劉靖宇,張凱,孟俊龍,常明昌*,元玲剛,柴岍,呂秀明

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801)

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金針菇固體液化菌種研究

劉靖宇1,張凱1,孟俊龍1,常明昌1*,元玲剛2,柴岍1,呂秀明1

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801)

[目的]為探究新型菌種，推進(jìn)食用菌工廠化生產(chǎn)的進(jìn)程。[方法]首先對金針菇固體液化菌種的最佳培養(yǎng)基進(jìn)行了篩選，之后，對金針菇固體液化菌種和常規(guī)液體菌種的菌絲形態(tài)、菌絲球濃度、還原糖含量、基質(zhì)降解酶活力等指標(biāo)的變化情況進(jìn)行了比較與分析。[結(jié)果]金針菇固體液化菌種最佳原料為木屑粉。金針菇固體液化菌種菌球濃度在第6天達(dá)到最大值68個(gè)·mL-1，且菌球濃度遠(yuǎn)高于常規(guī)液體菌種。金針菇固體液化菌種還原糖含量在第4天達(dá)到最大值18.626 g·L-1，比常規(guī)液體菌種提前1天；蛋白酶、纖維素酶和漆酶的活力均在第5天達(dá)到最大值后趨于平衡，且培養(yǎng)期間均高于常規(guī)液體菌種。[結(jié)論]固體液化菌種在菌球數(shù)量、基質(zhì)降解活力和穩(wěn)定性等方面明顯優(yōu)于對照常規(guī)液體菌種。

金針菇； 固體液化菌種； 基質(zhì)降解活力

隨著我國食用菌產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，工廠化生產(chǎn)必將成為我國食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然方向[1]。高效優(yōu)質(zhì)菌種制備是工廠化生產(chǎn)的基礎(chǔ)和豐產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的先決條件，也是工廠化生產(chǎn)最為重要的組成部分[2]。目前，我國工廠化生產(chǎn)主要采用固體和液體2種菌種。固體菌種具有活力穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，但生產(chǎn)周期較長、轉(zhuǎn)接后易導(dǎo)致菌包菌齡不一致；近年來，液體菌種的應(yīng)用大大縮短了生產(chǎn)周期，但菌種生產(chǎn)過程中常常會(huì)出現(xiàn)菌絲活力不穩(wěn)定的現(xiàn)象[3～6]。為此，開展結(jié)合固體菌種的穩(wěn)定性和液體菌種的周期短等優(yōu)點(diǎn)的新型固體液化菌種的研究就顯得尤為必要。

金針菇是我國最先進(jìn)行工廠化栽培的食用菌種類之一。因其菌蓋滑嫩、柄脆、營養(yǎng)豐富、味美適口而著稱于世。金針菇味道鮮美營養(yǎng)豐富，干品中含蛋白質(zhì)8.87%，碳水化合物60.2%，金針菇是我國最先進(jìn)行工廠化栽培的食用菌種類之一。因其菌蓋滑嫩、柄脆、營養(yǎng)豐富、味美適口而著稱于世。金針菇味道鮮美營養(yǎng)豐富，干品中含蛋白質(zhì)8.87%，碳水化合物60.2%，粗纖維達(dá)7.4%，經(jīng)常食用可防治潰瘍病。隨著人們對健康飲食和兒童智力開發(fā)的關(guān)注，金針菇因其良好增智和保健療效，近幾年深受廣大消費(fèi)者喜愛。

目前，國內(nèi)還鮮有關(guān)于固體液化菌種的相關(guān)研究報(bào)道。本研究首先將金針菇PDA菌種轉(zhuǎn)接于粉碎的固體培養(yǎng)基中，之后，將培養(yǎng)好的固體菌種進(jìn)行液化培養(yǎng)制備固體液化菌種，并對其生長過程中的主要生理生化指標(biāo)進(jìn)行了測定,以期為新型固體液化菌種的研發(fā)提供必要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌種

金針菇菌株“8903”由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA斜面培養(yǎng)基：土豆250 g，葡萄糖25 g，磷酸二氫鉀2.75 g，硫酸鎂1.8 g，瓊脂粉20 g。

常規(guī)液體培養(yǎng)基：土豆250 g，葡萄糖25 g，磷酸二氫鉀2.75 g，硫酸鎂1.8 g。

固體液化菌種原種培養(yǎng)基：主料83%，麩皮15%，糖1%，石膏1%，含水量65%(主料：棉籽殼粉、玉米芯粉、木屑粉等過80目篩細(xì)粉)

1.2 儀器與設(shè)備

BS210S電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)，TGL-16G臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，722E可見分光光度儀(上海光譜儀器有限公司)，zqpw-250 全溫振蕩培養(yǎng)箱(天津市萊波特瑞儀器設(shè)備有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 固體液化菌種培養(yǎng)基篩選

