郭健康，安 苗，周其椿，曹恒源，李 珊，陳薛偉杰

( 1.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州水產(chǎn)科學(xué)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025 )

喀斯特山區(qū)大眼鱖線粒體COⅠ基因序列分析

郭健康1，安 苗1，周其椿2，曹恒源1，李 珊1，陳薛偉杰1

( 1.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州水產(chǎn)科學(xué)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025 )

為了解喀斯特山區(qū)大眼鱖3個(gè)地理群體內(nèi)和群體間的遺傳變異特點(diǎn)，采用PCR技術(shù)對(duì)169尾個(gè)體的線粒體DNA COⅠ基因進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，獲得的序列長(zhǎng)度為1512 bp。分析顯示,堿基A、T、C、G的平均含量分別為24.9%、28.6%、28.7%、17.8%，其中A+T(53.5%)含量高于G+C(46.5%)含量。169個(gè)樣本共檢測(cè)到5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，并定義了5種單倍型。對(duì)喀斯特山區(qū)大眼鱖群體COⅠ基因與洞庭湖大眼鱖COⅠ基因序列進(jìn)行序列差異分析，結(jié)果顯示，兩者之間存在10個(gè)變異位點(diǎn)，集中在1268～1456 nt?？λ固厣絽^(qū)3個(gè)群體間4種堿基在密碼子3個(gè)位點(diǎn)上的使用頻率無(wú)差別，與洞庭湖大眼鱖相比，密碼子第1位上的4種堿基含量差別不大，密碼子第2位上T含量(40.9%)高于后者(39.9%)，而A和C含量則低于后者；與洞庭湖翹嘴鱖比較差別很小，但與斑鱖、暗鱖、長(zhǎng)身鱖和波紋鱖4種鱖魚(yú)比較，在密碼子第1位和第3位存在不同差異，特別是暗鱖和波紋鱖密碼子第3位中A含量(30.0%)明顯低于喀斯特山區(qū)大眼鱖(31.8%)，而波紋鱖G(8.9%)明顯高于后者(7.3%)?？λ固厣絽^(qū)大眼鱖平均單倍型多樣性為0.395，平均核苷酸多樣性為0.00029，遺傳多樣性貧乏。

喀斯特山區(qū)；大眼鱖；COⅠ基因；密碼子；遺傳多樣性

大眼鱖(Sinipercakneri)屬硬骨魚(yú)綱、鱸形目、科、鱖亞科、鱖屬，俗稱(chēng)桂花魚(yú)、白桂等，分布于中國(guó)長(zhǎng)江及其以南水系，為中國(guó)南方特有種[1-2]，是一種名貴的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。貴州位于滇東高原到湘西丘陵之間的過(guò)渡地帶，地處長(zhǎng)江和珠江上游，屬典型的喀斯特山地，自西向東的苗嶺山脈將其境內(nèi)的水系分隔成珠江和長(zhǎng)江兩大流域，區(qū)內(nèi)河流眾多，生境多樣，鱖亞科魚(yú)的種類(lèi)及分布也豐富，近年來(lái)由于截流筑壩、過(guò)度捕撈、環(huán)境污染，資源銳減，有的種類(lèi)已很難采到。目前，本區(qū)大眼鱖的基礎(chǔ)生物學(xué)及群體遺傳學(xué)研究仍十分滯后，僅禹真等[3-4]對(duì)錦江河特有魚(yú)類(lèi)國(guó)家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)內(nèi)大眼鱖的形態(tài)特征、肌肉營(yíng)養(yǎng)、漁獲物組成和資源狀況有過(guò)報(bào)道。

