沈 輝， 萬夕和， 蔣 葛， 黎 慧， 喬 毅， 孫瑞健，王李寶， 凌 云， 史文軍， 何培民*

(1.上海海洋大學(xué) 生命與水產(chǎn)學(xué)院，上海 201306；2.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007)

?

1株灘涂沉積物反硝化細菌的鑒定及其性能研究

沈 輝1，2， 萬夕和2， 蔣 葛1， 黎 慧2， 喬 毅2， 孫瑞健2，王李寶2， 凌 云2， 史文軍2， 何培民1*

(1.上海海洋大學(xué) 生命與水產(chǎn)學(xué)院，上海 201306；2.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007)

利用富集培養(yǎng)法從江蘇沿海灘涂沉積物中分離篩選獲得1株具有反硝化性能的細菌，命名為MD5。通過形態(tài)學(xué)觀察、糖發(fā)酵及16S rDNA序列分析對其進行了分類鑒定、系統(tǒng)發(fā)育地位及反硝化性能等方面的研究。結(jié)果表明，該菌株能在厭氧條件下利用硝酸鈉進行反硝化反應(yīng)，在初始硝酸鹽質(zhì)量濃度為1 500 mg/L、30 ℃培養(yǎng)條件下，144 h后培養(yǎng)基中硝酸鹽脫除率可達90.1%；在好氧培養(yǎng)條件下，該菌株可使能力測試管中硝酸鹽質(zhì)量濃度下降89.3%。菌株MD5的形態(tài)學(xué)、糖發(fā)酵結(jié)果與鹽單胞菌一致，且基因序列與鹽單胞屬(Halomonas)細菌Halomonassp. IW11-1 (AB305262.1)的序列同源性達到99%，表明菌株MD5為1株鹽單胞屬細菌。本研究分離得到的菌株MD5在厭氧和好氧條件下均具有較強的反硝化能力，對海洋沉積物脫氮具有一定的意義。

反硝化細菌；鹽單胞菌；脫氮

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基(g) ①富集培養(yǎng)基：參照張玉芹等[16]方法并做部分調(diào)整，成分如下：K2HPO40.4，MgSO40.1，Na2HPO40.6， CH3COONa 3,NH4Cl 1.0，KNO31.0，F(xiàn)eCl20.1，酵母膏0.5，葡萄糖10，陳海水1 L；②分離純化培養(yǎng)基：蛋白胨10，酵母膏5，葡萄糖1，陳海水1 L；③能力測試液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，葡萄糖1 g，KNO31.5，陳海水1 L。

1.1.2 主要試劑及儀器 蛋白胨、酵母膏等試劑購自上海國藥公司；GeneScience AG25厭氧培養(yǎng)罐；Nikon E200生物光學(xué)顯微鏡；飛利浦CM100電子顯微鏡；ABI 9600核酸擴增儀；Lachat flow injection analyzer QC8500流動注射分析儀。

1.2 方法

1.2.1 采樣與富集培養(yǎng) 取5 cm深度的亞表層海洋沉積物放入無菌采樣袋，置于采樣箱里帶回實驗室。取20 g沉積物置于1 L滅菌海水中振蕩1 h后，將懸液加入到富集培養(yǎng)基中，取3 mL懸液加入300 mL富集培養(yǎng)基。培養(yǎng)7 d后，取1 mL培養(yǎng)液接種于200 mL新鮮的富集培養(yǎng)液中，反復(fù)3次后，將培養(yǎng)物在分離純化固體培養(yǎng)基上進行稀釋涂布，并在厭氧罐中進行厭氧培養(yǎng)。

1.2.2 菌株分離、篩選 將涂布得到的菌落在分離純化培養(yǎng)基中進行再次純化，直至菌落清晰、單一。將得到的純化菌株接種到能力測試管中，并用石蠟覆蓋液面，隔絕氧氣。將能力測試管于30 ℃培養(yǎng)3 d，根據(jù)能力測試管中產(chǎn)氣量的多少進行復(fù)篩，蘸取培養(yǎng)物在分離固體培養(yǎng)基上進行劃線培養(yǎng)。