將活化的金針菇(菌種于PDA培養(yǎng)基上，24 ℃暗培養(yǎng)7天)菌塊(5 mm)接種于固體液化菌種原種培養(yǎng)基中，測定菌絲生長速度。試驗(yàn)重復(fù)3次，優(yōu)選出最佳固體液化菌種培養(yǎng)基。

1.3.2 固體液化菌種與常規(guī)液體菌種液體培養(yǎng)

應(yīng)用優(yōu)選出的原料制成固體液化菌種原種，分別將等量的固體液化菌種原種(用接種針敲碎)與PDA斜面試管種接種于裝有100 mL三角瓶中，24 ℃，170 r·min-1暗培養(yǎng)，每日取樣進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)測定，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 指標(biāo)測定

菌球計(jì)數(shù)：取1 mL菌液置于培養(yǎng)皿中稀釋十倍，皿下襯黑白相間方格紙計(jì)數(shù)。

還原糖含量測定：參照Song Fengyan的研究結(jié)果[7]，采用3，5-二硝基水楊酸法測定。

蛋白酶活性測定：采用Worthington法[8]，培養(yǎng)液中蛋白酶活性單位定義為1 U即1min消化1 mg酪氨酸所需酶量，時(shí)間15 min。

羧甲基纖維素酶(CMC酶)活性測定：參照Li Fen的研究結(jié)果[9],采用3，5-二硝基水楊酸法測定。培養(yǎng)液中羧甲基纖維素酶活性單位定義為1 U即1 min消化1 mg葡萄糖所需酶量，時(shí)間30 min。

漆酶活性檢測：參照王宜磊的研究結(jié)果[10]，用紗布過濾菌液，吸取300 uL濾液到1.5 mL離心管中，加入等體積的0.012 mol·L-1的愈創(chuàng)木酚溶液，搖勻觀察顏色變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 固體液化菌種培養(yǎng)基篩選

由圖1可見，5種培養(yǎng)料制成的金針菇固體菌種生長速度存在差異，木屑粉培養(yǎng)基生長速度最快，長速可達(dá)0.32 mm·d-1。由于木屑易粉碎，且粉碎后形成表面光滑的顆粒，制成的固體液化菌種在進(jìn)行液體培養(yǎng)時(shí)形成的菌球大小均一、菌絲密度高、菌球形態(tài)較好。因此，選擇木屑粉作為固體液化菌種的最佳培養(yǎng)基。

圖1 不同培養(yǎng)基對菌絲生長速度的影響Fig.1 The Effect of different Composts on the mycelial growth race 注：1.棉籽殼培養(yǎng)基；2.木屑培養(yǎng)基；3.棉籽殼和木屑等比例混合培養(yǎng)基；4.玉米芯培養(yǎng)基；5.棉籽殼和玉米芯等比例混合培養(yǎng)基Note: 1.cottonseed hulls medium; 2.sawdust medium; 3.cottonseed hulls and wood composite media; 4.corn cob media; 5.cottonseed hulls and corn cob media

如圖2所示，隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，2種菌種的菌球數(shù)逐漸增加，之后略有下降。培養(yǎng)的第3天固體液化菌種出現(xiàn)較多的菌絲球(圖2C)，而常規(guī)液體菌種僅出現(xiàn)少量的菌球(圖2中3)。培養(yǎng)的第6天固體液化菌種菌球濃度達(dá)到最大值為68個(gè)·mL-1，常規(guī)液體菌種在第7天達(dá)到最大值55個(gè)·mL-1。培養(yǎng)期間，固體液化菌種菌球數(shù)都遠(yuǎn)高于常規(guī)液體菌種。常規(guī)液體菌種在生長后期出現(xiàn)了培養(yǎng)液顏色變黃、變渾濁，菌絲球周圍出現(xiàn)刺狀菌絲等菌絲退化現(xiàn)象，而固體液化菌種無此現(xiàn)象。

圖2 兩種菌種菌絲形態(tài)變化Fig.2 The change of bacteria mycelium morphology on two different spawn 注：1～8為常規(guī)液體菌種8天培養(yǎng)圖；A～H為固體液化菌種8天培養(yǎng)圖Note: 1 to 8 for 8 days of conventional liquid spawn culture figure； A to H for 8 days of solid

圖3 兩種菌種菌球數(shù)量變化Fig.3 The change of mycelial pellet numbers in two different spawnliquefaction spawn culture figure

