徐 靜，張 寧 ，田宏哲，王 丹，李 妍，劉慧穎，曹際娟

(1.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局 國家食品安全檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116001；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)分析測試中心，遼寧 沈陽 110866)

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小型黃曲霉毒素檢測儀的研制

徐 靜1*，張 寧1，田宏哲2，王 丹1，李 妍1，劉慧穎1，曹際娟1*

(1.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局 國家食品安全檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116001；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)分析測試中心，遼寧 沈陽 110866)

針對當(dāng)前黃曲霉毒素檢測方法中，中低端儀器無法實(shí)現(xiàn)多組分定量分析，高端儀器因價格高、體積大而無法在小型實(shí)驗(yàn)室推廣的現(xiàn)狀，開展了黃曲霉毒素專用檢測儀的研制工作。設(shè)計(jì)并搭建了基于膠束電動色譜-發(fā)光二極管誘導(dǎo)熒光檢測系統(tǒng)的儀器架構(gòu)，對關(guān)鍵光學(xué)元件等進(jìn)行了組合選擇，以紫外發(fā)光二極管為光源，BP 365 和BP 430分別為光源和熒光濾光片，多模石英光纖傳導(dǎo)熒光信號，光電倍增管檢測信號，并對膠束電動分離系統(tǒng)的緩沖溶液成分等進(jìn)行了優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了常見6種黃曲霉毒素的基線分離。在0.1～10 μg/L濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與熒光響應(yīng)的峰面積之間呈較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99；峰面積的日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.0%～2.4%，日間RSD為5.1%～6.0%。對6種黃曲霉毒素的檢出限為0.3～0.8 μg/kg，加標(biāo)回收率為85.3%～97.0%。該儀器具有體積小、造價低、無需衍生化反應(yīng)及大量有機(jī)試劑等特點(diǎn)，適用于食品中多種黃曲霉毒素的同時定量檢測。

黃曲霉毒素；熒光；發(fā)光二極管；檢測儀

黃曲霉毒素(Aflatoxins，AF)是由黃曲霉菌、寄生曲霉菌等產(chǎn)生的毒性次生代謝產(chǎn)物，目前已鑒定出20多種衍生物，其中AFB1,AFB2,AFG1,AFG2廣泛存在于花生、玉米、牧草等農(nóng)產(chǎn)品中，污染過程可發(fā)生在種植、運(yùn)輸、儲藏等環(huán)節(jié)的每一步。AFB1和AFB2通過飼料進(jìn)入食物鏈，在奶牛體內(nèi)代謝為AFM1和AFM2并最終進(jìn)入牛乳汁。為徹底控制AF的污染，檢測工作應(yīng)從牧場、原料奶收購站等源頭上開展。

目前 AF 的檢測方法主要為膠體金試紙法[1-2]、薄層色譜法[3]、酶聯(lián)免疫法[4-5]和熒光光度法[6]等，其特點(diǎn)是操作方便、儀器簡單，但只能給出粗略的定性結(jié)果或所有衍生物的總量，無法滿足多組分定量分析的需求；毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光法(Capillary electrophoresis-laser induced fluorescence,CE-LIF)[7]、液相色譜[8]及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9-13]可對各衍生物進(jìn)行分離后檢測，給出準(zhǔn)確含量，已廣泛應(yīng)用于各大型實(shí)驗(yàn)室的檢測和科研，但儀器結(jié)構(gòu)復(fù)雜，體積重量大，維護(hù)費(fèi)用高，無法在飼料、乳制品等源頭實(shí)驗(yàn)室推廣。

發(fā)光二極管誘導(dǎo)熒光檢測器(Light emitting diode-induced fluorescence,LED-IF)是近年來發(fā)展的一種微型化熒光檢測器，具有性能穩(wěn)定、造價低廉、適于微型化等優(yōu)點(diǎn)，已成為微流動分析系統(tǒng)中應(yīng)用最廣泛的檢測技術(shù)之一[14-17]。本文針對AF的化學(xué)及光譜特點(diǎn)，首次搭建了基于CE-LED-IF原理的小型黃曲霉毒素檢測儀，可對各組分進(jìn)行快速分離以及定量檢測，整個過程無需化學(xué)衍生，適用于小型實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用及推廣。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與配件