細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ(Cytochrome c oxidase subunit Ⅰ, COⅠ)是線粒體中13個(gè)蛋白編碼基因之一，COⅠ不僅擁有足夠變異而易于被通用引物擴(kuò)增, 而且其DNA序列本身很少存在插入和缺失。目前mtDNA COⅠ基因既作為DNA條碼識(shí)別生物物種的有效性[5]，也廣泛用于水生生物群體遺傳多樣性及其遺傳結(jié)構(gòu)的研究[6-11]。本文運(yùn)用PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)分屬長(zhǎng)江流域和珠江流域的大眼鱖3個(gè)地理群體的169尾樣本mtDNA COⅠ基因進(jìn)行測(cè)序分析，探討喀斯特山區(qū)大眼鱖COⅠ基因序列特點(diǎn)和群體遺傳多樣性，為國(guó)家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)的種質(zhì)資源評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生大眼鱖采自3個(gè)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)，共計(jì)169尾。其中烏江黃顙魚(yú)國(guó)家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)沿河縣城河段45尾，錦江河特有魚(yú)類(lèi)國(guó)家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)銅仁段30尾，北盤(pán)江九盤(pán)段特有魚(yú)類(lèi)省級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)關(guān)嶺段96尾。對(duì)活魚(yú)樣本進(jìn)行常規(guī)生物學(xué)測(cè)定并解剖，取背部肌肉3～5 g浸泡于無(wú)水乙醇中，-20 ℃保存?zhèn)溆?。利用血?細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(北京天根)提取基因組DNA，1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)其完整性，用紫外分光光度計(jì)(Thermo NanoDrop 2000C)測(cè)定其吸光值。

1.2 引物設(shè)計(jì)與PCR 擴(kuò)增

參照翹嘴鱖(S.chuatsi)(登錄號(hào)為：JF972568.1)、斑鱖(S.scherzeri)(登錄號(hào)為：AP014527.1)和中國(guó)少鱗鱖(Coreopercawhiteheadi)(登錄號(hào)為：NC023957.1)等鱖亞科魚(yú)類(lèi)COⅠ基因序列設(shè)計(jì)引物，COF:5′-GGGGTTAGCCTACTTCTTT-3′；COR:5′-TGGTACTGACCTTTCTCGT-3′，引物由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系為20 μL：模板DNA 2 μL；2×Taq PCR Master Mix(北京天根)10 μL；上下游引物分別1 μL；剩余體積用雙蒸水補(bǔ)齊。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在AB公司梯度PCR儀(型號(hào)：Veriti)上完成；擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min； 94 ℃變性40 s，55.1 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min， 35個(gè)循壞；最后再72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3 PCR產(chǎn)物的測(cè)定

根據(jù)目的片段擴(kuò)增結(jié)果，切膠回收純化，將所有PCR產(chǎn)物送往北京諾賽基因組研究中心有限公司雙向測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)的處理

利用DNAstar 5.0軟件包中的Seqman做正反向鏈的拼接，手動(dòng)校正并去掉兩端引物及部分序列；運(yùn)用Mega 5.0統(tǒng)計(jì)堿基組成、變異位點(diǎn)、氨基酸含量，計(jì)算遺傳距離、建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；采用DNASP 5.0軟件統(tǒng)計(jì)單倍型多樣度，計(jì)算單倍型多樣度、核苷酸多樣度、群體間遺傳分化指數(shù)(Fst)，基因流(Nm)由Nm≈(1-Fst)/(4Fst)計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 喀斯特山區(qū)大眼鱖mtDNA COⅠ基因擴(kuò)增及序列差異

用CO5F/CO5R 引物對(duì)169尾大眼鱖DNA樣品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 所有樣品均擴(kuò)增出約1700 bp條帶(圖1)。

圖1 喀斯特山區(qū)3個(gè)大眼鱖群體COⅠ基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

注：M.2000 bp分子標(biāo)記；1、2.沿河群體；3、4.銅仁群體；5～7.關(guān)嶺群體；8.空白對(duì)照.

經(jīng)拼接、校對(duì)和比對(duì)后，獲得169條自5′端開(kāi)始的1512 bp序列，分屬5種單倍型，并提交GenBank，其登錄號(hào)為KU049654～KU049658，同時(shí)自GenBank中下載鱖屬6種鱖魚(yú)的10條同源序列作對(duì)比分析(表1)。

表1 本研究所用樣本信息

注：Hap1～Hap5，喀斯特山區(qū)大眼鱖群體單倍型；DTD，洞庭湖大眼鱖單倍型；QZG，翹嘴鱖單倍型；BG1～BG5，斑鱖單倍型；CTG，長(zhǎng)體鱖單倍型；ANG，暗鱖單倍型；BWG，波紋鱖單倍型. 下同.