2.2.2 液體培養(yǎng)基中還原糖含量的變化

由圖4 可知，兩種菌種培養(yǎng)液中還原糖含量均呈先增加后下降的趨勢，固體液化菌種還原糖含量在第4天達(dá)到最大值18.626 mg·mL-1，常規(guī)液體菌種在第5天達(dá)到最大值18.623 mg·mL-1。培養(yǎng)前期，菌絲活力較弱，主要利用培養(yǎng)液中現(xiàn)有的還原糖；隨后產(chǎn)生酶分解大分子物質(zhì)產(chǎn)生還原糖，還原糖的產(chǎn)出率高于吸收率，因此還原糖含量呈上升趨勢；培養(yǎng)后期菌絲活力增強(qiáng)，菌液中還原糖代謝加快，營養(yǎng)物質(zhì)被消耗殆盡，還原糖含量呈下降趨勢。固體液化菌種為菌絲包裹的木屑顆粒，培養(yǎng)過程中菌絲生物量較大，培養(yǎng)前期對還原糖的利用率較高；培養(yǎng)后期對還原糖的消耗量大，因此前期還原糖含量增長較快，后期下降趨勢較為明顯。固體液化菌種培養(yǎng)第4天達(dá)到最大值后略有下降，第5天較第4天只低了1.203 g·L-1，5天后下降較快，據(jù)圖3可知第5天菌球濃度達(dá)到最大值，綜合考慮，建議實(shí)際固體液化生產(chǎn)中選用菌齡為5天的菌種較適合，與常規(guī)液體菌種相比培養(yǎng)周期縮短1天以上。

圖4 兩種菌種培養(yǎng)液中還原糖含量的變化Fig.4 The change of reducing sugar contents in liquid oftwodifferent spawn

2.3 固體液化菌種液體和常規(guī)液體菌種酶活性測定結(jié)果

2.3.1 蛋白酶活性

由圖5可知，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，蛋白酶活性先增加后穩(wěn)定的趨勢，培養(yǎng)前期，培養(yǎng)液中氮素充足，菌絲分泌蛋白酶量較少。隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，培養(yǎng)液中氮素缺乏，菌絲大量分泌蛋白酶，蛋白酶含量迅速增加。培養(yǎng)后期，蛋白酶含量趨于平衡。固體液化菌種蛋白酶含量從第2天的0.03 U開始迅速增加，第5天達(dá)到最大值2.09 U，比常規(guī)液體菌種第6天的最大值1.83 U高0.26 U，5天后蛋白酶含量趨于平衡維持在0.18 U左右。

圖5 兩種菌種培養(yǎng)液中蛋白酶活性變化Fig.5 The change of activities of proteasein two different spwn

由圖6可知，隨著菌絲的生長，兩種菌種的羧甲基纖維素酶含量變化趨勢同蛋白酶。固體液化菌種生長第3天，羧甲基纖維素酶含量為0.3 U，之后含量均高于常規(guī)液體菌種；生長第5天，增加到峰值1.03 U，而常規(guī)液體菌種在第6天才達(dá)到峰值0.9 U。固體液化菌種因本身含有纖維素酶，培養(yǎng)中期纖維素酶含量增加較快。培養(yǎng)后期，培養(yǎng)液中營養(yǎng)耗盡，固體液化菌種部分酶釋放，使得下降趨勢較平緩。

圖6 兩種菌種培養(yǎng)液中纖維素酶含量的變化Fig.6 The change of activities of cellulase in two different spawn

2.3.3 漆酶活性

由圖7可知，固體液化菌種產(chǎn)生漆酶較早，漆酶活性高于常規(guī)液體菌種。隨著培養(yǎng)基中碳源物質(zhì)的消耗，金針菇菌絲產(chǎn)生漆酶，分解培養(yǎng)基中的大分子物質(zhì)維持生長和發(fā)育，最終培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)被消耗殆盡，漆酶活性降低。固體液化菌種生長從第3天漆酶活性開始增強(qiáng)，在第5天，出現(xiàn)較強(qiáng)的顏色變化，之后顏色變淡，而常規(guī)液體菌中前6天顏色變化不明顯，直到第7天才出現(xiàn)較強(qiáng)的顏色變化。

圖7 兩種菌種培養(yǎng)液中漆酶活性Fig.7 The change of activities of laccase in two different spawn 注：上圖為固體液化菌種；下圖為常規(guī)液體菌種Note: The above is the solid liquefaction spawn； the below is conventional liquid spawn