高壓電源(0～30 kV，東文高壓廠)，分離毛細(xì)管(45 cm×100 μm i.d.，有效長度35 cm，河北永年毛細(xì)管廠)，發(fā)光二極管(中心波長365 nm，半峰寬FWHM 15～20 nm，發(fā)散角6°，輸出光功率500 μW，前置電壓5 V，美國賽特公司)，干涉濾光片(BP365 nm，F(xiàn)WHM 70 nm，透過率85%；BP 430 nm，F(xiàn)WHM 37 nm，透過率85%；匯博光學(xué)技術(shù)有限公司)，光纖(芯莖200 μm，數(shù)值孔徑(NA)0.22，南京春暉科技有限公司)，光電倍增管(H5784,日本Hamamatsu公司) ；黃曲霉毒素免疫親和柱(AflaTest P，美國維康公司)；高效液相色譜儀配熒光檢測器(Agilent 1100 系列，美國安捷倫公司)。

1.2 試劑、溶液與樣品

黃曲霉毒素G1，G2，B1，B2標(biāo)準(zhǔn)品溶液(3 μg/mL,美國Sigma 公司)；脫氧膽酸鈉鹽(NaDC，生化級，純度>99%，意大利Fluka公司)；四硼酸鈉(分析純,湖州化學(xué)試劑廠)；磷酸氫二鈉(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；甲醇、乙腈(色譜純，德國 Merck公司)；實(shí)驗(yàn)用水為哇哈哈純凈水。

緩沖溶液：磷酸-硼酸(6 mmol/L Na2HPO4-10 mmol/L Na3BO4)混合鹽溶液。

電動膠束配比：6 mmol/L Na3BO4+10 mmol/L Na2HPO4+50 mmol/L NaDC，8% 乙腈。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別移取適量的AFB1，AFB2，AFG1，AFG2母液，配制成濃度為100 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)混合儲備液，于4 ℃冰箱避光保存；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，移取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，常溫氮?dú)獯蹈珊螅苡? mL緩沖溶液中，得到0.5～50 ng/mL 的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

100 μg/mL硫酸奎寧液：稱取0.01 g奎寧(分析純)用0.05 mol/L硫酸定容至100 mL。

0.1 mol/L氫氧化鈉清洗液：稱取 0.4 g氫氧化鈉(分析純)，用純凈水定容至100 mL；該溶液用于清洗分離毛細(xì)管柱。

大豆、花生、玉米、大米樣品，購于大連當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。

1.3 樣品前處理方法

樣品提取及免疫親和層析凈化步驟同文獻(xiàn)[18]。為使溶劑體系適用于膠束電動色譜，后續(xù)操作修改為：用1 mL甲醇將親和柱上富集的目標(biāo)物洗脫收集后，40 ℃氮?dú)獯蹈?，加? μL乙腈振蕩溶解，再加95 μL緩沖溶液，振蕩混勻，12 000 r/min 冷凍離心后上小型黃曲霉毒素檢測儀進(jìn)行檢測。

高效液相色譜(HPLC)對比實(shí)驗(yàn)，前處理參照文獻(xiàn)[18]。

1.4 黃曲霉毒素檢測儀的構(gòu)建

該檢測儀主要由兩部分構(gòu)成：①自制毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，包括：高壓電源，引出線自行焊接鉑電極；分離毛細(xì)管，新毛細(xì)管柱在使用前依次以0.1 mol/L NaOH、蒸餾水分別沖洗15 min，并用緩沖溶液空白運(yùn)行15 min；儲液瓶為1 mL小瓶，瓶蓋用手鉆加工出電極引線口、毛細(xì)管插入口和通氣孔。

②自制發(fā)光二極管誘導(dǎo)熒光檢測系統(tǒng)，采用紫外發(fā)光二極管作為激發(fā)光源，5 V恒壓源串聯(lián)50 Ω電阻供電；干涉濾光片(BP 365 nm)對LED發(fā)出的光進(jìn)行濾光處理，以消除干擾熒光的雜散光；LED自帶聚焦一體透鏡對激發(fā)光進(jìn)行匯聚，通過小孔(Φ0.2 mm)限束照射到毛細(xì)管的檢測區(qū)上。在與激發(fā)光垂直的方向進(jìn)行熒光收集，經(jīng)光纖傳導(dǎo)，通過熒光濾光片(BP 430 nm)消除背景干擾光，最終進(jìn)入光電倍增管，轉(zhuǎn)換為電信號輸出到電腦工作站。

儀器體積為40 cm×30 cm×20 cm，相當(dāng)于傳統(tǒng)高效液相色譜儀配熒光檢測器體積的五分之一，圖1為儀器的整體結(jié)構(gòu)。