Mega 5.0軟件分析顯示：喀斯特山區(qū)3個(gè)大眼鱖群體中，沿河群體存在4個(gè)變異位點(diǎn)(3個(gè)轉(zhuǎn)換位點(diǎn)和1個(gè)顛換位點(diǎn))，而其他2個(gè)種群未檢測(cè)到變異位點(diǎn)。169個(gè)樣本共檢測(cè)到5個(gè)變異位點(diǎn)(圖2)，未檢測(cè)到插入或缺失位點(diǎn)。這些變異除在513 nt處發(fā)生了1個(gè)堿基替換外，其余變異位點(diǎn)均發(fā)生在880 nt以后(變異比率為0.3%)。與洞庭湖大眼鱖比較有10個(gè)變異位點(diǎn)，主要集中在1268～1456 nt，變異比率為0.6%。與洞庭湖翹嘴鱖相比差異小，僅有2個(gè)變異位點(diǎn)。與斑鱖、暗鱖、長(zhǎng)體鱖和波紋鱖4個(gè)種間相比變異則較大，共有153個(gè)變異位點(diǎn)，含101個(gè)信息位點(diǎn)和52個(gè)單一變異位點(diǎn)，主要發(fā)生在213～1509 nt，變異比率為9.7%?？梢?jiàn)，喀斯特山區(qū)大眼鱖的COⅠ基因在種內(nèi)和與翹嘴鱖間，在近5′端654 bp左右變異較小，而與同屬中其他魚(yú)類(lèi)間的變異較大。

圖2 鱖屬魚(yú)類(lèi)線粒體COⅠ基因序列變異位點(diǎn)

堿基組成上，喀斯特山區(qū)3個(gè)大眼鱖群體間的A、T、C和G堿基平均含量相差不大，堿基C的含量最高，G含量最低，A+T含量都高于C+G含量且G的含量顯著低于其他堿基的含量，表現(xiàn)出明顯的反G 偏向(表2)；與洞庭湖大眼鱖及其他4種鱖魚(yú)差別較小?？梢钥闯觯λ固厣絽^(qū)大眼鱖的COⅠ基因與鱖屬魚(yú)類(lèi)在堿基組成上相似。

密碼子的使用上，喀斯特山區(qū)3個(gè)大眼鱖群體間在第1位、第2位和第3位點(diǎn)上無(wú)差別。相比較于洞庭湖群體，其密碼子第1位的T(20.6%)和G(30.7%)含量略高于后者(T為20.2%，G為30.0%)，而A(25.5%)和C(32.2%)的含量則略低于后者(A為26.2%，C為32.6%)；在密碼子第2位上，喀斯特山區(qū)群體的T(40.9%)含量高于洞庭湖群體的T(39.9%)含量，而A(17.5%)和C(26.4%)含量低于后者(A為18.1%，C為26.8%)。與翹嘴鱖比較差別較小，但與斑鱖、暗鱖、長(zhǎng)體鱖和波紋鱖4種鱖魚(yú)比較，除密碼子第2位上各堿基的使用率無(wú)差異外，密碼子第1位和第3位上存在不同差異，特別是暗鱖和波紋鱖密碼子第3位上A(30.0%)含量明顯低于喀斯特山區(qū)大眼鱖A(31.8%)，而波紋鱖G(8.9%)含量明顯高于喀斯特山區(qū)大眼鱖G(7.3%)的含量。可見(jiàn)在密碼子的使用率上，喀斯特山區(qū)大眼鱖群體的COⅠ基因在種群內(nèi)差別較??；而不同種群間，在密碼子第1位點(diǎn)和第2位點(diǎn)上差別較大。

1512 bp的核苷酸序列共編碼504個(gè)氨基酸，喀斯特山區(qū)大眼鱖群體的5個(gè)變異位點(diǎn)均為同義突變且都發(fā)生在密碼子第3位上，3個(gè)群體的氨基酸含量一致，其中亮氨酸含量最高(12.30%)，半胱氨酸最低(0.20%)。相比于洞庭湖群體，密碼子第1位(轉(zhuǎn)換/顛換比為4)和密碼子第2位(轉(zhuǎn)換/顛換比為2/3)存在堿基變異，使10個(gè)氨基酸發(fā)生了變異，其亮氨酸和半胱氨酸含量略低(亮氨酸11.71%，半胱氨酸0.20%)。與翹嘴鱖、斑鱖、暗鱖、長(zhǎng)體鱖、波紋鱖相比較，檢測(cè)到3處氨基酸被替代。結(jié)果表明，喀斯特山區(qū)大眼鱖群體的COⅠ基因的堿基變異特點(diǎn)，與同屬中其他鱖類(lèi)的堿基變異主要表現(xiàn)為同義突變特點(diǎn)類(lèi)似。

