蘇傳麗，吳志洪，鐘 江，鄭恩金，黃 濤，岳天天

廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023

土龍祛疣洗劑對(duì)尖銳濕疣皮損microRNA表達(dá)的影響*

蘇傳麗，吳志洪△，鐘 江，鄭恩金，黃 濤，岳天天

廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023

目的:探討土龍祛疣洗劑對(duì)尖銳濕疣(CA)皮損標(biāo)本中m i croRN A分子表達(dá)譜的影響。方法:以39例CA患者為觀察組，使用土龍祛疣洗劑熏洗治療，6周后觀察療效。以同期自本院外科就診的10例行包皮環(huán)切患者為對(duì)照組，取其正常包皮組織。采用qRT-PCR檢測2組5個(gè)炎癥相關(guān)m i croRN A(m i R-21、m i R-203、m i R-125b、m i R-146a和m i R-155)的表達(dá)情況。結(jié)果:39例CA患者治療6周后27例皮損消退明顯，癥狀減輕，總有效率為69.2%；觀察組m i R-203與正常對(duì)照組相比呈現(xiàn)低表達(dá)，土龍祛疣洗劑治療后呈現(xiàn)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；m i R-21治療后表達(dá)量與治療前相比則下調(diào)明顯(P＜0.05)；而m i R-155、m i R-125b、m i R-146a分子在治療前后無明顯變化。結(jié)論:土龍祛疣洗劑治療尖銳濕疣療效肯定，可能通過下調(diào)m i R-21和上調(diào)m i R-203分子來發(fā)揮抗病毒的治療作用。

尖銳濕疣；人類乳頭瘤病毒；土龍祛疣洗劑；m i croRN A分子

微小RNA(microRNA，miRNA)是由約20～25個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA，通過與靶信使mRNA的3′末端非翻譯區(qū)堿基的部分互補(bǔ)配對(duì)，抑制mRNA翻譯或直接使其降解，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)。最近，越來越多的證據(jù)顯示miRNA與皮膚腫瘤和免疫炎癥性皮膚病的關(guān)系密切，miRNA介導(dǎo)的基因調(diào)控異常可能與角質(zhì)形成細(xì)胞和免疫細(xì)胞的異常作用有關(guān)。Nuovo GJ等［1］在子宮頸乳頭瘤病毒(HPV)感染的宮頸上皮內(nèi)瘤變?cè)缙贖PV感染皮損細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miRNAs let-7c，-99a，26a和125b表達(dá)豐富，但在CIN-1級(jí)患者和尖銳濕疣患者皮損細(xì)胞miR-125b的表達(dá)明顯下降，而共轉(zhuǎn)染anti-miR-125b和HPV 16病毒則引起病毒DNA合成明顯增加。序列分析則顯示miR-125b和不同基因型的HPV病毒L2序列高度同源。Li B等［2］研究表明低表達(dá)miR-34a分子和高危HPV病毒基因型和宮頸癌密切相關(guān)，Au Yeung CL等［3］認(rèn)為在宮頸癌中microRNA的反常表達(dá)與HPV病毒密切相關(guān)，在HPV感染相關(guān)的宮頸癌組織中miR-23b表達(dá)通常都降低。此外，miR-203是近年來發(fā)現(xiàn)的第一種皮膚特異性miRNA，研究發(fā)現(xiàn)miR-203分子在多種可能與HPV相關(guān)的腫瘤組織中表達(dá)異常，如子宮內(nèi)膜癌［4］、基底細(xì)胞癌(BCC)［5］等，而且作為抑癌或致癌因子與靶基因共同作用參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。筆者臨床采用壯藥土龍祛疣洗劑治療尖銳濕疣(CA)療效滿意，為探討祛疣洗劑治療CA皮損組織中角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡與miRNA的關(guān)系，本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測39例CA患者在壯藥土龍祛疣洗劑治療前后皮損中相關(guān)5個(gè)炎癥相關(guān)microRNA(miR-21、miR-155、miR-125b、miR-146a和miR-203分子的表達(dá)水平，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下:

1 資料與方法

1.1 臨床資料 以廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科2013年9月至2015年3月就診的39例CA患者(均經(jīng)臨床及醋酸白試驗(yàn)確診)為觀察組，其中男24例，女15例；年齡21～46歲，平均29.50歲；病程2～9周。以同期自本院外科就診的10例行包皮環(huán)切患者為對(duì)照組，取其正常包皮組織。本研究經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查后批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.2 治療方法 39例CA患者均使用祛疣洗劑治療(5例患者皮損直徑超過8 mm，先采用激光治療除去突出皮面疣體，再予祛疣洗劑治療)。祛疣洗劑(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房提供)藥物組成:板藍(lán)根30 g，馬齒莧30 g，生薏苡仁30 g，廣木賊20 g，桃仁20 g，紅花20 g，乳香15g，紫草20g，香附20g，生牡蠣30g，枯礬15g。祛疣洗劑局部熏洗方法見文獻(xiàn)［6］。每2天治療1次，6周為1個(gè)療程，治療結(jié)束觀察疣體數(shù)目和大小的改善情況，進(jìn)行療效評(píng)定。隨訪3個(gè)月，觀察復(fù)發(fā)率。

1.3 療效標(biāo)準(zhǔn) 基本治愈:疣體完全消失，2個(gè)月內(nèi)無新疣體出現(xiàn)，癥狀全部消失，病理組織切片未見空泡化細(xì)胞。顯效:癥狀基本消失或全部消失，觀察2個(gè)月內(nèi)無新的疣體。好轉(zhuǎn):癥狀減輕，皮損數(shù)目較前減少。無效:臨床癥狀、體征無明顯改變，疣體數(shù)目或皮損面積的減少小于20%或繼續(xù)加重。如果患者癥狀消失后新發(fā)皮損，經(jīng)醋酸白試驗(yàn)陽性者判斷為復(fù)發(fā)。

1.4 皮損組織中 m i R-21、m i R-155、m i R-125b、m i R-146a和m i R-203表達(dá)水平檢測 采用直徑6 mm無菌鉆孔器鉆取土龍祛疣洗劑治療前后患者皮損組織標(biāo)本，無菌PBS清洗后加入Trizol處理進(jìn)行RNA抽提，然后使用分光光度計(jì)測量RNA的濃度和純度。選取D260/D280＞1.8和D260/D230＞2.0的RNA用于miRNAs分析，同時(shí)觀察各RNA樣品的光譜，確保所有用于miRNAs表達(dá)譜分析的RNA具有正常的光譜分布。以U6作為內(nèi)參照，設(shè)計(jì)其特異性莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物，引物序列見表1。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書加樣，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后以cDNA為模板，利用RFQ-PCR檢測試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10分鐘；95℃變性5 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸7分鐘。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。根據(jù)每孔熒光信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)作為Ct值，采用相對(duì)定量法(ΔCt=CtmiRNA-CtU6)，以2-ΔCt表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量，各引物序列見表1。

表1 m i R-21、m i R-203、m i R-125b、m i R-146a 和m i R-155引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行檢測結(jié)果的數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用(s)表示，miRNAs相對(duì)表達(dá)量的比較均采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

39例患者治療6周后27例癥狀減輕，皮損明顯好轉(zhuǎn)，總有效率為69.2%；其中臨床治愈12例，顯效15例，好轉(zhuǎn)9例，無效3例。RFQ-PCR檢測結(jié)果顯示，以U6為內(nèi)參照，土龍祛疣洗劑治療后miR-203相對(duì)表達(dá)量與治療前相比上調(diào)顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)；miR-21治療后表達(dá)量與治療前相比則下調(diào)明顯(P＜0.05)，但仍高于對(duì)照組。miR-125b治療后相對(duì)表達(dá)量與治療前相比有所上調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；miR-155和miR-146a治療前后的表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 m i R-21、m i R-203、m i R-125b、m i R-146a和m i R-155 m RN A表達(dá)水平的檢測