3 小結(jié)與討論

本研究采用木屑粉為主料的固體液化菌種，對液體培養(yǎng)過程中的菌絲形態(tài)、菌球濃度、還原糖含量變化等生理生化指標(biāo)進(jìn)行了測定分析。結(jié)果表明，以木屑粉為主料的固體液化菌種菌絲潔白致密；較常規(guī)液體菌種生長速度快，菌球濃度高。固體液化菌種還原糖含量在培養(yǎng)第4天最高，之后略有下降但趨勢不明顯。菌絲培養(yǎng)第3～6天菌絲生長處于旺盛期，第5天濃度達(dá)到最大值，綜合考慮菌球濃度和還原糖變化，在菌種制作中應(yīng)選用菌齡為5天的菌種，較常規(guī)液體菌種提前1天以上，且菌球濃度遠(yuǎn)高于常規(guī)液體菌種。

為了從酶活方面說明結(jié)果的可靠性，對培養(yǎng)液中基質(zhì)降解酶活力進(jìn)行了測定。金針菇生長過程中主要利用培養(yǎng)料中的碳氮源提供生長發(fā)育所需的營養(yǎng)和能量，碳源主要由木質(zhì)素、纖維素等大分子物質(zhì)組成，氮源主要由有機(jī)氮源和無機(jī)氮源組成。蛋白酶是一種調(diào)節(jié)酶，是金針菇生長過程中分解氮素的主要酶類，其主要功能是在基質(zhì)中缺乏氮素的情況下，為了吸收蛋白質(zhì)中的氮素而產(chǎn)生的，其含量對菌絲生長后期的穩(wěn)定性和產(chǎn)量有著重要的影響；纖維素酶和漆酶是降解纖維素、木質(zhì)素等大分子物質(zhì)的主要酚氧化酶，能加速木質(zhì)素芳香族高分子化合物的分解，為菌株提供豐富營養(yǎng)。本研究結(jié)果表明：蛋白酶、羥甲基纖維素酶活性均呈現(xiàn)先上升后趨于平衡的變化趨勢，固體液化菌種培養(yǎng)的過程中，上述三種酶含量從第3天開始迅速增加，在第5天達(dá)到最大值，之后趨于平穩(wěn)，且培養(yǎng)前期，固體液化菌種中三種酶產(chǎn)生較早，培養(yǎng)中后期三種酶含量均普遍高于常規(guī)液體菌種。

金針菇固體液化菌種與常規(guī)液體菌種相比，具有萌發(fā)時(shí)間早、培養(yǎng)周期短、酶活高等優(yōu)點(diǎn)，這一結(jié)果對我國新型固體液化菌種的研發(fā)具有重要的參考價(jià)值，也為我國食用菌產(chǎn)業(yè)新型菌種的制備提供了一種新的思路。

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(編輯：馬榮博)

Study on the solid liquefaction spawn ofFlammulinavelutipes

Liu Jingyu1, Meng Junlong1, Chang Mingchang1*, Yuan Linggang2, Zhang Kai1, Chai Qian1, Lv Xiumei1

(1.CollegleofFoodScicenceandEngineering,ShanxiAgriclucturalUniversity,Taigu0380801China， 2.CollegeofHorticulture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

[Objective]The aim of this study was to develop new species, and to promote edible fungus factory production process[Methods]The best solidmaterials of liquefaction spawn ofFlammulinavelutipeswere investigated. The changes of mycelial morphology, the concentrationcontent of hypha ball, concents of reducing sugar and substrate degradation enzyme activities of solid liquefaction and conventio nal liquid spawns ofF.velutipeswere compared and analyzed. [Result]The results showed that the best solidmaterials of solid liquefaction spawn ofF.velutipeswas wood flour. The concentration of hypha balls of liquefaction spawns ofF.velutipesreached a maximum of 68 ball/mL on the sixth day, and were still far above than the conventional liquid spawn. Contents of reducing sugars of solid liquefaction spawn ofF.velutipesinc reased the maximum of 18.62 mg/ml on the fourth day about one days earlier than the conventional liquid spawn.The activities of protease, cellulase and laccase of solid liquefaction spawn ofF.velutipeswere higher than the conventional liquid spawn before reaching the maximums and then droping down on the fifth day. [Conclusion]The concentrations of hypha ball, substrate degradation activities and stabilities of solid liquefaction spawns ofF.velutipeswere were better than the control conventional liquid spawns.

Flammulinavelutipes, Solid liquefaction spawn, Substrate degradation activities

2016-04-20

2016-07-08

劉靖宇(1980-),男(漢)，山西大同人，副教授，博士，研究方向：食用菌栽培與育種

*通訊作者：常明昌，教授，博士生導(dǎo)師，Tel:03546888088,E-mail:sxmushroom@163.com

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科研啟動(dòng)基金(xb2012019)，國家自然科學(xué)基金(31301826)，山西省煤基重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(FT20140301)

S646.1

A

1671-8151(2016)11-0805-04