注：WYH：沿河群體；JTD：銅仁群體；BGD：關(guān)嶺群體；GZD：喀斯特山區(qū)3個(gè)大眼鱖群體；DTD：洞庭湖大眼鱖；QZG：洞庭湖翹嘴鱖；BG：斑鱖；ANG：暗鱖；CTG：長(zhǎng)體鱖；BWG：波紋鱖.

2.2 喀斯特山區(qū)大眼鱖群體的遺傳距離及系統(tǒng)關(guān)系

喀斯特山區(qū)3個(gè)大眼鱖群體間，沿河與關(guān)嶺群體間遺傳距離為0.000，它們與銅仁群體間的遺傳距離均為0.001；喀斯特山區(qū)3個(gè)大眼鱖群體內(nèi)，沿河群體內(nèi)遺傳距離為0.000～0.002，關(guān)嶺群體內(nèi)和銅仁群體內(nèi)遺傳距離均為0.000。喀斯特山區(qū)大眼鱖5個(gè)單倍型間的遺傳距離為0.001～0.002；與洞庭湖大眼鱖群體之間的遺傳為0.007～0.008；與翹嘴鱖的遺傳距離為0.002～0.003；與斑鱖之間的遺傳距離為0.056～0.067；與長(zhǎng)體鱖、暗鱖和波紋鱖之間的遺傳距離為0.053～0.067；與中國(guó)少鱗鱖遺傳距較遠(yuǎn)，為0.089～0.091；與日本少鱗鱖(C.kawamebari)和朝鮮少鱗鱖(C.herzi)之間的遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.184～0.190。由此表明，喀斯特山區(qū)大眼鱖的COⅠ基因在種群內(nèi)遺傳距離小于1%，而與其他種群間較遠(yuǎn)且在10倍以上。

表3 鱖亞科魚(yú)類(lèi)單倍型之間的遺傳距離

注：Hap1～Hap5：喀斯特山區(qū)大眼鱖群體單倍型；DTD：洞庭湖大眼鱖單倍型；QZG：翹嘴鱖單倍型；BG1～GB5：斑鱖單倍型；CTG：長(zhǎng)體鱖單倍型；BWG：波紋鱖單倍型；ANG：暗鱖單倍型；ZGS：中國(guó)少鱗鱖單倍型；RBS：日本少鱗鱖單倍型；CXS：朝鮮少鱗鱖單倍型.

將自GenBank中下載9種鱖魚(yú)COⅠ同源序列(序列號(hào)見(jiàn)圖3)，與本文5種大眼鱖單倍型一起，以花鱸(Lateolabraxjaponicus)(GenBank:AP006789)為外群，構(gòu)建鄰接法分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)和最大似然法分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4)，鄰接法樹(shù)和最大似然法樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖基本一致。由系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可以看出，鱖亞科魚(yú)類(lèi)分為兩大分支，中國(guó)少鱗鱖、日本少鱗鱖和朝鮮少鱗鱖聚為一支，長(zhǎng)體鱖和另5種鱖魚(yú)單倍型與本文大眼鱖5種單倍型簇聚成一支。

圖3 基于COⅠ基因片段鱖亞科魚(yú)類(lèi)的鄰接法系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)樹(shù)枝處的數(shù)字為Bootstrap值，重復(fù)次數(shù)為1000次；Hap1～Hap5，喀斯特山區(qū)大眼鱖群體單倍型.下同.

