徐 友 ，王歡利 ，2，汪貴斌 ，曹福亮

（1. 南京林業(yè)大學 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2. 江蘇省中國科學院植物研究所 南京中山植物園，江蘇 南京 210014）

溫度和光照強度對銀杏葉黃酮合成的影響

徐 友1，王歡利1，2，汪貴斌1，曹福亮1

（1. 南京林業(yè)大學 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2. 江蘇省中國科學院植物研究所 南京中山植物園，江蘇 南京 210014）

為了探索溫度和光照強度對銀杏葉黃酮合成及調控機制，本研究對兩年生銀杏盆栽苗進行溫度和光強的兩因素三水平的處理，測定黃酮類黃酮類化合物的含量、代謝過程中關鍵酶基因表達量并建立黃酮類含量與基因表達的相關性，結果表明：T1Q3處理40 d后和T2Q2處理20 d后，單株銀杏黃酮含量相較處理前顯著增加；大部分處理中，黃酮類化合物的增量存在顯著的溫度效應，部分處處理中，黃酮類化合物的增量存在顯著光強效應和溫度、光強交互效應；黃酮代謝過程基因表達量存在顯著或極顯著的溫度、光強及溫度、光強交互效應；相關性分析表明；僅在處理10 d時，槲皮素的含量與F3H、FLS和ANS基因的表達量呈現(xiàn)明顯的正相關。

銀杏；溫度和光照強度；黃酮類化合物；酶活性；基因表達

銀杏葉中的黃酮類化合物具有廣泛的生物藥理活性，已成為醫(yī)藥和保健行業(yè)重要的原料。黃酮類化合物具有清除自由基、抗氧化、消炎、抗腫瘤、抗心血管疾病、抗衰老和抗過敏等藥理活性[1-2]。黃酮類化合物是銀杏葉中重要的次生代謝物質，合成過程受環(huán)境條件的調控。因此，在銀杏葉用園栽植管理的過程中，人為的改變環(huán)境條件即可提高黃酮類化合物的含量。目前，針對黃酮類化合物合成的環(huán)境因子的探究主要集中在光照、溫度和水分三個方面[3-4]。然而研究的過程通常采用單因素處理，沒有考慮到環(huán)境因子之間的交互效應。為了進一步探究溫度和光強的交互作用，本研究測定不同處理下銀杏黃酮類化合物含量、代謝過程中酶的活性及基因表量，進而了解環(huán)境因子的調控機制，為選擇最佳的環(huán)境因子組合提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料選取江蘇省邳州市1年生銀杏實生盆栽苗，幼苗規(guī)格基本一致（平均苗高43.9 cm，地徑8.66 mm）。盆栽容器直徑為19 cm（徑）×16 cm（高），每盆種植2株。盆栽基質為沙壤土（有機質含量為12.0 g·kg-1、水解性氮含量為 121 mg·kg-1、有效磷含量 12 mg·kg-1、速效鉀含量為 11.7 mg·kg-1）。

1.2 試驗設計

2013年3月，苗木栽植于盆中。2013年6月22日，盆栽苗木移入人工氣候室。處理前對銀杏苗進行正常的緩苗處理，緩苗期2周。緩苗結束后，開始進行溫度和光強處理。光強設置3個梯度，分別為 300 μmol·m-2s-1（Q1），500 μmol·m-2s-1（Q2），800 μmol·m-2s-1（Q3）。溫度設置 3 個梯度，分別為15 ℃/5 ℃（白天平均溫度為15 ℃，夜間平均溫度為5 ℃）（T1）；25 ℃/15 ℃（白天平均溫度為25 ℃，夜間平均溫度為15 ℃）（T2）；35℃/25 ℃（白天平均溫度為35 ℃，夜間平均溫度為25 ℃）（T3）。共計9個處理組合（表1），每個處理設3個重復小區(qū)，每個小區(qū)50盆銀杏苗木。處理時間為40 d，處理期間，各處理土壤水分含量均保持在土壤田間持水量的75%。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 生物量的測定

