陳 璐，李晉奇，邊 原，胡 遠(yuǎn)

四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610072

多指標(biāo)優(yōu)選補(bǔ)氣生血口服液水提醇沉工藝*

陳 璐，李晉奇，邊 原，胡 遠(yuǎn)

四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610072

目的:采用多指標(biāo)控制，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化補(bǔ)氣生血口服液的水提醇沉工藝。方法:以當(dāng)歸揮發(fā)油得率為指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)篩選出當(dāng)歸提取芳香水的最佳工藝；再以黃芪甲苷、阿魏酸含量的綜合評(píng)分為指標(biāo)，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)當(dāng)歸殘?jiān)ⅫS芪和黨參的水提醇沉過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果:當(dāng)歸提取揮發(fā)油的最佳條件為提取時(shí)間12小時(shí)，浸泡時(shí)間24小時(shí)，加水量10倍。當(dāng)歸殘?jiān)?、黃芪和黨參水提醇沉過(guò)程最優(yōu)提取條件為加水倍數(shù)10倍、煎煮時(shí)間20分鐘、含醇量70%。結(jié)論:該工藝穩(wěn)定可行，為提高補(bǔ)氣生血口服液的質(zhì)量穩(wěn)定性和臨床用藥安全提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

補(bǔ)氣生血口服液；正交設(shè)計(jì)；黃芪甲苷；阿魏酸；揮發(fā)油得率

補(bǔ)氣生血口服液由黃芪、黨參、當(dāng)歸等五味中藥組成，在腫瘤放療、化療的輔助治療中，取得非常好的效果。其中黃芪性平，味甘，善補(bǔ)氣，滋補(bǔ)肝腎，益精明目；黨參性平，味甘，補(bǔ)中益氣，健脾生津，此二味為君藥。當(dāng)歸性溫，味甘、辛，補(bǔ)血活血，為臣藥。全方具有補(bǔ)氣、生血、滋補(bǔ)肝腎的作用，能夠緩解患者神疲乏力、頭暈眼花、四肢倦怠、腰膝酸軟等癥狀。該制劑中當(dāng)歸經(jīng)加水蒸餾提取芳香水；其藥渣與黨參、黃芪加水煎煮的原有工藝相比較模糊。筆者以當(dāng)歸揮發(fā)油得率為指標(biāo)，先優(yōu)化當(dāng)歸的水提醇沉條件。再以黃芪甲苷、阿魏酸含量為指標(biāo)，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)考察加水倍數(shù)、乙醇含量、煎煮時(shí)間對(duì)黃芪與黨參水提醇沉的影響，最后綜合各項(xiàng)指標(biāo)，選出補(bǔ)氣生血口服液的最佳水提醇沉詳細(xì)條件，并予以驗(yàn)證，為該制劑的臨床推廣提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下:

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695液相色譜儀系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司提供)，ELSD檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司提供)，電子天平(西德Sartorius公司提供)，GOA型電熱真空干燥箱(天津市東郊機(jī)械加工廠提供)，RE-98型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠提供)，F(xiàn)Q-972恒溫水浴鍋(天津玻璃儀器廠提供)。

1.2 試藥 黃芪、當(dāng)歸、黨參藥材均由四川新荷花中藥飲片有限公司生產(chǎn)，由成都食品藥品檢驗(yàn)研究院彭善貴副主任中藥師鑒定。黃芪甲苷、阿魏酸對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪甲苷、阿魏酸的含量測(cè)定方法

2.1.1 色譜條件 黃芪甲苷:色譜柱:phenomenex C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相:水∶乙腈(60∶40)；柱溫:30℃；流速:1.0 mL/min；進(jìn)樣量:10 μL；ELSD檢測(cè)器；漂移管溫度:105℃；氣流速度:2.5 L/min。黃芪甲苷出現(xiàn)較好色譜峰，峰型良好［1］。阿魏酸:色譜柱:phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈∶水(20∶80)，流速:1.0 mL/min，柱溫: 30℃，檢測(cè)波長(zhǎng):320 nm，進(jìn)樣量:10 μL。在此條件下，供試品中阿魏酸較好色譜峰，峰型良好。色譜圖見(jiàn)圖1—2。