2.3 喀斯特山區(qū)大眼鱖群體的遺傳多樣性和遺傳分化

通過(guò)DNA SP 計(jì)算得到喀斯特山區(qū)3個(gè)群體的遺傳多樣性參數(shù)(表4)，結(jié)果顯示，沿河群體的多樣性參數(shù)多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、單倍型數(shù)、單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)和平均核苷酸差異數(shù)均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他2個(gè)群體，其遺傳變異最大，遺傳多樣性最豐富。

表4 喀斯特山區(qū)3個(gè)大眼鱖群體的遺傳多樣性參數(shù)

喀斯特山區(qū)大眼鱖3個(gè)群體的遺傳分化指數(shù)和基因流見(jiàn)表5。由表5可知，銅仁群體與關(guān)嶺群體之間的遺傳分化指數(shù)最大為1，沿河群體與關(guān)嶺群體之間的遺傳分化指數(shù)最小，為0.13398；銅仁群體與沿河群體、關(guān)嶺群體之間的基因流小于1，沿河群體與關(guān)嶺群體之間的基因流大于1。

圖4 基于COⅠ基因片段鱖亞科魚(yú)類(lèi)的最大似然法系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

種群1種群2群體間遺傳距離遺傳分化指數(shù)基因分化系數(shù)基因流銅仁群體沿河群體0.0010.793370.608300.10588銅仁群體關(guān)嶺群體0.0011.000001.000000.00000沿河群體關(guān)嶺群體0.0000.133980.109893.94393

3 討 論

3.1 喀斯特山區(qū)大眼鱖COⅠ基因片段變異及特征分析

COⅠ基因在同一種群內(nèi)COⅠ基因5′端654 bp左右的片段相對(duì)保守，在3′端變異較大[12-13]。本研究初步分析并比較了喀斯特山區(qū)3個(gè)大眼鱖群體的COⅠ基因片段的差異，結(jié)果顯示，169尾大眼鱖COⅠ基因片段中，除在513 nt處發(fā)生了堿基替換外，其他的變異位點(diǎn)均發(fā)生在880 nt以后。Hap5為30尾銅仁群體獨(dú)有單倍型，其在933 nt處存在C→T替換，通過(guò)檢索GenBank發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)的堿基種類(lèi)與同屬中斑鱖和暗鱖一致，而這三種鱖類(lèi)形態(tài)差異很大，因此該位點(diǎn)可以作為銅仁大眼鱖的分子標(biāo)記。

本研究中，大眼鱖COⅠ基因的堿基C含量最高，通過(guò)檢索GenBank中鱖亞科魚(yú)類(lèi)的同源序列發(fā)現(xiàn)，與其同屬的翹嘴鱖、斑鱖、波紋鱖和暗鱖堿基含量特點(diǎn)一致，而少鱗鱖屬的中國(guó)少鱗鱖、朝鮮少鱗鱖、日本少鱗鱖T的含量最高。從原核生物到真核生物，其基因組中廣泛存在堿基使用偏向性的現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)喀斯特山區(qū)大眼鱖G的含量最低(17.8%)，AT 含量明顯高于GC 含量，與洞庭湖大眼鱖堿基組成一致，也與其他魚(yú)類(lèi)COⅠ基因同源序列的堿基特點(diǎn)一致[14-16]，可見(jiàn)COⅠ基因?qū)A基的使用有明顯的偏向。Fedorov等認(rèn)為[17]，這一現(xiàn)象的產(chǎn)生可能與基因的表達(dá)水平、翻譯起始效應(yīng)、堿基組分、基因長(zhǎng)度以及密碼子反密碼子間結(jié)合能力的大小有關(guān)。蛋白編碼基因在第3位密碼子堿基上受到的功能限制較小，所以密碼子第3位堿基能夠更清晰地表明COⅠ基因核苷酸組成的不均一性。本研究中，喀斯特山區(qū)大眼鱖3個(gè)群體在密碼子第3位各堿基的含量無(wú)差別，與翹嘴鱖比較，3個(gè)密碼子位點(diǎn)上對(duì)各堿基的使用率差別很小，但與斑鱖、暗鱖和長(zhǎng)身鱖比較，除密碼子第2位上各堿基的使用率無(wú)差異外，密碼子第1位和第3位上存在不同差異?？梢?jiàn)，親緣關(guān)系越近，各密碼子上的堿基組成越相似。