3 討論

壯藥土龍祛疣洗劑以壯醫(yī)“調(diào)龍路火路”理論組方，為我院皮膚科鐘江主任的經(jīng)驗(yàn)方，外用治療病毒疣20余年，臨床療效顯著，尤其對(duì)復(fù)發(fā)患者，有激光、冷凍或其他藥物治療無法比擬的優(yōu)勢。方由土龍根、木賊、馬齒莧、桃仁、紅花、香附、乳香、沒藥、牡蠣等組成。方中土龍根、木賊、馬齒莧為龍路火路藥，能通調(diào)龍路、火路，祛毒化濁、調(diào)噓勒(氣血)；桃仁、紅花、香附、乳香、沒藥、牡蠣能開塞通阻、散結(jié)消壅、通暢龍路火路。筆者經(jīng)過臨床應(yīng)用和觀察發(fā)現(xiàn):在臨床上使用土龍祛疣洗劑治療的CA患者，大部分經(jīng)歷了病毒疣皮損基底部發(fā)生輕度紅腫、輕度脫屑和瘙癢過程后，皮損徹底自然消退，而沒有這個(gè)過程的患者則復(fù)發(fā)嚴(yán)重。筆者多年臨床實(shí)踐結(jié)果表明，該方能有效調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)的功能活動(dòng)，干預(yù)HPV病毒的復(fù)制與復(fù)發(fā)，具有其他藥物無法取代的優(yōu)點(diǎn)和廣闊的應(yīng)用前景，其調(diào)節(jié)信號(hào)的效應(yīng)機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

壯藥土龍祛疣洗劑中所使用的土龍根、馬齒莧、廣木賊、廣薏苡仁等都是廣西道地壯藥，收錄于《廣西道地藥材》《壯醫(yī)特色療法》《實(shí)用壯醫(yī)內(nèi)科學(xué)》等多部壯醫(yī)藥著作中。該方通過藥物對(duì)體表龍路、火路的刺激，疏通龍路、火路之瘀滯，祛毒外出，調(diào)整、“噓”(氣)、“勒”(血)、臟腑功能，恢復(fù)天、人、地三氣的同步運(yùn)行，從而達(dá)到治病目的。該治療理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論共同點(diǎn)都是要解決2個(gè)問題:一是消滅侵入的病原體，二是恢復(fù)正常的免疫力。雖然是外治，組方同樣講究解毒補(bǔ)虛并舉，認(rèn)為藥物外用即可直接作用于病灶起到解毒蝕疣止癢的功效，又可通過皮膚、黏膜的吸收內(nèi)達(dá)臟腑、血液，起到調(diào)理氣機(jī)、補(bǔ)虛扶正的作用。

國內(nèi)有研究分析血清內(nèi)5個(gè)炎癥相關(guān)miRNA分子(miR-21、miR-203、miR-125b、miR-146a和miR-155)隨HPV感染后宮頸病變進(jìn)展的變化，結(jié)果表明血清內(nèi)miR-21水平與未感染者相似，但持續(xù)感染者、CINⅠ、CINⅡ/Ⅲ患者血清內(nèi)該分子表達(dá)均上調(diào)。血清內(nèi)miR-146a分子表達(dá)水平隨HPV感染后宮頸病變發(fā)展而升高［7］。miR-155是一個(gè)典型的多功能miRNA，參與了血細(xì)胞生成、炎癥和免疫等多種生物學(xué)過程［8］。miR-146a是一個(gè)具有抗炎特性的NF-κB通道依賴型miRNA，也為一個(gè)具有多功能的miRNA分子主要在呼吸系統(tǒng)中起調(diào)控作用［9］。研究表明，在尖銳濕疣皮損標(biāo)本內(nèi)miR-21和miR-146a相對(duì)表達(dá)量的確明顯高于正常對(duì)照組，但經(jīng)土龍祛疣洗劑治療前后對(duì)比發(fā)現(xiàn)miR-146a分子變化不明顯，miR-155治療前后的表達(dá)水平差異也不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，miR-125b治療后相對(duì)表達(dá)量雖與治療前相比有所上調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明這3個(gè)分子在土龍祛疣洗劑治療作用中并未起主導(dǎo)的作用。而治療前miR-203與正常對(duì)照組相比呈現(xiàn)低表達(dá)(P＜0.05)，土龍祛疣洗劑治療后呈現(xiàn)明顯上調(diào)(P＜0.01)；miR-21則下調(diào)明顯(P＜0.05)，說明這2個(gè)分子在抗病毒免疫中可能起重要的作用。目前已有研究顯示具有癌基因作用的miR-21在HPV16陽性的宮頸癌中表達(dá)升高，且可能受HPV16的調(diào)節(jié)調(diào)控黏膜細(xì)胞的增殖［10］。Yang X等［11］通過體外實(shí)驗(yàn)證明miR-21是TGF-β1誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞移行重塑的關(guān)鍵分子，通過影響創(chuàng)面早期收縮和重塑期的膠原沉積在正常皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)中起重要作用，因此我們推測土龍祛疣洗劑可通過miR-21分子促進(jìn)HPV感染角質(zhì)細(xì)胞的凋亡和重塑而起到治療作用。