圖1 黃芪甲苷H PLC色譜圖

圖2 阿魏酸H PLC色譜圖

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 黃芪甲苷:精密稱取干燥至恒重的黃芪甲苷對(duì)照品10.0 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，即得。阿魏酸:精密稱取干燥至恒重的阿魏酸對(duì)照品81.0 mg，置150 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻?yàn)閮?chǔ)備液。精密吸取1.0 mL，置25 mL棕色瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得阿魏酸含量為0.0216 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 黃芪甲苷:取水提醇沉液2.0 mL，加入2 mL水飽和后的正丁醇，渦旋1分鐘，3 500 r/min離心5分鐘，分取上層正丁醇液1.0 mL于另一試管中。將剩下的溶液重復(fù)提取3次，合并正丁醇液，加入5 mL氨試液，渦旋1分鐘，3 500 r/min離心5分鐘，分離棄去氨水層，重復(fù)提取3次后，正丁醇層85℃水浴氮?dú)獯蹈?，加?00 μL甲醇復(fù)溶后，即得。阿魏酸:取水提醇沉液0.5 mL，精密加入1.5 mL甲醇，搖勻，稀釋液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，棄去初濾液，收集續(xù)濾液即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 取黃芪甲苷甲醇儲(chǔ)備液，加甲醇稀釋，制成濃度為5.72、3.432、1.716、0.858、0.343、0.103 μg/mL的對(duì)照品溶液。分別取10 μL進(jìn)樣，測(cè)定黃芪甲苷峰面積。精密移取“2.1.2”項(xiàng)下的阿魏酸對(duì)照品儲(chǔ)備液5.0、3.0、1.5、0.5、0.2、0.1 mL置25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得濃度為50.756、30.454、15.227、5.076、2.030、1.015 μg/mL的對(duì)照品溶液。分別取10 μL進(jìn)樣，測(cè)定阿魏酸峰面積。以峰面積為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與相關(guān)系數(shù)與測(cè)定范圍見(jiàn)表1。

表1 黃芪甲苷與阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及測(cè)定范圍

2.1.5 供試品的測(cè)定 將水提醇沉溶液按“2.1.3”項(xiàng)下方法分別制備黃芪甲苷與阿魏酸的供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，以10 μL進(jìn)樣，分別測(cè)定黃芪甲苷與阿魏酸的峰面積，代入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，乘以稀釋(或濃縮)倍數(shù)即得其水提醇沉液中黃芪甲苷與阿魏酸濃度。

2.1.6 精密度和重復(fù)性 分別將黃芪甲苷與阿魏酸對(duì)照品溶液重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算黃芪甲苷、阿魏酸的RSD分別為1.26%和1.51%，說(shuō)明精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取黃芪甲苷與阿魏酸對(duì)照品溶液與其水提醇沉提取液樣品，分別在0、1、2、6、12、24小時(shí)分別測(cè)定峰面積。照“2.1.1”色譜條件，進(jìn)樣分析，分別求得在24小時(shí)內(nèi)黃芪甲苷與阿魏酸對(duì)照品溶液的峰面積的RSD值分別為1.47%、2.13%，結(jié)果表明在24小時(shí)內(nèi)樣品溶液該3組分的含量是穩(wěn)定的。

2.1.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密量取已知含量(黃芪甲苷0.338 mg/L，阿魏酸99.96 mg/L)的同批提取液5 mL，共9份。各精密加入混合對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算黃芪甲苷低、中、高質(zhì)量濃度加樣回收率分別為85.92%、91.83%、89.02%，RSD分別為1.67%、2.39%、2.63%，阿魏酸低、中、高質(zhì)量濃度加樣回收率為92.04%、87.68%、93.78%，RSD分別為2.70%、1.32%、3.55%。