圖1 黃曲霉毒素檢測儀的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of the homemade aflatoxin analyzer system

圖2 AFB1的激發(fā)譜圖(a)以及發(fā)光二極管的發(fā)射譜圖(b)Fig.2 Excitation spectrum(a) of AFB1 and emission spectrum(b)of the LED

2 結(jié)果與討論

2.1 光源的選擇

LED的選擇主要從發(fā)射波長、發(fā)散角、輸出光功率、FWHM等方面考慮。其發(fā)射波長應(yīng)盡量與熒光探針的最大吸收波長相吻合；發(fā)散角越小，越有利于光束的聚焦，從而提高有效激發(fā)光強(qiáng)；較大的輸出光功率有利于提高熒光激發(fā)效率；LED較大的FWHM值可以增大光強(qiáng)，相對于銳針狀的激光光譜，具有更高的激發(fā)效率，但FWHM過大，則會導(dǎo)致激發(fā)光譜與熒光光譜產(chǎn)生小部分重疊，若不加以濾波，會造成較高的背景噪音，因此FWHM數(shù)值應(yīng)結(jié)合濾光片、熒光探針的特點(diǎn)綜合選擇。圖2為所選擇LED的發(fā)射光譜及AFB1的激發(fā)譜圖。該LED具有自帶聚焦透鏡功能，其焦距長度約為6～10 mm。具體調(diào)節(jié)時，采用重力驅(qū)動方式，將硫酸奎寧液持續(xù)打入毛細(xì)管檢測窗處，采用螺絲步進(jìn)的方式前后調(diào)節(jié)LED和檢測窗的距離，并同時檢測獲得的熒光信號；當(dāng)信號值達(dá)到最大，即檢測窗恰好位于LED聚焦透鏡的焦點(diǎn)處時，獲得最大激發(fā)光強(qiáng)。

2.2 濾光片參數(shù)的選擇

濾光片的參數(shù)主要有最大波長透過率Tmax和截止效率。截止效率常以截止深度(OD)值衡量，OD=-lgTmin，其中Tmin為截止區(qū)的透過率；Tmax越大，傳導(dǎo)到光電倍增管的熒光強(qiáng)度越高，OD值越大，到達(dá)光電倍增管的噪音水平越低；隨著光電倍增管性能的提高，微弱信號的檢測不再是難題，只需增大倍增管的極化電壓，即可增大其增益倍數(shù)，因此系統(tǒng)的噪音水平成為決定檢測器靈敏度的關(guān)鍵因素。熒光檢測系統(tǒng)中常用長通型和帶通型兩種濾光片，國產(chǎn)長通型濾光片多數(shù)具有較高的Tmax(一般可達(dá)95%)和較低的OD值(一般為3)；國產(chǎn)帶通型濾光片，其Tmax一般為70%～90%，但具有較高的截止效率，最大OD值可達(dá)到4[17]。

當(dāng)LED的發(fā)光光譜范圍寬，與待測目標(biāo)物的熒光光譜產(chǎn)生部分重疊時，會造成較高的背景噪音，因此需要對光源進(jìn)行濾光處理；激發(fā)光在毛細(xì)管的圓柱型檢測窗上發(fā)生多次折射和反射，也造成了熒光信號的高背景噪音。綜合以上因素，本儀器選擇了具有特定OD值以及截止波長的帶通濾光片分別對激發(fā)光和熒光信號進(jìn)行處理，圖3為AFB1的熒光譜圖及所選用光源濾光片和熒光濾光片的光譜特性圖。對兩片濾光片的截止交叉處進(jìn)行放大處理后發(fā)現(xiàn)，其光譜交叉點(diǎn)位于390 nm處，截止OD值為5，可以滿足對激發(fā)光截止效率的要求。

Fig.3 Emission spectrum of AFB1(A) and transmission curves of the filters(B)

a:emission spectrum of AFB1;b:transmission curve of the filter for LED;c:transmission curve of the filter for the fluorescence

