汪釗，黃美娟，高亮，應(yīng)向賢，趙，孫杰

（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州310014）

化學(xué)酶法合成D-泛解酸內(nèi)酯的研究進(jìn)展

（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州310014）

泛酸俗稱維生素B5，是輔酶A合成的前體，而D-泛解酸內(nèi)酯是D-泛酸合成的前體。D-泛解酸內(nèi)酯的化學(xué)合成是以甲醛和異丁醛為起始原料，經(jīng)醛縮合、腈化及內(nèi)酯化等反應(yīng)生成DL-泛解酸內(nèi)酯，再經(jīng)選擇性拆分得到D-泛解酸內(nèi)酯?；瘜W(xué)法與酶法相結(jié)合有助于高效、綠色地合成高光學(xué)純度的D-泛解酸內(nèi)酯。內(nèi)酯水解酶催化混旋泛解酸內(nèi)酯的選擇性拆分已經(jīng)成功地實現(xiàn)了工業(yè)生產(chǎn)。對羰基還原酶、醇脫氫酶和羥基腈裂合酶等在化學(xué)酶法合成D-泛解酸內(nèi)酯中的最新進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

D-泛解酸內(nèi)酯；氧化還原酶；羥基腈裂合酶；內(nèi)酯水解酶

D-泛酸存在于植物以及低等生物的代謝過程中，被稱為遍多酸或本多酸，是水溶性維生素B族的一種[1]。D-泛酸的發(fā)現(xiàn)歷程久遠(yuǎn)，1933年由WILLIAMS R J從肝臟中提取出來，可以治愈雞糙皮病，并在1940年人工合成成功[2]。目前D-泛酸在生物體內(nèi)的代謝途徑已經(jīng)確定，即經(jīng)α-酮異戊酸，利用酮泛解酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶生成酮泛解酸，再利用酮泛解酸還原酶形成泛解酸，最后與β-丙氨酸形成D-泛酸[3]。目前，國內(nèi)對維生素B5的年需求量達(dá)2 000 t以上，而全球年需求量達(dá)10 000 t以上[4]。

D-泛解酸內(nèi)酯是合成D-泛酸的重要中間體。化學(xué)法合成D-泛解酸內(nèi)酯，從低廉原料出發(fā)經(jīng)多步反應(yīng)合成，工藝成熟，但總體存在化學(xué)條件嚴(yán)苛、酸堿用量大和能耗較高等問題。生物技術(shù)的發(fā)展為生物酶法合成D-泛解酸內(nèi)酯提供了充分的可行性。目前工業(yè)化合成D-泛解酸內(nèi)酯采用的是化學(xué)法與水解酶拆分法相結(jié)合的技術(shù)路線。筆者著重綜述了生物酶法替代相關(guān)化學(xué)反應(yīng)，并與化學(xué)法相結(jié)合應(yīng)用于D-泛解酸內(nèi)酯合成中的最新進(jìn)展。

1 化學(xué)法合成D-泛解酸內(nèi)酯

化學(xué)法合成D-泛解酸內(nèi)酯常常從羥醛縮合開始，利用廉價的異丁醛和甲醛進(jìn)行合成，該工藝已經(jīng)非常成熟[5-6]，其化學(xué)合成過程如圖1所示。異丁醛與甲醛在堿性、高溫條件下羥醛縮合形成羥基特戊醛，再添加氫氰酸，在酸性條件下進(jìn)行醇氰化反應(yīng)形成氰醇；氰醇在酸性條件下通過水解環(huán)化得到DL-泛解酸內(nèi)酯；外消旋的內(nèi)酯利用化學(xué)手性拆分劑或?qū)τ钞悩?gòu)體過量結(jié)晶分離出D-泛解酸內(nèi)酯和L-泛解酸內(nèi)酯；L-泛解酸內(nèi)酯經(jīng)過化學(xué)內(nèi)消旋化再形成DL-泛解酸內(nèi)酯，重復(fù)利用。動力學(xué)拆分中D-泛解酸內(nèi)酯的理論收率可達(dá)100%。

