朱翔，曹蘇，秦毅彬，佘慶，丁晶晶，楊建平

(1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 麻醉科，江蘇 蘇州 215006；2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院 麻醉科，江蘇 南通 226001)

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·論 著·

吡那地爾對(duì)術(shù)后持續(xù)性疼痛大鼠脊髓JNK/MCP-1釋放的影響

朱翔1，曹蘇2，秦毅彬2，佘慶2，丁晶晶2，楊建平1

(1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 麻醉科，江蘇 蘇州 215006；2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院 麻醉科，江蘇 南通 226001)

目的：觀察吡那地爾(pinacidil)對(duì)術(shù)后持續(xù)性疼痛大鼠脊髓JNK/MCP-1釋放的影響。方法:隨機(jī)將35只大鼠分為正常組(Control組)、假手術(shù)組(Sham組)、切割+牽拉皮膚肌肉組(SMIR組)、溶劑+SMIR組(Vehicle組)、吡那地爾+SMIR(Pina組)、吡那地爾+格列苯脲+SMIR組(Pina+Gli組)、格列苯脲+SMIR組(Gli組)等7組。檢測(cè)各組機(jī)械刺激縮足反射痛閾值(MWT)，Western blot/ELISA法檢測(cè)脊髓JNK/MCP-1蛋白表達(dá)。結(jié)果：(1) 與Sham組相比，SMIR組MWT在術(shù)后3 d開始降低(P<0.01)，并持續(xù)21 d(P<0.001)以上；(2) SMIR術(shù)后持續(xù)顯著上調(diào)脊髓JNK/MCP-1的表達(dá)(P<0.01)；(3) 鞘內(nèi)注射吡那地爾顯著下調(diào)術(shù)后SMIR誘導(dǎo)的脊髓JNK/MCP-1表達(dá)(P<0.01)和上調(diào)MWT(P<0.01)，格列苯脲能阻斷吡那地爾所引起的上述變化(P<0.05)。結(jié)論：吡那地爾能抑制切割及牽拉皮膚肌肉所致的術(shù)后持續(xù)性疼痛，其機(jī)制可能與抑制JNK/MCP-1的上調(diào)有關(guān)。

術(shù)后持續(xù)性疼痛；吡那地爾；JNK/MCP-1；脊髓；大鼠

臨床上10%～50%的患者隨著術(shù)后炎癥的消退或者組織痊愈，存在術(shù)后慢性持續(xù)性疼痛[1]，因此術(shù)后急性痛轉(zhuǎn)為慢性痛機(jī)制的研究成為重要課題之一。ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive potassium,KATP)廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜興奮性和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)起到保護(hù)作用，激活KATP可介導(dǎo)鎮(zhèn)痛作用[2-3]。c-Jun氨基末端激酶(JNK)在脊髓星狀膠質(zhì)細(xì)胞持續(xù)激活可產(chǎn)生中樞敏化，JNK/MCP-1的活化是神經(jīng)病理性痛形成的關(guān)鍵，抑制其活化可減輕痛覺過敏[4]。本研究觀察KATP開放劑吡那地爾對(duì)術(shù)后持續(xù)性疼痛大鼠脊髓JNK/MCP-1變化的影響，探討激活KATP產(chǎn)生鎮(zhèn)痛的作用及其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究經(jīng)南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。SPF級(jí)SD雄性大鼠35只南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2008-0010，鼠齡7～9周，質(zhì)量200～250 g。