試驗開始前和結束后，取20 株銀杏苗，收集植株葉片放入烘箱中，在105 ℃殺青10 min，后用60 ℃烘干至恒重，稱重，計算葉片總生物量，總干重增量和相對生長率。

表1 試驗設計Table 1 Experimental design

1.3.2 黃酮含量的測定

銀杏葉片黃酮及其各組分含量的測定：處理開始后的0 d、10 d、20 d、30 d和40 d，共計5次采樣；采集植株當年生新梢中上部3-8片完全展開葉片，置60 ℃干燥箱烘至恒重，研磨過40目篩，并用萬分之一電子天平準確稱取1 g干燥備用。中有關銀杏葉黃酮的提取和測定的方法（HPLC）參考《中華人民共和國藥典》[5-6]。

1.3.3 黃酮代謝過程中相關基因的表達

處理開始后的0 d、10 d、20 d、30 d和40 d，共計5次采樣。采樣時摘取當年新梢葉片，采樣取材時間集中在傍晚17:00左右，樣品用酒精和蒸餾水擦拭干凈，并用剪刀剪碎混勻，放入液氮中速凍0.5 h后，放入-70 ℃超低溫冰箱保存待用。銀杏總RNA的提取采用改良CTAB法[3]，反轉錄第一鏈的合成采用SuperScriptTM III Frist-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen)，內參基因選擇GAPDH基因，目標基因引物的設計采用Primer Express Software Version 3.0（Applied Biosystems），引物序列參見表2。

表2 銀杏黃酮合成相關基因實時定量RT-PCR引物序列Table 2 The primers of flavonoids lactones biosynthetic genes in Ginkgo biloba for realtime PCR

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2003和SPSS 19.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計分析，用Duncan法進行差異顯著性檢驗，用Excel軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同處理下銀杏單株黃酮含量

不同溫度和光強的條件下，不同的采樣時期銀杏單株黃酮含量參見圖1。不同處理間多重比較的結果表明：T1Q3處理40 d后和T2Q2處理20 d后，單株銀杏黃酮含量相較處理前顯著增加；在較低溫度（T1和T2）下，處理10 d后單株銀杏的黃酮含量顯著下降；在較高的溫度（T3）下，處理40 d后單株銀杏的黃酮含量顯著下降。

2.2 不同處理條件下黃酮類各組分方差分析

處理10 d時，樣品中黃酮類化合物及各組分的增量在不同溫度條件下差異均達到的極顯著的水平，槲皮素增量的溫度×光照交互效應達到了顯著的水平（表3）；處理20 d時，黃酮類化合物及各組分的增量的溫度效應達到了顯著或極顯著的水平，同時槲皮素、異鼠李素和總黃酮的增量的溫度×光照交互效應達到了顯著和極顯著的水平；處理30 d時，異鼠李素增量的溫度效應達到了顯著水平，槲皮素增量的光照效應達到了顯著水平，黃酮類化合物及各組分增量的溫度×光照交互效應均達到了極顯著的水平；處理40 d時，黃酮類化合物及各組分增量的溫度效應和溫度×光照交互效應均達到極顯著的水平。

圖1 不同時期銀杏單株黃酮含量Fig.1 The contents of flavonoids in single ginkgo plant at different stages

表3 不同處理下黃酮類化合物增量的方差分析Table 3 ANOVA of increment of flavonoids under different treatments

