麻辣及脫毒效果溶液對(duì)多棘海盤車生殖腺進(jìn)行脫毒效果較好，認(rèn)為麻辣味已基本消除(綜合評(píng)分由A降為E)，而粗總皂甙含量由0.077%降至0.026%，下降66.23%，與本研究的脫除率72.3%，較為接近，說明本方法有效。

3.3 超聲處理對(duì)羅氏海盤車生殖腺皂甙脫除影響

超聲波能產(chǎn)生強(qiáng)烈振動(dòng)、高的加速度、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、攪拌作用等，造成細(xì)胞膜或細(xì)胞波的破壞，可加速有效成分進(jìn)入溶劑，有利于目標(biāo)成分的提取[17-18]。超聲波處理時(shí)間對(duì)羅氏海盤車生殖腺皂甙脫除影響極其顯著，超聲10 min羅氏海盤車皂甙含量較5 min時(shí)下降約2倍，這與其他學(xué)者研究中將超聲波作為提取有效成分的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化一致[19-21]。

4 結(jié) 論

(1)通過全掃描發(fā)現(xiàn)羅氏海盤車皂甙在波長(zhǎng)為282 nm處有響應(yīng)值，與人參皂甙的響應(yīng)值較接近，可用人參皂甙標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(2)通過Design Expert 8.0軟件對(duì)回歸方程求解，在試驗(yàn)因素水平范圍內(nèi)預(yù)測(cè)羅氏海盤車皂甙最佳脫除條件為：超聲時(shí)間13.31 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)4.41%、脫除次數(shù)2.30，殘?jiān)性磉昂?.080 mg/g。在此條件下，各條件取整數(shù)，超聲時(shí)間13 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)4.5%、脫除次數(shù)2，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，殘?jiān)性磉捌骄禐?.094 mg/g，與模型預(yù)測(cè)值接近，與處理前0.325 mg/g對(duì)比，脫出率達(dá)72.3%，說明響應(yīng)面法優(yōu)化羅氏海盤車生殖腺皂甙脫除模型建立成功。

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OptimizationofRemovalofSaponinsinGonadofStarfishAsteriasrollestonibyResponseSurfaceAnalysis(Box-Bohnken)

LIU Tianhong, LI Hongyan,WU Zhihong, LI Xiao, SUN Yuanqin, LU Jun,JIANG Xiaodong, WANG Ying

( Marine Biology Institute of Shandong Province, Qingdao 266100, China )

A full scan of ultraviolet spectrophotometer was applied to detect gonad saponins of starfishAsteriasrollestoni, and then removal conditions of the saponin were optimized by response surface method. Conditions of utilizing response surface method Box-Bohnken were approximated to integer of ultrasonic time of 13 min, ethanol concentration of 4.5%, and removal times of 2. Three verification experiments under these conditions revealed that there was average saponins content of 0.094 mg/g in residues, approximated to the predicted figure of the model. Contrast to the 0.325 mg/g before, there was a removal ratio of 72.3%, indicating that the model of gonads saponin removal was established in success.

Asteriasrollestonigonad； saponin removal； ultrasonic removal

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.06.006

S985.9

A

1003-1111(2016)06-0639-05

2015-11-18；

2016-02-22.

國(guó)家海洋局資助項(xiàng)目(201205027)；山東省科技廳資助項(xiàng)目(2012GHY11516).

劉天紅(1982—)，女，助理研究員；研究方向：水產(chǎn)品安全與質(zhì)量控制. E-mail：oucthl@126.com. 通訊作者：王穎(1971—)，女，研究員；研究方向：食品科學(xué)與工程. E-mail：yzsshipin@126.com.