1.2.3 菌株鑒定 ①光學(xué)顯微觀察：對篩選得到的菌株進行革蘭染色，顯微觀察并拍照。②糖發(fā)酵實驗：按伯杰氏細菌鑒定手冊(第8版)中方法，對菌株的半乳糖、山梨糖、蔗糖等進行發(fā)酵實驗。③電子顯微觀察：將MD5滴加在覆有Formver膜的銅網(wǎng)上，約5 min后從銅網(wǎng)邊緣吸去多余液體，室溫風(fēng)干，滴加濃度2%、pH 7.2的磷鎢酸負染5 min，用濾紙吸去多余染液，室溫風(fēng)干，于透射電鏡下觀察攝片。④分子生物學(xué)鑒定：篩選菌株DNA提取采用上海生工生物工程公司的細菌DNA提取試劑盒(SK8225)。菌株的16S rDNA擴增上、下游引物為27F及1492R(27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反應(yīng)體系為25 μL，即DNA模板1.5 μL，Taq酶0.5 U，dNTP混合液(各2.5 mmol/L)2 μL，10×buffer 2.5 μL，正反向引物(10 pmol/L)各1 μL，超純水補至25 μL。PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性60 s， 50 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物直接測序，由上海生工生物工程有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 灘涂反硝化細菌的篩選

Table 1 The nitrate nitrogen concentration changes in different culture tube

菌株編號NO-3?N/(mg·L-1)降解率/%MD159．23±1．4560．51±0．97MD279．87±9．3546．75±6．23MD3113．67±8．2324．22±5．48MD476．45±4．2249．03±2．81MD515．89±1．3489．41±0．89

2.2 菌株MD5的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征 由圖1可知，菌株MD5在分離純化培養(yǎng)基上的菌落呈淺黃色，表面光滑，半透明，凸起呈圓形，革蘭染色陰性，菌體呈短桿狀，分散排列。由透射電鏡負染照片可見，細胞形態(tài)為桿狀，大小為(0.4～0.6) μm×(0.8～1.2) μm，有周生鞭毛。

圖1 菌株MD5的形態(tài)觀察Fig.1 Morphology of MD5

2.2.2 糖發(fā)酵實驗 對菌株MD5進行糖發(fā)酵實驗，半乳糖、山梨糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖及核糖反應(yīng)陰性，菊糖反應(yīng)陽性。

2.2.3 16S rDNA同源性比對及系統(tǒng)發(fā)育分析 對菌株MD5的16S rDNA序列進行PCR擴增，得到約1 500 bp的DNA片段，將目的片段的DNA膠回收后進行測序分析，測序結(jié)果提交GenBank進行Blast檢索，與鹽單胞菌屬Halomonassp. IW11-1 (AB305262.1)菌株的同源性達到99%，得到序列編號為KM362826。另外將序列提交至http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp比對發(fā)現(xiàn)，該菌株同樣為鹽單胞屬細菌。系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，菌株MD5與鹽單胞屬細菌聚類到一個分支，與反硝化細菌類的色桿菌屬Chromobacterium細菌及鹽芽胞桿菌屬Halobacillus細菌分別聚類在不同的分支上(圖2)。因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)、糖發(fā)酵及分子比對結(jié)果，將菌株MD5鑒定為鹽單胞菌屬細菌。

2.3 菌株MD5的反硝化特征

厭氧條件下，120 h后MD5能力測試管中硝酸鹽質(zhì)量濃度下降可達90.1%，且在培養(yǎng)過程中，產(chǎn)生大量氣泡，而對照管中未見氣泡產(chǎn)生。經(jīng)144 h能力測試后表明，菌株MD5在厭氧條件下具有很強的反硝化活性，能有效去除海水中的硝酸鹽(圖3)。另外，菌株MD5在0～3 h未出現(xiàn)明顯的生長趨勢為生長延滯期，培養(yǎng)基中硝酸鹽質(zhì)量濃度變化較小。24～72 h為菌落指數(shù)生長期，測試管中硝酸鹽質(zhì)量濃度下降顯著。

圖3 菌株MD5在厭氧條件下的生長情況及硝酸鹽去除效果Fig.3 Growth of MD5 and removal of nitrate-N under the anaerobic conditions