2.2 提取工藝的優(yōu)化［2］

2.2.1 當(dāng)歸揮發(fā)油

2.2.1.1 因素水平設(shè)計(jì) 以當(dāng)歸揮發(fā)油得率為指標(biāo)，運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)影響當(dāng)歸提取主要因素:加水倍數(shù)、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間進(jìn)行考察，按正交表L9(34)進(jìn)行優(yōu)選，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

2.2.1.2 當(dāng)歸揮發(fā)油得率 當(dāng)歸按2010年版《中國(guó)藥典》一部附錄XD揮發(fā)油測(cè)定法甲法操作提取揮發(fā)油，藥渣再與其余藥材進(jìn)行水提醇沉。

揮發(fā)油得率(%)=揮發(fā)油體積(mL)/樣品質(zhì)量(g)

2.2.1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析 按正交實(shí)驗(yàn)表2各因素和水平制備的9份提取液其當(dāng)歸揮發(fā)油得率結(jié)果見(jiàn)表3，其揮發(fā)油得率方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

表4 方差分析(當(dāng)歸揮發(fā)油得率)

由表3結(jié)果直觀分析以及表4方差分析可知因素C(提取時(shí)間)對(duì)該提取過(guò)程的影響最大，其P值小于0.01，為重要影響因素。因素A、B(浸泡時(shí)間、加水倍數(shù))對(duì)當(dāng)歸揮發(fā)油得率的影響相當(dāng)，為該提取過(guò)程的主要因素。故將煎煮條件定為C3A2B3，即用提取時(shí)間12小時(shí)，浸泡時(shí)間24小時(shí)、加水量10倍。

2.2.2 黨參與黃芪

2.2.2.1 因素水平設(shè)計(jì) 以黃芪甲苷和阿魏酸含量為指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)影響本方藥品的主要因素含醇量、加水倍數(shù)、煎煮時(shí)間進(jìn)行考察，選用按正交表L9(34)進(jìn)行優(yōu)選，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表5。

表5 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

2.2.2.2 黃芪甲苷與阿魏酸含量的測(cè)定 黃芪甲苷與阿魏酸含量按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定。

2.2.2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析 按正交實(shí)驗(yàn)表5各因素和水平制備的9份該方口服液其黃芪甲苷與阿魏酸含量結(jié)果見(jiàn)表6，兩者方差分析結(jié)果見(jiàn)表7。

表6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

表7 綜合評(píng)分方差分析

由表6結(jié)果直觀分析以及表7方差分析可知，以綜合評(píng)分為指標(biāo)時(shí)，A因素為主要影響因素，B、C因素為影響不明顯，其最佳組合為A2B1C2，即加水倍數(shù)10倍、煎煮時(shí)間20分鐘、含醇量70%。2.2.3 工藝驗(yàn)證 按照正交實(shí)驗(yàn)篩選的提取工藝條件進(jìn)行5批次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示黃芪甲苷與阿魏酸含量的平均為0.337、110.23 μg/mL，結(jié)果表明正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選確定的工藝條件合理、穩(wěn)定、可行。