2.3 光纖的選擇

為滿足光譜傳輸需求，選擇多模石英光纖UVHCS，其傳輸波長可從深紫外區(qū)到可見光區(qū)，透過率(波長632.2 nm處)達(dá)99.7%/m；為滿足彎曲固定等儀器安裝需求，選擇雙包層結(jié)構(gòu)，確保具有較高的柔韌性，長期彎曲使用半徑為300 D，短期彎曲使用半徑為100 D(D為光纖包層外徑)。從檢測靈敏度角度考慮，光纖的芯徑越大，數(shù)值孔徑越大，所能夠接收光面積越大，接收的光強(qiáng)越大，靈敏度越高；從檢測器的分辨率角度考慮，光纖芯徑越小，數(shù)值孔徑越小，對相鄰譜峰的分辨率越大。綜合考慮，最終選擇芯徑為385 μm，數(shù)值孔徑(NA)0.22。

圖4 黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的電泳譜圖Fig.4 Electropherogram of aflatoxin standards siphon injection:18 cm×10 s;separation voltage:15 kV;separation temperature:25 ℃

2.4 膠束電動體系的選擇

黃曲霉毒素屬于中性小分子溶質(zhì)，具有強(qiáng)疏水性。膠束電動色譜(MECC)是其最優(yōu)電泳模式，其分離原理類似于反相液相色譜法。針對黃曲霉分子的極性特點(diǎn)，選擇極性較強(qiáng)的膽汁鹽膠束體系。分別考察了十二烷基硫酸鈉(SDS)和脫氧膽酸鈉(NaDC)兩種體系，結(jié)果表明，用NaDC比SDS體系的基線更為平穩(wěn)，因此選擇NaDC為最終表面活性劑。固定其他條件，考察了NaDC濃度分別為10，30，50，80，100 mmol/L時系統(tǒng)的各項(xiàng)參數(shù)，結(jié)果表明，當(dāng)NaDC濃度為50 mmol/L時，獲得的檢測靈敏度及分離度最高。

采用磷酸-硼酸(6 mmol /L Na2HPO4-10 mmol/L Na3BO4)混合鹽溶液作為緩沖溶液，與NaDC形成膠束體系。為增加黃曲霉毒素在流動相中的溶解度，并降低電滲流速度以增大分離度，在體系中加入有機(jī)試劑進(jìn)行改良。本實(shí)驗(yàn)在以上膠束體系中，分別添加了4%，8%，12%，16%，20%的乙腈，結(jié)果表明，當(dāng)加入8%乙腈作為有機(jī)改良試劑時，所獲得的分離效果最好。

2.5 方法的分析特性

在優(yōu)化分離條件下，對方法的線性、重現(xiàn)性及檢出限進(jìn)行考察，結(jié)果見表1，黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的電泳譜圖見圖4。結(jié)果表明，在0.1～10 μg/L濃度范圍內(nèi)，6種黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與熒光響應(yīng)的峰高之間具有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99；以標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣分別考察峰高的日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果顯示，日內(nèi)RSD不大于2.4%，日間RSD不大于6.0%。由于膠束電動色譜法所需進(jìn)樣量極小，且免疫親和層析凈化的效果優(yōu)于傳統(tǒng)固相萃取小柱，因此在前處理步驟可將最終定容體積進(jìn)一步濃縮為0.1 mL，僅為常規(guī)HPLC方法的十分之一，最終得到實(shí)際樣品的檢出限低于GB/T 18979-2003[18](見表1)，可滿足我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)對黃曲霉毒素的限量要求[19]。

表1 方法的線性、重現(xiàn)性及檢出限

Table 1 Regression data,reproducibility and limits of detection for the method

CompoundLinearrange(μg/L)rRSD(n=6，%)Intra?dayInter?dayLOD(μg/kg)AFM201～1009925225605AFM101～1009943236005AFG201～1009911245904AFG101～1009935225608AFB201～1009903205403AFB101～1009905225105

采用該黃曲霉毒素分析儀，對陰性花生樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，參考我國限量標(biāo)準(zhǔn)GB 2761-2011[19]制定低、中、高3個加標(biāo)水平；同時采用液相色譜/熒光法按照GB/T 18979-2003[18]處理，進(jìn)行對比，所得結(jié)果列于表2。結(jié)果表明，兩種方法的回收率及精密度水平基本接近，當(dāng)添加水平較低時，黃曲霉毒素分析儀的回收率略優(yōu)于液相色譜法。

表2 花生添加回收實(shí)驗(yàn)的方法對比(n=6)

Table 2 Recoveries of aflatoxins in peanut with different methods(n=6)