在好氧條件下，菌株MD5測試管中同樣有大量氣泡產(chǎn)生，對照管中也未見氣泡產(chǎn)生，144 h后測試管中硝酸鹽質(zhì)量濃度下降89.3%(圖4)。結(jié)果表明，菌株MD5在好氧條件下同樣能利用測試培養(yǎng)基中的硝酸鹽，具有較強的反硝化活性。

圖4 菌株MD5在好氧條件下的生長情況及硝酸鹽去除效果Fig.4 Growth of MD5 and removal of nitrate-N under the aerobic conditions

3 討 論

早期理論認為，反硝化作用只能在嚴格厭氧條件下進行。自1984 年Robertson等[18]從反硝化系統(tǒng)中首次分離出好氧反硝化細菌以來，相繼大量報道了好氧反硝化細菌， 主要屬于紅球菌屬(Paracoccus)[19]、芽胞桿菌屬(Bacillus)[20]、假單胞菌屬(Pseudomonas)[21]、鹽單胞菌屬(Halomonas)等[22]。本研究中菌株MD5為鹽單胞菌屬細菌，屬于γ變形菌綱鹽單胞菌科(Halomonadaceae)，同樣在好氧條件下具有較強的反硝化能力。目前報道的鹽單胞菌屬細菌均生長在鹽度較高的海洋環(huán)境中，如海水[23]、鹽場[24]、鹽堿地[25]、鹽水濕地[26]等。

目前，對富營養(yǎng)化水體的生物修復(fù)報道較多，應(yīng)用較為廣泛的為日本琉球大學(xué)比嘉照夫發(fā)明的EM菌、美國Probiotic Solutions公司的Bio-energizer及美國Alken-Murry公司開發(fā)的Clear-flo等專利微生態(tài)制劑。利用微生物反硝化作用去除地下水中過量的硝酸鹽也有一定的研究報道[28-29]，但針對沉積物或土壤中硝酸鹽的去除研究較少。近年來，針對沉積物環(huán)境修復(fù)仍處在研究探索階段。劉詠等[30]從巢湖濕地土壤中分離篩選得到高效的異養(yǎng)反硝化細菌，結(jié)合蒲葦秸稈共同施用于硝酸鹽污染的土壤中，其硝酸鹽降解能力達到90%。全為民等[31]從長江沉積物中篩選分離出1株海洋反硝化細菌，模擬了該細菌對硝酸鹽氮的去除效率，室內(nèi)實驗證實細菌具有較強的反硝化作用。本研究從灘涂沉積物中分離得到菌株MD5，具有較強的反硝化及耐鹽能力，可應(yīng)用于海洋沉積物環(huán)境中的去營養(yǎng)化研究。

[1] 劉海洋，戴志軍. 中國近海污染現(xiàn)狀分析及對策[J]. 環(huán)境保護科學(xué)，2001，27(6)：6-9.

[2] 姜晟，李俊龍，李旭文，等．江蘇近岸海域富營養(yǎng)化評價與成因分析[J]．環(huán)境監(jiān)測管理與技術(shù)，2012，24(4)：26-29．

[3] Conley J, Stockenberg A, Carman R,et al.Sediment-water nutrient fluxes in the Gulf of Finland, Baltic Sea [J]. Estuarine, Coastal and Shelf Science,1997,45(5): 591-598.

[4] Wang D D, Sun Y, Shi X Y，et al. Distribution of different phosphorus forms in sediments of Eastern Rushan Bay[J].Acta Ecologica Sinica, 2008, 28(5): 2417-2423.

[5] Howarth RW. Comparative responses of aquatic ecosystems to toxic chemical stress [M]. In: Comparative analysis of ecosystems: patterns, mechanisms, and theories. Cole J.J., Findlay S., and Lovett G. (Ed.). Springer-Verlag, New York, USA,1991: 169-195.

[6] Cotner J B, Biddanda BA. Small players, large role: Microbial influence on biogeochemical processes in pelagic aquatic ecosystems[J].Ecosystems, 2002, 5(2): 105-121.

[7] Francis C A, Berman J M, Kuypers M M.New processes and players in the nitrogen cycle: the microbial ecology of anaerobic and archaeal ammonia oxidation[J].The ISME Journal, 2007,1(1): 19-27.