1.2 主要儀器、藥品、材料

0.25%二甲基亞砜、多聚甲醛、吡那地爾、格列苯脲(美國Sigma公司)，胰蛋白酶(中國華美生物工程公司)，異氟烷(英國RHODIA公司)，von Frey纖毛刺激儀(美國North Coast Medical公司)，電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國Bio-Rad Laboratories公司)，熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀器(美國Eppendorf公司)，凝膠成像系統(tǒng)(中國北京原平皓生物技術(shù)有限公司)，動(dòng)物麻醉機(jī)(美國A.M.BICKFORD INC公司)，ELX8W酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國BioTek公司)，電動(dòng)勻漿器(美國Biospec Products INC公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及處理 隨機(jī)將大鼠分7組，即正常組(Control組)、假手術(shù)組(Sham組)、切割+牽拉皮膚肌肉組(SMIR組)、溶劑+SMIR組(Vehicle組)、吡那地爾+SMIR(Pina組)、吡那地爾+格列苯脲+SMIR組(Pina+Gli組)、格列苯脲+SMIR組(Gli組)，每組5只。正常組不做任何處理；Sham組僅切割皮膚、肌肉1 h；SMIR組切割+牽拉皮膚、肌肉1 h；Vehicle組在SMIR術(shù)后7 d鞘內(nèi)注射等體積0.25%二甲基亞砜；Pina組在SMIR術(shù)后7 d鞘內(nèi)注射4 μg·kg-1或20 μg·kg-1吡那地爾；Pina+Gli組在SMIR術(shù)后7 d鞘內(nèi)注射20 μg·kg-1吡那地爾+20 μg·kg-1格列苯脲；Gli組在SMIR術(shù)后7 d鞘內(nèi)注射20 μg·kg-1格列苯脲。各組動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3.2 大鼠SMIR模型的建立 按Flatters法[5]建立大鼠SMIR模型。麻醉后仰臥大鼠，在大腿中部隱靜脈內(nèi)側(cè)3～4 mm處做2 cm切口，暴露肌肉，然后在淺層肌肉(股薄肌)處做一長約8 mm切口，鈍性分離肌肉，撐開器拉開至2 cm，1 h后縫合皮膚肌肉，見圖1。

圖1 大鼠SMIR模型手術(shù)示意圖

1.3.3 行為學(xué)檢測(cè) 測(cè)定各組術(shù)前及術(shù)后機(jī)械刺激縮足反射痛閾值(MWT)，測(cè)試之前各組大鼠適應(yīng)環(huán)境3 d。測(cè)試時(shí)大鼠放置有機(jī)玻璃的金屬篩網(wǎng)上適應(yīng)30 mim，剛度呈對(duì)數(shù)遞増(1.4～26 g)的von Frey纖毛刺激儀垂直刺激術(shù)側(cè)后肢爪底，持續(xù)時(shí)間≤4 s,出現(xiàn)縮爪、甩爪、舔爪等現(xiàn)象視為陽性反應(yīng)，否則為陰性，記錄5次結(jié)果，有2次或2次以上反應(yīng)則為機(jī)械性觸誘發(fā)痛。若出現(xiàn)小于2次陽性反應(yīng)，則使用高一級(jí)別力度刺激，若2次或以上陽性反應(yīng)則給予低一級(jí)別力度刺激。連續(xù)實(shí)施刺激，直到出現(xiàn)1次陽性和陰性反應(yīng)騎跨，記錄數(shù)值，然后再測(cè)量5次，每次間隔30 s。

1.3.4 脊髓鞘內(nèi)注射藥物 應(yīng)用異氟烷吸入麻醉，備皮消毒，在第3、4或第4、5腰椎棘突間使用29gauge(B-D公司)注射針，注射20 μl的藥物到大鼠蛛網(wǎng)膜下隙，穿刺是否成功主要觀察大鼠在穿刺時(shí)尾巴突然出現(xiàn)顫動(dòng)或向側(cè)方甩動(dòng)。

1.3.5 ELISA法 術(shù)后第10天鞘內(nèi)注藥并測(cè)定機(jī)械痛閾后，腹腔注射4%水合氯醛(400 mg·kg-1)深麻醉大鼠，取左側(cè)L 3～5脊髓節(jié)段，加入裂解液，冰上充分勻漿，離心后收集上清液。按照每孔200 mg的量與ddH2O配成100 μl總體積，稀釋10倍后按照試劑盒說明書操作，檢測(cè)各組脊髓組織中MCP-1的含量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算實(shí)際質(zhì)量濃度，以ng·L-1表示。

1.3.6 Western blot 腹腔注射10%水合氯醛400～500 mg·kg-1麻醉，取脊髓腰膨大L 3～5節(jié)段組織，加入蛋白裂解液勻漿，收集細(xì)胞裂解液0.2 ml，離心提取總蛋白，蛋白變性，4 ℃保存。每孔上樣量含30 μg總蛋白行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，電泳后轉(zhuǎn)膜于0.2 μm PVDF膜，以含5%脫脂奶粉的TBST封閉液室溫封閉2 h。4 ℃過夜，加入以封閉液稀釋的JNK(蘇氨酸183/酪氨酸185)(兔，1∶1 000稀釋，CST，9251)一抗，4 ℃孵育過夜。用TBST洗10 min 3次，用相應(yīng)二抗(Bioworld，1∶2 000)室溫孵育2 h，漂洗后應(yīng)用化學(xué)發(fā)光底物試劑盒在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行檢測(cè)。使用Image J圖像軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，GAPDH為內(nèi)參照，各組目的蛋白與各組內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示各組目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間的比較采取單因素方差分析(One way ANOVA)，兩兩間的比較采用t檢驗(yàn)(Student’sttest)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SMIR誘導(dǎo)快速機(jī)械觸誘發(fā)痛