miR-203是皮膚特異性的microRNA分子，在許多黏膜病毒感染性疾病例如卵巢癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和鼻咽癌等腫瘤組織中高表達(dá)，并且對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到調(diào)控作用［12-13］。Feber等［14］通過miRNA芯片分析發(fā)現(xiàn)，miR-203a在食管癌組織中表達(dá)水平下調(diào)至正常組織的1/10～1/2；miR-203a基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島異常高甲基化導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)，提示miR-203a可能是抑癌基因。Jardim MJ等［15］分析哮喘患者支氣管黏膜細(xì)胞中 66個(gè)miRNAs分子，發(fā)現(xiàn)在皮膚黏膜細(xì)胞中miR-203下調(diào)程度最大，并且預(yù)測其靶基因?yàn)樗ǖ阑駻QP4，AQP-4與IFN-γ分子呈正相關(guān)。Buggele WA證實(shí)在Sendai病毒感染的人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞系中，miR-203為IFN-γ可誘導(dǎo)的microRNA分子，可負(fù)向調(diào)控細(xì)胞內(nèi)炎癥mRNA分子的表達(dá)包括IFN-γ受體基因［16］。HPV病毒主要侵犯皮膚黏膜角質(zhì)細(xì)胞，且其引發(fā)皮損預(yù)后與角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)干擾素相關(guān)誘導(dǎo)分子的關(guān)系密切。本研究發(fā)現(xiàn)壯藥土龍祛疣洗劑對(duì)尖銳濕疣患者皮損中miR-203分子的表達(dá)影響較大，明顯高出對(duì)其他miRNAs分子的影響，提示它在尖銳濕疣局部黏膜免疫中起著重要作用，其調(diào)控機(jī)制可能為干擾素相關(guān)靶基因通路，而miR-21分子介導(dǎo)的凋亡通路可能是土龍祛疣洗劑治療作用的另一個(gè)途徑。下一步我們將對(duì)比分析患者血液和皮損中相關(guān)炎癥因子和免疫分子的變化對(duì)這些miRNAs分子的作用做進(jìn)一步研究，以期為尖銳濕疣的早期預(yù)防及治療提供有價(jià)值的分子靶點(diǎn)。

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Effects of TuLong QuYou Lotion on MicroRNA Expression of Condyloma Acuminatum Lesions

SU Chuanli,WU Zhihong△,ZHONG Jiang,ZHENG Enjin,HUANG Tao,YUE Tiantian
The First Affiliated Hospital Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning 530023,China

Objective：To explore the effects of TuLong QuYou lotion on microRNA molecular expression profiles of the samples with condyloma acuminatum (CA)lesion.Methods：All 39 cases of the observation group were treated with TuLong QuYou lotion and the effects were observed in six weeks.Ten cases of the control group were treated with circumcision in surgical department of hospital,normal prepuce tissue was selected.Five inflammation-related microRNA(including miR-21,miR-203,miR-125b,miR-146a and miR-155)expressions in two groups were detected by qRT-PCR.Results：There were 27 cases with skin lesions and symptoms relived in six weeks after treating among 39 CA cases,and the total effective rate was 69.2%;when the observation group was compared with the control group in miR-203,the former was in low expression,the expression was up-regulated after treating by TuLong QuYou lotion,there was statistical difference(P＜0.01);miR-21 expression was down-regulated obviously after treatment compared with before(P＜0.05);there were no obvious changes in miR-155,miR-125b,miR-146a after and before treatment.Conclusion：The effects of TuLong QuYou lotion on CA are certain,and it shows antiviral function by down-regulating miR-21 and up-regulating miR-203 molecule.

CA;HPV;TuLong QuYou lotion;microRNA molecule

R752.5

A

1004-6852(2016)10-0001-04

2016-04-11

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)81360599)；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)2013G X N SFA A 019148)；廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技立項(xiàng)課題(編號(hào)G ZZY 13-17)。

蘇傳麗(1981—)，女，碩士學(xué)位，副主任醫(yī)師。研究方向:變態(tài)免疫性皮膚病的免疫病理研究。

△通訊作者:吳志洪(1975—)，男，博士學(xué)位，副教授。研究方向:感染免疫性皮膚病的中西醫(yī)結(jié)合診治。