2.3 不同處理條件下黃酮代謝過程中關鍵酶基因表達方差分析

處理10 d時，代謝過程中關鍵酶基因表達量的溫度、光強及溫度×光照交互效應均達到了顯著和極顯著的水平（表4）；處理20 d時，PAL基因表達量的溫度效應不顯著，而溫度和溫度×光照交互效應達到顯著水平，C4H基因表達量的溫度×光照交互效應不顯著，而溫度和光強的效應達到顯著水平，其余基因的表達量存在顯著或極顯著的溫度、光強及溫度×光照交互效應；處理30 d時，F(xiàn)LS和ANS基因表達量的光強效應不顯著，而溫度及溫度×光照交互效應顯著，其余基因的表達量存在顯著或極顯著的溫度、光強及溫度×光照交互效應。處理40 d時，F(xiàn)3H基因表達量的溫度和光強效應不顯著，而溫度×光照交互效應達到極顯著的水平，其余基因的表達量均存在顯著和極顯著的溫度、光強和溫度×光照交互效應。

2.4 黃酮各組分的含量與代謝過程中關鍵酶基因表達量的相關性分析

在處理10 d時，槲皮素的含量與F3H、FLS和ANS基因的表達量呈現(xiàn)明顯的正相關，山奈酚的含量與FLS基因的表達量呈現(xiàn)顯著的正相關，總黃酮的含量與FLS基因的表達量呈現(xiàn)正相關（表5）；在處理20 d時，黃酮類各組分的含量與關鍵酶基因的表達為呈現(xiàn)明顯的相關性；在處理30 d時，異鼠李素的含量與FLS基因的表達量呈現(xiàn)顯著的負相關；在處理40 d時，總黃酮的含量與C4H基因的表達量呈現(xiàn)明顯的負相關，異鼠李素的含量與PAL、C4H和CHS基因的表達量呈現(xiàn)明顯的負相關。

表5 黃酮各組分含量與關鍵酶基表達量相關性分析Table 5 Correlation analysis between flavonoids and gene expression

3 結 論

不同溫度和光照處理條件下，整個實驗周期中僅在T1Q3處理40 d后和T2Q2處理20 d后，單株銀杏的黃酮化合物的含量較處理前有顯著的提高，并且在較低的溫度條件下，處理10 d后，單株的黃酮含量顯著下降。這種現(xiàn)象的主要原因可能有以下兩個原因：（1）實驗材料選擇的是銀杏兩年生盆栽苗，盡管我們在實驗初期盡量選取規(guī)格一致的實生苗。然而實驗材料本身存在基因型的差異，然而在本實驗中，筆者沒有考慮到材料的遺傳差異。（2）實驗過程中溫度和光強的設定較大田的生長條件明顯偏低[3-4]，因此，在短時間的處理后，黃酮和內酯含量顯著降低。

不同處理條件下，方差分析表明黃酮化合物存在顯著的溫度效應，而在部分黃酮類化合物存在顯著的光強和溫度×光強交互效應，因此在后續(xù)的實驗過程中，我們可以通過設置較高的溫度和光照條件，進一步探索銀杏盆栽苗黃酮類化合物合成的最佳溫度和光照條件，為銀杏葉用園的經營管理提供指導[7-8]。

不同處理條件下，方差分析表明溫度和光強顯著的影響黃酮類化合物代謝過程中關鍵酶基因的表達，且溫度和光強存在明顯的交互效應；進一步的證實了光照和溫度可以在轉錄水平調節(jié)關鍵酶基因的表達[9-10]。另外，黃酮類化合物的含量與代謝相關酶基因表達的相關新分析，僅在處理的初期階段黃酮類化合物的含量與部分基因的表達呈現(xiàn)顯著的正相關。主要的原因有（1）代謝過程中基因表達的調控的時間較短；（2）溫度和光照對于黃酮類化合物合成的調控可能是通過多途徑和多層次的的調控；（3）另外，在實驗的過程中選取的實生苗做為實驗材料，可能有于本身的基因型的差異。因此，綜上所述，我們可以嘗試通過對無性系植株進行溫度和光強的的處理，從而提高銀杏葉用園黃酮和內酯的含量。

[1]曹福亮. 中國銀杏志[M]. 北京: 中國林業(yè)出版社, 2007.