SMIR術(shù)后，大鼠手術(shù)側(cè)后爪的MWT從術(shù)后3 d開始下降(P<0.01)，并維持至21 d(P<0.001)。SMIR組的MWT在所有時(shí)間點(diǎn)上顯著低于假手術(shù)組(P<0.001)。見圖2。

與Sham組比較，aP<0.01; bP<0.001。BL.術(shù)前基礎(chǔ)值

圖2 SMIR誘導(dǎo)的大鼠機(jī)械痛敏時(shí)程的變化

Fig 2 Time course of SMIR-induced mechanical allodynia in rats

2.2 SMIR持續(xù)上調(diào)脊髓P-JNK和MCP-1的表達(dá)

與正常組比較，SMIR組術(shù)后3、7、14 d脊髓中P-JNK和MCP-1的表達(dá)持續(xù)增高(P<0.05、0.01、0.001)。見圖3。

2.3 鞘內(nèi)注射吡那地爾上調(diào)MWT

SMIR術(shù)后7 d，鞘內(nèi)注射吡那地爾呈劑量依賴性顯著拮抗由SMIR誘導(dǎo)MWT下降，作用時(shí)間持續(xù)2 h以上，但吡那地爾的鎮(zhèn)痛作用可被格列本脲拮抗(P<0.05)，而溶劑組無顯著影響，見圖4。

與Control組比較，aP<0.05; bP<0.01; cP<0.001

圖3 SMIR持續(xù)上調(diào)脊髓P-JNK/MCP-1的表達(dá)

Fig 3 SMIR induced a persistent p-JNK/MCP-1 increase in the spinal cord

與Vehicle組比較，aP<0.05,bP<0.01; 與Pina 20 μg組比較，cP<0.05。BL.術(shù)前基礎(chǔ)值

圖4 鞘內(nèi)注射吡那地爾上調(diào)MWT

Fig 4 Intrathecal administration of Pina inhibits mechanical allodynia after SMIR

2.4 鞘內(nèi)注射吡那地爾下調(diào)P-JNK和MCP-1的表達(dá)

與Control組相比，Vehicle組P-JNK和MCP-1的表達(dá)顯著增加(P<0.01或0.001)，Pina組無顯著差異；與Vehicle組相比，Pina組P-JNK和MCP-1的表達(dá)顯著降低(P<0.01)。見圖5。

與Control組比較，aP<0.01,bP<0.01;與Vehicle組比較，cP<0.01

圖5 鞘內(nèi)注射吡那地爾下調(diào)P-JNK/MCP-1的表達(dá)

Fig 5 Intrathecal administration of Pina downregulates P-JNK/MCP-1 activation after SMIR

3 討 論

本研究根據(jù)文獻(xiàn)建立大鼠SMIR術(shù)后持續(xù)性疼痛模型，能較長時(shí)間牽拉皮膚和肌肉組織而不損傷其周圍外周神經(jīng)，從而能模擬切口周圍炎性微環(huán)境的特點(diǎn)和術(shù)后持續(xù)性疼痛過程，術(shù)后主要表現(xiàn)為持續(xù)機(jī)械痛覺超敏，術(shù)后MWT呈時(shí)間依賴性顯著下降(圖2)，表明大鼠術(shù)后持續(xù)性疼痛模型制備成功。

離子通道在疼痛信號(hào)的產(chǎn)生和傳導(dǎo)中起重要作用[6]。近來一些實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，K+通道的一個(gè)亞族KATP離子通道在疼痛的發(fā)生和發(fā)展過程中也起著積極和關(guān)鍵的作用。KATP通道廣泛分布在中樞神經(jīng)元系統(tǒng)，其作用主要是調(diào)節(jié)細(xì)胞膜興奮性和神經(jīng)遞質(zhì)釋放，同時(shí)還起著神經(jīng)保護(hù)作用。它的活化通過調(diào)節(jié)細(xì)胞電活動(dòng)[7]、增加ATP的合成[8]、減少自由基[9]、防止Ca2+超載和維持線粒體功能[10]等多種機(jī)制改善微環(huán)境參與預(yù)適應(yīng)保護(hù)。超敏疼痛的大鼠KATP開放被抑制[6，11]。但KATP通道的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制的研究目前還很少。