2 化學(xué)酶法合成D-泛解酸內(nèi)酯

泛酸具有一個手性中心，其中D-泛酸是工業(yè)生產(chǎn)所需要的。化學(xué)法合成D-泛酸（或泛酸鈣）工藝成熟，但步驟繁瑣且對消旋化產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)晶拆分費用昂貴。利用生物酶法生產(chǎn)光學(xué)純的D-泛酸可進(jìn)一步升級合成工藝，提升產(chǎn)品的競爭力。生物酶法主要包括利用生物菌體發(fā)酵生產(chǎn)和酶法催化。生物菌體發(fā)酵法利用基因工程技術(shù)在大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母等宿主菌中表達(dá)泛酸生物合成基因和氨基酸生物合成基因，并利用基因工程菌進(jìn)行微生物發(fā)酵[7-11]，泛酸產(chǎn)量較高，但微生物發(fā)酵法發(fā)酵液成分復(fù)雜，后續(xù)的產(chǎn)物分離提取較困難。酶法催化可以替代化學(xué)反應(yīng)過程中的某些步驟，以化學(xué)酶法的方式來實現(xiàn)D-泛酸的前體物質(zhì)D-泛酸內(nèi)酯的生產(chǎn)。目前國內(nèi)外酶法催化生產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯的方法主要包括酶法選擇性拆分和酶法不對稱合成。關(guān)于酶法不對稱合成，筆者主要綜述了三種路線：1）前手性物質(zhì)酮泛解酸或酮泛解酸內(nèi)酯不對稱還原成D-泛解酸內(nèi)酯；2）利用(R)-羥基腈裂合酶來合成泛解酸內(nèi)酯前體羥基特戊醛；3）醇脫氫酶參與的化學(xué)酶法合成D-泛解酸內(nèi)酯。

2.1 水解酶催化選擇性拆分制備D-泛解酸內(nèi)酯

DL-泛解酸內(nèi)酯可經(jīng)手性拆分得到所需要的D-泛解酸內(nèi)酯?；瘜W(xué)法拆分所需的化學(xué)拆分劑或結(jié)晶操作一般較為昂貴，而利用水解酶催化的動力學(xué)拆分，具有節(jié)能環(huán)保、產(chǎn)品光學(xué)純度高等優(yōu)點，更適用于工業(yè)生產(chǎn)。水解酶選擇性水解泛解酸內(nèi)酯，根據(jù)選擇性可分為L-泛解酸內(nèi)酯水解酶和D-泛解酸內(nèi)酯水解酶。

DL-泛解酸內(nèi)酯經(jīng)L-泛解酸內(nèi)酯水解酶水解，留下D-泛解酸內(nèi)酯，產(chǎn)生的L-泛解酸再經(jīng)化學(xué)內(nèi)酯、外消旋轉(zhuǎn)為DL-泛解酸內(nèi)酯，該過程如圖2所示。已知的L-泛解酸內(nèi)酯水解酶，大多來源于細(xì)菌[12]，如多形無色桿菌、蘇云金芽孢桿菌、放射性土壤桿菌、根癌農(nóng)桿菌。其中Kataoka M等[13]發(fā)現(xiàn)來源于根癌農(nóng)桿菌的L-泛解酸內(nèi)酯水解酶有較高的活力和選擇性。Kesseler M等[14]對根癌農(nóng)桿菌lu678的L-泛解酸內(nèi)酯水解酶構(gòu)建大腸工程菌并過量表達(dá)該蛋白，酶活提高了200倍，達(dá)到600 U/g。該過程要求L-泛解酸內(nèi)酯必須完全水解，才能獲得高光學(xué)純度的D-泛解酸內(nèi)酯，限制了其工業(yè)應(yīng)用。

D-泛解酸內(nèi)酯水解酶選擇性水解拆分DL-泛解酸內(nèi)酯生成D-泛解酸，再經(jīng)內(nèi)酯化生成D-泛解酸內(nèi)酯，留下的L-泛解酸內(nèi)酯經(jīng)化學(xué)消旋化為DL-泛解酸內(nèi)酯重新循環(huán)拆分，其拆分方法如圖3所示。D-泛解酸內(nèi)酯水解酶來源豐富，其中最常用的是鐮飽霉菌，有尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌和串珠鐮刀菌[12]。2007年，SAKAMOTO K等[15]利用固定化的尖孢鐮刀菌來水解拆分DL-泛解酸內(nèi)酯，固定化細(xì)胞的半衰期可以達(dá)到6 000 h，經(jīng)過180次重復(fù)利用后仍然保持原活力的71%，相對于游離的整細(xì)胞催化，其半衰期提高了35倍。