CompoundSpiked(μg/kg)AflatoxinanalyzermethodHPLCmethodRecovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)AFM205，5，10970，887，87587，60，46910，865，857106，76，50AFM105，5，10932，901，85379，56，40885，894，86770，60，38AFG21，5，10911，869，85771，59，43906，854，85976，58，47AFG11，5，10932，881，89075，60，48902，876，88476，67，50AFB205，5，10939，902，85380，59，38901，884，85189，64，36AFB105，5，10956，897，88475，60，41910，887，86380，59，50

圖5 花生樣品的電泳譜圖Fig.5 Electropherogram of the real peanuts sample siphon injection:18 cm×10 s;separation voltage:15 kV;separation temperature:25 ℃

2.6 實(shí)際樣品的測定

對大豆、花生、玉米、大米等12份實(shí)際樣品，分別采用所研制黃曲霉毒素分析儀及GB/T 18979-2003的液相色譜法進(jìn)行檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)部分樣品中AFB1為陽性，其他5種黃曲霉毒素均為陰性，檢測結(jié)果如表3所示。實(shí)際花生樣品的電泳譜圖如圖5所示。數(shù)據(jù)表明，兩種方法的檢測結(jié)果基本一致。

3 結(jié) 論

本文自行設(shè)計(jì)并搭建了基于CE-LED-IF原理的小型黃曲霉毒素檢測儀，研發(fā)了配套的分離及前處理方法。相比于傳統(tǒng)的HPLC方法，本方法具有儀器體積小、造價低廉、易于維護(hù)、運(yùn)行成本低等優(yōu)點(diǎn)，分析過程無需熒光標(biāo)記以及大量的有機(jī)試劑，具有在飼料儲存場、奶牛飼養(yǎng)場、原料奶收購站等中小型實(shí)驗(yàn)室推廣的潛力，對從源頭上控制黃曲霉毒素對食物鏈的污染具有重要意義。

表3 實(shí)際樣品中黃曲霉毒素B1的檢測結(jié)果

Table 3 Detection results of AFB1in the real samples

SampletypeSamplenumberDetected(μg/kg)AflatoxinanalyserHPLCSoybean1-?-20690613589610Peanut1--20920993680648Corn1--2258239315451502Rice1--2--3158144

*：no detected

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A Miniaturized Aflatoxin Analyzer Based on LED-induced Fluorescence Detector

XU Jing1*,ZHANG Ning1,TIAN Hong-zhe2,WANG Dan1,LI Yan1,LIU Hui-ying1,CAO Ji-juan1*

(1.Key Laboratory of National Food Safety(Liaoning ),Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of People's Republic of China,Dalian 116001,China;2.Analytical Center of Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China)

In the present method for aflatoxin detection,the low-end devices could not be applied in quantitation of multi-components,while the high-end devices are hard to be used in small labs due to the high cost and large volume.In this situation,a miniaturized aflatoxin analyzer was constructed based on micellar electrokinetic capillary chromatography with light emitting diode(LED) induced fluorescence detector.The main parts of the apparatus were chosen as follows:A UV LED was used as the light source,two band pass filters including BP 365 and BP 430 were used for the excitation light and the fluorescence,respectively,ultra violet hard clad silica(UVHCS) fiber was used to direct the fluorescence,and photomultiplier tube(PMT) was used as the detection element.The buffer composition was investigated and the optimized conditions were found.Under the optimal conditions,baseline separation of six aflatoxins was achieved.Good linearities were obtained over the concentration range of 0.1-10 μg/L for six compounds with correlation coefficients larger than 0.99.The intra-RSDs were in the range of 2.0%-2.4%,while the inter-RSDs were 5.1%-6.0%,respectively.The limits of detection for six compounds were in the range of 0.3-0.8 μg/kg,with recoveries of 85.3%-97.0%.With the advantages of small volume and low cost,as well as the elimination of derivatization and organic reagent,this analyzer could be widely used for the multi-aflatoxin quantitation in food analysis.

aflatoxin; fluorescence; light emitting diode; analyzer

2015-09-29；

2015-10-14

國家質(zhì)檢總局資助項(xiàng)目(2013IK168)；遼寧省農(nóng)業(yè)領(lǐng)域青年科技創(chuàng)新人才資助項(xiàng)目(2014011)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.03.007

O652.2; TL626

A

1004-4957(2016)03-0299-06

*通訊作者：曹際娟，博士，研究員，研究方向：食品安全，Tel:0411-82583647,E-mail:cjj0909@163.com 徐 靜，博士，高級工程師，研究方向：食品檢驗(yàn)儀器研發(fā)，Tel:0411-82583923,E-mail:jingxu99@163.com