JNK家族是促分裂原活化蛋白激酶超家族成員之一，JNK的激活可誘導(dǎo)脊髓產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)和釋放，如一氧化氮合酶、環(huán)氧合酶等，JNK的激活也能誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)和釋放，從而產(chǎn)生中樞敏化[2]。JNK是MAPK信號(hào)通路中的關(guān)鍵亞族，在疼痛的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。在SNL模型中，磷酸化的JNK(活性形式)已被證明在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。JNK的活化又可使脊髓MCP-1大量表達(dá)，從而活化膠質(zhì)細(xì)胞，MCP-1通過趨化因子受體2(CC chemokinereceptor2，CCR2)的介導(dǎo)參與慢性疼痛的形成和維持[12-13]。在本研究中，SMIR持續(xù)上調(diào)術(shù)后脊髓JNK/MCP-1的表達(dá)(圖3)，激活脊髄JNK/MCP-1信號(hào)產(chǎn)生中樞敏化，從而參與疼痛。SMIR術(shù)后7 d鞘內(nèi)注射KATP開放劑吡那地尓后，顯著抑制脊髓JNK/MCP-1的表達(dá)激活(圖5)，下調(diào)機(jī)械性觸誘發(fā)痛(圖4)，而吡那地爾的阻滯劑格列苯脲能夠阻滯這一鎮(zhèn)痛作用，表明激活KATP通過抑制脊髄JNK/MCP-1信號(hào)活性產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。

本研究表明，KATP通道開放劑是減輕術(shù)后疼痛的有效方法。這種影響可能是通過JNK/MCP-1通路的激活介導(dǎo)的，作為KATP通道可能在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞不同的功能作用，需要進(jìn)一步的研究來探討?？傊?，KATP通道可作為術(shù)后疼痛治療的有效靶點(diǎn)。

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Effect of pinacidil on JNK/MCP-1 expression in spinal cord of a rat model of persistent postoperative pain

ZHU Xiang1，CAO Su2，QIN Yi-bin2，SHE Qing2，DING Jing-jing2，YANG Jian-ping1

(1.DepartmentofAnesthesiology，theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity，Suzhou215006，China;2.DepartmentofAnesthesiology，AffiliatedHospitalofNantongUniversity，Nantong226001，China)

Objective：To observe the effect of pinacidil on JNK/MCP-1 expression in spinal cord of a rat model of persistent postoperative pain.Methods：SD rats were divided into 7 groups randomly:control group(Control group), sham operation group (Sham group), skin/muscle incision and retraction group (SMIR group), vehicle +SMIR group (Vehicle group), pinacidil+SMIR (Pina group), pinacidil+ glibenclamide +SMIR group (Pina+Gli group) and glibenclamide +SMIR group (Gli group).The mechanical withdrawal threshold (MWT) of the left hind paw of rats in different group was measured at different time points after the surgery.Western blot/ELISA were used to measure the protein expression level of JNK/MCP-1.Results：(1) Compared with Sham group，MWT in SMIR group was reduced significantly from 3 d after the operation (P<0.01)，and lasted for more than 21 d (P<0.001).(2) The protein expression of JNK/MCP-1 were significantly increased after SMIR as compared with the control group(P<0.01).(3) Intrathecal injection of pinacidil attenuated the express of JNK/MCP-1 in the spinal cord (P<0.01) and up-regulated the MWT (P<0.01)，which could be blocked by glibenclamide (P<0.05).Conclusion：Pinacidil inhibits the persistent postoperative pain caused by SMIR.The mechanisms may be partly due to the inhibition of JNK/MCP-1 upregulation．

persistent postoperative pain; pinacidil; JNK/MCP-1; spinal cord; rats

2016-03-29

2016-05-20

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81400915)；南通大學(xué)附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)基地科研項(xiàng)目(TDFzh2014013)

朱翔(1978-)，男，江蘇南通人，在讀醫(yī)學(xué)博士研究生。E-mail:bobofly8850@sina.com

楊建平 E-mail:szyangjp@126.com

朱翔，曹蘇，秦毅彬，等.吡那地爾對(duì)術(shù)后持續(xù)性疼痛大鼠脊髓JNK/MCP-1釋放的影響[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2016，35(5)：678-682.

R-332; R972.4

A

1671-6264(2016)05-0678-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2016.05．007