COⅠ 基因是蛋白質(zhì)編碼基因之一，對(duì)于蛋白質(zhì)編碼區(qū)域而言，因蛋白質(zhì)功能上的需要和三聯(lián)體密碼子結(jié)構(gòu)的限制，缺失/插入很少發(fā)生或發(fā)生后很容易被選擇淘汰[18]。本研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)堿基的插入/缺失，變異為堿基替換，喀斯特山區(qū)大眼鱖群體轉(zhuǎn)換/顛換比為4，堿基變化均發(fā)生在第3位密碼子上的同義突變，與COⅠ基因遺傳密碼的特性保持一致。洞庭湖大眼鱖COⅠ基因與喀斯特山區(qū)大眼鱖群體差異較大，洞庭湖大眼鱖的堿基變異來(lái)源于第1位(轉(zhuǎn)換/顛換比為4)和第2位密碼子(轉(zhuǎn)換/顛換比為2/3)，使10個(gè)氨基酸發(fā)生了變化，這種差異可能與生存環(huán)境有關(guān)。

3.2 喀斯特山區(qū)大眼鱖遺傳距離及鱖亞科魚(yú)類(lèi)的系統(tǒng)關(guān)系

Hebert等[13]經(jīng)過(guò)對(duì)13 320個(gè)動(dòng)物物種的分析認(rèn)為，物種內(nèi)COⅠ序列的遺傳距離一般小于0.01，最大不超過(guò)0.02，而遺傳距離大于0.01，就認(rèn)為群體的變異大[19]。喀斯特山區(qū)3個(gè)大眼鱖群體COⅠ基因在群體內(nèi)的遺傳距離為0.000～0.002，群體間的遺傳距離為0.000～0.001，小于0.01；5個(gè)單倍型與洞庭湖大眼間的遺傳距離為0.007～0.008，也小于0.01。說(shuō)明這些大眼鱖群體的遺傳變異小。

鱖亞科魚(yú)類(lèi)的系統(tǒng)關(guān)系一直存在爭(zhēng)議，本研究所建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)與劉煥章等[20]研究的鱖亞科分成鱖屬和少鱗鱖屬的聚類(lèi)一致，長(zhǎng)體鱖沒(méi)有單獨(dú)生成一枝，而是與鱖屬魚(yú)類(lèi)聚在一起；本文的5種單倍型與大眼鱖和翹嘴鱖以99%的置信度聚在一起，表明大眼鱖與翹嘴鱖親緣關(guān)系密切，而且遺傳距離(0.001～0.008)并未到達(dá)種的分化標(biāo)準(zhǔn)，這與趙金良等[21-23]認(rèn)為翹嘴鱖和大眼鱖是近緣姐妹種的結(jié)果一致。

3.3 喀斯特山區(qū)大眼鱖群體的遺傳多樣性及遺傳分化

單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)是評(píng)價(jià)物種遺傳多樣性的2個(gè)重要指標(biāo)，值越大遺傳多樣性越豐富?？λ固厣絽^(qū)3個(gè)大眼鱖群體中，沿河群體遺傳多樣性較其他2個(gè)群體高，其原因可能是由于烏江流域面積廣闊且又與長(zhǎng)江連通，大眼鱖能進(jìn)行廣泛的基因交流，雖然沿河段下游彭水電站現(xiàn)今阻礙了沿河群體與下游的其他大眼鱖群體的基因交流，但彭水電站投入使用時(shí)間不足10年，所以該大眼鱖群體保存了較高的遺傳多樣性水平；銅仁群體單倍型單一，其可能是通過(guò)少數(shù)個(gè)體近親繁殖而來(lái)；北盤(pán)江關(guān)嶺段位于光照大壩上游，大眼鱖資源豐富但遺傳多樣性水平低，這可能是由于大壩的建成，為其創(chuàng)造一個(gè)適宜的生活環(huán)境使其大量繁殖。3個(gè)群體總體上單倍型多樣性指數(shù)(0.395)低于其他魚(yú)類(lèi)[如太湖新銀魚(yú)(Neosalanxtaihuensis)為0.576、異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)為0.690、棘頭梅童魚(yú)(Collichthyslucidus)群體為0.785][15,24-25]，表現(xiàn)為低單倍型多樣性(0.395)，低核苷酸多樣(0.00029)，這種狀況表明其可能最近出現(xiàn)過(guò)種群瓶頸效應(yīng)或奠基者效應(yīng)[26]。