2.2 氧化還原酶催化不對稱還原制備D-泛解酸

內(nèi)酯

氧化還原酶不對稱還原酮泛解酸內(nèi)酯的方法如圖4所示，用L-泛解酸內(nèi)酯脫氫酶將L-泛解酸內(nèi)酯氧化成酮泛解酸內(nèi)酯，再利用酮泛解酸內(nèi)酯還原酶將其不對稱還原成D-泛解酸內(nèi)酯。該方法也可將外消旋的泛解酸內(nèi)酯作為起始原料，經(jīng)過氧化還原反應(yīng)后得到D-泛解酸內(nèi)酯，過程簡單，不需要化學(xué)法中的再消旋化反應(yīng)。

早在1973年，KING H L等[16]就研究發(fā)現(xiàn)一種來源于釀酒酵母的NADP（H）依賴型的酮泛解酸還原酶能夠?qū)⑼航馑徇€原為D-泛解酸內(nèi)酯，該酶在pH 7.0條件下需要2.2 min反應(yīng)延滯期才會催化酮泛解酸內(nèi)酯形成D-泛解酸內(nèi)酯。

1984年，日本學(xué)者SHIMIZU S等[17]篩選了一系列能夠還原酮泛解酸內(nèi)酯形成泛解酸內(nèi)酯的微生物菌種，其中小紅酵母、不對稱擲孢酵母、近平滑假絲酵母、粟酒裂殖酵母、清酒酵母、黑曲霉和萱草絲衣霉菌能夠催化酮泛解酸內(nèi)酯形成D-泛解酸內(nèi)酯。1987年SHIMIZU S[18]等利用氧化還原系統(tǒng)從消旋化的泛解酸內(nèi)酯出發(fā)，經(jīng)諾卡式菌選擇性氧化L-泛解酸內(nèi)酯生成酮泛解酸內(nèi)酯，后者經(jīng)近平滑假絲酵母不對稱還原成D-泛解酸內(nèi)酯。

SHIMIZU S等[19]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)一株紅串紅球菌可以直接完成該氧化還原過程，說明紅串紅球菌自身不僅可以產(chǎn)L-泛解酸內(nèi)酯脫氫酶，還可以產(chǎn)還原過程所需的酮泛解酸內(nèi)酯還原酶。同時他們還提出酮泛解酸內(nèi)酯在中性pH條件下會發(fā)生自發(fā)水解形成酮泛解酸，酮泛解酸再經(jīng)過大腸桿菌中酮泛解酸還原酶催化形成D-泛解酸，而后在酸性條件下閉環(huán)成D-泛解酸內(nèi)酯（圖5），這就解釋了1973年發(fā)現(xiàn)酮泛解酸還原酶延滯2.2 min起作用的原因。

KATAOKA M等于1992年分離純化出星狀諾卡氏菌生產(chǎn)的L-泛解酸內(nèi)酯脫氫酶，但比酶活只有0.041 7 U/mg。該菌的基因組信息已被披露，然而至今未有構(gòu)建其L-泛解酸內(nèi)酯脫氫酶基因工程菌的報道。2009年，王永澤等利用面包酵母生產(chǎn)酮泛解酸內(nèi)酯還原酶，并利用β-環(huán)糊精結(jié)合底物，減少底物對菌體的毒害作用，終產(chǎn)物得率達(dá)45%，光學(xué)純度達(dá)到90%以上。SI D等[20-21]于2012年在嗜麥芽寡養(yǎng)單孢菌845中克隆一個大小約為30 kDa的酮泛解酸還原酶，并與葡萄糖脫氫酶共表達(dá)成大腸工程菌，構(gòu)建輔酶循環(huán)體系。該大腸工程菌的酮泛解酸還原酶的比酶活達(dá)到27.7 U/mg。

2.3 羥基腈裂合酶催化不對稱合成D-泛解酸內(nèi)酯前體(R)-氰醇

(R)-氰醇是D-泛解酸內(nèi)酯的前體物質(zhì)，可經(jīng)過水解生產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯。利用(R)-羥基腈裂合酶催化HCN與羥基特戊醛的羰基碳不對稱加成進(jìn)而合成(R)-氰醇[22]的過程如圖6所示。大多數(shù)參與醇腈化反應(yīng)的酶主要存在于高等植物中[23]，例如巴旦杏、蘋果、薔薇、橡膠樹、亞麻類等，在植物體內(nèi)羥基腈裂解酶催化形成氫腈酸從而抵御外來物種的入侵。2007年荷蘭DSM公司從巴旦杏中提取分離的(R)-羥基腈裂合酶能選擇性合成(R) -氰醇，并構(gòu)建了粟酒裂殖酵母工程菌。2014年，DSM公司[24]將來自薔薇科的(R)-羥基腈裂合酶基因構(gòu)建于pJET重組質(zhì)粒，并導(dǎo)入巴斯德酵母中表達(dá)，確定了該重組酶最適條件范圍為15～20℃以及pH 2.5～3.0。在15℃和pH 2.5下醇腈化反應(yīng)2 d，反應(yīng)收率達(dá)到93%，轉(zhuǎn)化率達(dá)100%，產(chǎn)物光學(xué)純度達(dá)92%。