3 討論

多指標(biāo)的正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分析方法有綜合平衡法和綜合評(píng)分法。綜合平衡法是對(duì)各個(gè)指標(biāo)，分別進(jìn)行方差分析，找出其因素水平的最優(yōu)組合，再根據(jù)各指標(biāo)重要性、因素主次、水平優(yōu)劣等進(jìn)行綜合平衡，最后確定整體最優(yōu)組合。而綜合評(píng)分法是將每個(gè)實(shí)驗(yàn)所得各指標(biāo)實(shí)測(cè)值轉(zhuǎn)化成一個(gè)總評(píng)分，然后以此評(píng)分作為單指標(biāo)來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析［3］。本實(shí)驗(yàn)中，分別選取黃芪甲苷、阿魏酸作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，同時(shí)通過(guò)綜合評(píng)分法優(yōu)選出最佳組合。黃芪為本方君藥，其中黃芪甲苷常作為黃芪藥材和含黃芪中成藥的指標(biāo)成分，具有免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤作用［4-6］。因此在本實(shí)驗(yàn)的綜合評(píng)分中，設(shè)定其主要活性成分黃芪甲苷所占權(quán)重系數(shù)為60%，阿魏酸為40%，從而確定A2B1C2為最佳工藝提取條件。通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明此工藝條件合理、穩(wěn)定、可行。相關(guān)研究［7］表明:當(dāng)歸的主要有效成分為當(dāng)歸多糖、阿魏酸和揮發(fā)油等，這些成分具有重要的藥理活性，可促進(jìn)機(jī)體免疫，抑制血小板聚集，對(duì)子宮有較強(qiáng)的抑制作用。本研究以當(dāng)歸中主要活性成分揮發(fā)油和阿魏酸分別作為該制劑生產(chǎn)工藝中不同步驟的評(píng)價(jià)指標(biāo)，較之以阿魏酸為單一評(píng)價(jià)指標(biāo)，更有利于當(dāng)歸的有效成分在制劑中保存。

［1］ 朱克旭，李永宏，劉冰冰.H PLC-ELSD法測(cè)定芪心合劑中黃芪甲苷的含量［J］.安徽醫(yī)藥，2011，15(11):1364-1365.

［2］ 張丕德，龍曉英.正交設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析在藥學(xué)研究中的應(yīng)用［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，25(5):546-551.

［3］ 張麗，姜華，郭敏.中風(fēng)顆粒處方藥材的醇提工藝研究［J］.西部中醫(yī)藥，2015，28(4): 36-38.

［4］ 凌峰，薛博瑜，柳璋璞，等.黃芪、苦參、知母配伍方體外抗腫瘤細(xì)胞作用研究［J］.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，30(6):400-402.

［5］ 杜娟，陳敏珠.黃芪總提物抗腫瘤作用及其機(jī)制研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2006，21(12): 771-772.

［6］ 王儉，胡溪恬，劉巧.黃芪注射液影響人惡性黑色素瘤細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究［J］.吉林中醫(yī)藥，2015，35(4):407-414.

［7］ M aRJ，W angQ，ChenX L，etal.Research and devel opm ent of A ngel i ca si nensi s (O l i v.)D i el s［J］.Chi n Tradi t H erb M ed，2002，33(3):280-288.

Multi-index Optimization Method on the Process of Extraction and Purification for BuQi ShengXue Oral Liquid

CHEN Lu,LI Jinqi,BIAN Yuan,HU Yuan
Medical Academy in Sichuan.Sichuan Provinical People′s Hospital,Chengdu 610072,China

Objective：Using multi-index to control,and using orthogonal design for the process of extraction and purification for BuQi ShengXue oral liquid.Methods：Essential oil from DangGui(angelica sinensis)was taken as index,orthogonal design was adopted to select the optimal process for aromatic water extracted from DangGui;then, composite score of astraloside and fumalic acid as index,the process of extraction and purification for the residue of DangGui,HuangQi(astragalus)and DangShen(codonopsis)were optimized by orthogonal design.Results：The best condition of essential oil extracted from DangGui was extracting time 12 hours,soak time 24 hours,add-water quantity ten times.The best extraction condition of the process of extraction and purification for DangGui residue, HuangQi and DangShen were add-water quantity ten times,decoction time 20 minutes and the level of alcohol 70%. Conclusion：This process was steady and feasible,it provides experimental basis for improving the stable quality of BuQi ShengXue oral liquid and clinical medication safety.

BuQi ShengXue oral liquid;orthogonal design;astraloside;fumalic acid;essential oil ratio

R284.2

A

1004-6852(2016)10-0040-04

2016-03-27

四川省中醫(yī)藥管理局青年中醫(yī)藥課題(編號(hào)2010-64);四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院2014年苗圃計(jì)劃項(xiàng)目。

陳璐(1975—)，女，副主任藥師。研究方向:中藥制劑質(zhì)量分析及治療藥物監(jiān)測(cè)。