基因流和遺傳分化系數(shù)通常用來(lái)判斷群體間遺傳分化程度。若基因流大于1，表明種群間存在一定的基因交流；若基因流大于4，表明種群之間是一隨機(jī)交配的群體；若基因流小于1，預(yù)示著有隔離的產(chǎn)生[27]。本研究中，沿河群體和關(guān)嶺群體之間的基因流大于1，表明兩者之間存在一定的基因交流，而北盤(pán)江與烏江是相互隔離的水體，理論上不應(yīng)該有基因交流，造成這種基因交流原因，可能是2個(gè)群體曾經(jīng)可能生活在一個(gè)水體中，后來(lái)由于地質(zhì)變遷等因素使其彼此隔離。銅仁群體與其他兩個(gè)群體的基因流均小于1，說(shuō)明銅仁群體與其他兩個(gè)群體有隔離，缺乏基因交流，造成這種隔離的原因，可能與生存環(huán)境有關(guān)。按照群體遺傳學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)[28]，沿河群體和關(guān)嶺群體間低度分化(0.15>遺傳分化系數(shù)>0.05) ，而銅仁群體與其他兩個(gè)群體間的遺傳分化程度高 (遺傳分化系數(shù)>0.25) 。

3.4 喀斯特山區(qū)大眼鱖資源的保護(hù)

遺傳多樣性豐富度直接反映出了物種的進(jìn)化潛力，遺傳多樣性越豐富，物種對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力也就越大，生存和進(jìn)化的潛力也就越大[29]。本研究中，沿河群體的遺傳多樣性明顯高于銅仁群體和關(guān)嶺群體，因此應(yīng)優(yōu)先對(duì)沿河群體進(jìn)行保護(hù)，防止稀有等位基因丟失。對(duì)于遺傳多樣性貧乏的銅仁群體和關(guān)嶺群體，應(yīng)盡快采取有效措施(如人工引種、放流等)來(lái)擴(kuò)大其遺傳變異和數(shù)量。

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SequenceAnalysisofCytochromeCOxidaseSubunitⅠ (COⅠ)ofMitochondrialDNAGeneofBigeyeMandarinfishSinipercakneriinKarstMountain

GUO Jiankang1, AN Miao1, ZHOU Qichun2, CAO Hengyuan1, LI Shan1, CHEN Xueweijie1

( 1.College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China;2.Gui Zhou Fisheries Research Institute, Guiyang 550025, China )

The partial mitochondrial COⅠ sequences of 169 individuals of bigeye mandarinfishSinipercaknerifrom three populations in Karst Mountain were amplified by PCR technique to analyze their sequence variation and the 1512 bp nucleotide sequences were obtained．The amplification showed that the average contents of A, T, G and C were 24.9%,28.6%,28.7% and 17.8%, respectively, the average content of AT(53.5%) being higher than that of GC(46.5%). Five variable sites were detected and five different haplotypes were defined in 169 samples of the populations, and the 10 variable loci were detected between the populations ofS.kneriin Karst Mountain andS.kneriin Dongting lake, most of which were occurred from 1268 nt to 1456 nt. There were no difference about codon usage among the three populations in Karst Mountain. Comparing toS.kneriin Dongting lake, there were no significant differences in the first positions of codon usage, higher content of T(40.9%) than the latter (39.9%) in the second codon positions, whereas the content of A and C was lower than the latter in the third codon positions. The codon usage was small discriminatory between bigeye mandarinfish in Karst Mountain and mandarinfishS.chuatsiin Dongting lake. Comparison ofS.scherzeri,S.obscura,S.rouleiandS.undulatarevealed different discriminatory at the first codon positions and third codon positions, especially significantly lower content of A(30.0%) inS.obscuraandS.undulataat the codon first positions than that(31.8%) inS.akneriin Karst mountain, whereas G content (8.9%) ofS.undulatawas significantly higher than the latter (7.3%). The total haplotype diversity (Hd) was 0.395 and nucleotide diversity(Pi) was 0.00029, therefore, indicating a low genetic diversity level in the populations ofS.kneriin Karst Mountain.

Karst Mountain;Sinipercakneri; COⅠ gene; codon; genetic diversity

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.06.008

Q959.4

A

1003-1111(2016)06-0649-09

2015-11-25；

2016-03-14.

郭健康(1987—)，男，碩士研究生；研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物增養(yǎng)殖學(xué).E-mail:gzguojk@126.com.通訊作者：安苗(1970—)，男，副教授，碩士；研究方向：水生動(dòng)物增養(yǎng)殖與魚(yú)類(lèi)種質(zhì)資源.E-mail：gzuam@163.com.