2.4 醇脫氫酶參與的化學(xué)酶法合成D-泛解酸內(nèi)酯

與D-泛解酸內(nèi)酯的工業(yè)合成類似，從縮醛反應(yīng)出發(fā)再經(jīng)醇脫氫酶還原，僅經(jīng)過三步就合成了D-泛解酸內(nèi)酯。這種醇脫氫酶參與的化學(xué)酶法合成過程由德國比勒費爾德大學(xué)HEIDLINDEMANN M等[6]在2015年設(shè)計，路線如圖7所示。該方法以異丁醛和乙醛酸乙酯為起始原料，以L-組氨酸作為有機催化劑在酸性條件下發(fā)生醛醛縮合反應(yīng)，得到(R)-中間體1。醇脫氫酶以異丙醇為輔底物實現(xiàn)輔酶循環(huán)，將中間體1還原成中間體2，中間體2無需分離直接自發(fā)環(huán)化成D-泛解酸內(nèi)酯。反應(yīng)中D-泛解酸內(nèi)酯的總得率達(dá)55%，產(chǎn)物e.e.值達(dá)到95%。

3 結(jié)論

化學(xué)法與水解酶拆分法相結(jié)合合成D-泛解酸內(nèi)酯憑借其成熟的工藝，目前在工業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)絕對重要地位。隨著國內(nèi)環(huán)保要求的日益趨嚴(yán)以及產(chǎn)能擴大帶來的競爭壓力，升級D-泛解酸內(nèi)酯的合成工藝勢在必行。諸多的研究表明，微生物或者酶的應(yīng)用有助于高效、綠色地合成高光學(xué)純度的D-泛解酸內(nèi)酯。內(nèi)酯水解酶催化混旋泛解酸內(nèi)酯的選擇性拆分已經(jīng)成功地實現(xiàn)了工業(yè)生產(chǎn)，而羰基還原酶、醇脫氫酶和羥基腈裂合酶等也已在化學(xué)酶法合成D-泛解酸內(nèi)酯方面展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。后續(xù)利用基因工程、蛋白質(zhì)工程以及反應(yīng)工程等技術(shù)，提高酶的表達(dá)量，改善酶的催化性能，優(yōu)化催化反應(yīng)條件，必將進(jìn)一步提升化學(xué)酶法合成D-泛解酸內(nèi)酯的技術(shù)競爭力。

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（責(zé)任編輯：朱小惠）

Research progress of chemo-enzymatic synthesis of D-pantolactone

WANG Zhao,HUANG Meijuan,GAO Liang,YING Xiangxian,ZHAO Man，SUN Jie
（College of Biotechnology and Bioengineering,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China）

D-pantothenic acid,commonly known as vitamin B5,is the precursor of coenzyme A, while D-pantolactone is the key intermediate of D-pantothenic acid.Racemic pantolactone is synthesized via aldol condensation using isobutanal and formaldehyde,followed by cyanation and lactonization under acidic condition.Furthermore,D-pantolactone is obtained through kinetic resolution of racemic pantolactone.The use of chemo-enzymatic method facilitates the efficient and green synthesis of D-pantolactone with high optical purity.Lactonase-catalyzed selective hydrolysis of DL-pantolactone has been successfully applied in industrial production.This paper reviews the research progress of chemo-enzymatic synthesis of D-pantolactone using carbonyl reductase,alcohol dehydrogenase and hydroxynitrile lyase as biocatalyst.

D-pantolactone;oxidoreductase;hydroxynitrile lyase;lactonase

TQ033

A

1674-2214（2016）04-0193-06

2016-03-03

浙江省自然科學(xué)基金資助項目（LQ14C010002，LQ16C020003）

汪釗（1960—），男，安徽歙縣人，教授，研究方向為生物催化，E-mail:hzwangzhao@163.com.