[2]程水源, 顧曼如, 束懷瑞. 銀杏葉黃酮研究進展[J]. 林業(yè)科學,2000, 36(6): 110-115.

[3]朱燦燦. 銀杏葉次生代謝產物的環(huán)境誘導機制及其調控[D].南京:南京林業(yè)大學, 2010.

[4]郭旭琴. 溫度和光照對銀杏葉黃酮合成的影響[D]. 南京: 南京林業(yè)大學, 2012.

[5]國家藥典委員會. 中國藥典[M]. 北京: 中國醫(yī)藥科學和技術出版社, 2010.

[6]歐陽娜娜, 李湘洲, 羅 正. 銀杏功能活性成分提取分離技術研究進展[J]. 經濟林研究, 2008, 26(1): 103-107。

[7]劉家堯, 劉 新. 植物生理學實驗教程[M]. 北京: 高等教育出版社, 2010.

[8]陳 雷, 常 麗, 曹福亮, 等. 銀杏葉黃酮類化合物含量及相關酶活性對溫度和干旱脅迫的響應[J]. 西北植物學報, 2013,33(4): 755-762.

[9]常 麗. 溫度和土壤水分對銀杏葉類黃酮合成的影響[D]. 南京: 南京林業(yè)大學, 2013.

[10]汪貴斌, 郭旭琴, 常 麗, 等. 溫度和土壤水分對銀杏葉黃酮類化合物積累的影響[J]. 應用生態(tài)學報, 2013, 24(11): 3077-3083.

[11]洪麗蕓, 田大倫, 李 芳, 等. 不同灌溉方式對銀杏水分生理的影響[J]. 中南林業(yè)科技的學學報, 2008, 28(1): 49-52.

Effects of temperature and light intensity on flavonoid biosynthesis of ginkgo (Ginkgo biloba L.) leaves

XU You1, WANG Huan-li1,2, WANG Gui-bin1, CAO Fu-liang1
(1. Co-Innovation Center for the Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, Jiangsu, China;2. Nanjing Yat-sen Botany Garden, Institute of Botany Jiangsu Province & Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210014, Jiangsu, China)

In order to reveal the in fluence of temperature and light intensity on flavonoid biosynthesis in ginkgo leaves, two-year old ginkgo potted seedlings was treated under three levels of temperature and light intensities. The contents of flavonoid and key enzyme gene expression were measured then the correlation analysis of flavonoid contents and key enzyme gene expression was built. The result showed that flavonoid contents per plant were signi fi cantly increased at T1Q3 for 40d and T2Q2 for 20 d；In most treatments, the increment of flavonoid showed signi fi cant temperature effect, while just in few treatments, the increment of flavonoid showed signi fi cant light intensity and temperature′light intensity effect; the key enzyme gene expression contents showed signi fi cantly temperature, light intensity and temperature′ light intensity effect; there is remarkable positive correlation between quercetin contents and expression ofF3H,FLSandANSafter 10 d treatment.

Ginkgo bilobaL; temperature and light intensity; flavonoid; enzyme activity; gene expression

S792.95

A

1673-923X(2016)04-0030-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.04.006

http: //qks.csuft.edu.cn

2015-08-11

國家科技支撐計劃項目“銀杏用材和藥用林定向培育關鍵技術研究”（2012BAD21B04）、江蘇省科技支撐計劃“沿海灘涂銀杏用材林可持續(xù)性經營技術研究與示范”（BE2013443）、國家自然科學基金項目“銀杏葉黃酮類化合物環(huán)境誘導機制”（31070557）；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目（PAPD）資助

徐 友，博士研究生

汪貴斌，教授，博士；E-mail：gbwang@njfu.com.cn

徐 友，王歡利，汪貴斌，等. 溫度和光照強度對銀杏葉黃酮合成的影響[J].中南林業(yè)科技大學學報，2016, 36(4): 30-34.

[本文編校：吳 彬]