[8] 賀紀正，張麗梅．氨氧化微生物生態(tài)學(xué)與氮循環(huán)研究進展[J]．生態(tài)學(xué)報，2009,29(1)：706-715．

[9] 方芳，陳少華．功能基因在反硝化菌群生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用[J]．生態(tài)學(xué)雜志，2010,29(9)：1836-1845．

[10]Peng Y, Zhu G. Biological nitrogen removal with nitrification and denitrification via nitrite pathway [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, 73 (1): 15-26.

[11]Hicks B N. Bioremediation: A natural solution [J].Pollution Engineering, 1993, 25(2):30-33.

[12]鄭天凌,莊鐵城,蔡立哲,等. 微生物在海洋污染環(huán)境中的生物修復(fù)作用[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2001, 4 (2):524 -534.

[13]Nuhoglu A, Pekdemir T, Yildiz E, et al. Drinking water denitrification by a membrane bioreactor[J].Water Research, 2002, 36(5): 1155-1166.

[14]Ma Y, Peng Y Z, Wang X L. Improving nutrient removal of the AAO process by an influent bypass flow by denitrifying phosphorus removal[J].Desalination,2009,246(1-3):534-544.

[15]劉小英，林慧，馬兆瑞，等. 同步脫氮除磷顆粒污泥硝化反硝化特性試驗研究[J]. 環(huán)境科學(xué)，2014，35(1)：214-221.

[16]張玉芹，劉開啟，王革，等. 反硝化細菌的篩選及培養(yǎng)條件的研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2005，35(1)：165-168.

[17]閆海，林毅雄，孫建新. 海水微生物菌群去除銨氮和亞硝酸氮研究[J]. 環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備，2003，11(4)：44-47.

[18]Robertson L A, Kuenen J G. Aerobic Denitrification: A controversy Revised[J].Archives of Microbiology,1984,139(4): 351-354.

[19]張光亞，陳培欽．好氧反硝化菌的分離鑒定與特性研究[J]．微生物學(xué)雜志，2005，25(6): 23-26.

[20]于愛茸，李尤，俞吉安．一株耐氧反硝化細菌的篩選及脫氮性研究[J]．微生物學(xué)雜志，2005，25(3): 77-82.

[21]Bonin P, Gilewic M C. A direct demonstration of “co-respiration”of oxygen and nitrogen oxide by Pseudomonas nautical: some spectral and kinetic properties of the respiratory components [J]. FEMS Microbiology Letters, 1991, 80(2):183-188.

[22]Guo Y, Zhou X, Li Y, et al. Heterotrophic Nitrification and aerobic Denitrification by a NovelHalomonascampisalis[J]. Biotechnology. Letters., 2013, 35(12): 2045-2049.

[23]徐德強, 黃靜娟, 張紀忠, 等. 鹽單胞菌屬一新種黃海鹽單胞菌[J]. 微生物學(xué)報, 1995, 35(5):315-321.

[24]朱鳳玲，曲凌云，洪旭光，等. 鹽單胞菌屬一新種的分離與鑒定[J]. 海洋科學(xué)進展，2011，29(2)：221-228.

[25]Juan A M, Jose M C, Emilia Q, et al. A detailed Phenotypic Characterization of the Type Strains ofHalomonasSpecies [J]. Systemic and Applied Microbiology, 2002, 25(3): 360-375.

[26]Dobson S J, Franzmann P D. Unification of the genera Deleya (Baum an et al. 1993) ,Halomonas(Vreeland et al. 1980 ) , andHalovibrio(Fendrich 1988) and the speciesParacoccushalodenitrificans(Robinson and Gibbons 1952) in to a single genusHalomonas, and placement of the genusZymobacterin the familyHalomonadaceae[J]. International Journal of Systematic Bacteriology, 1996, 46(6):550-558.

[27]張培玉, 郭艷麗, 于德爽, 等. 一株輕度嗜鹽反硝化細菌的分離鑒定和反硝化特性初探[J]. 微生學(xué)通報, 2009, 36(4): 581-586．

[28]Dahab M F, Sirigina S. Nitrate removal from water supplies using biodenitrification and GAG-S and filter system [J]. Water Science Technology, 1994,30(9): 133-139.

[29]Bandpi M A, Elliott D J, Momeny-Mazdeh A. Denitrification of ground water using acetic acid as a carbon source [J]. Water Science and Technology, 1999,40(2): 53-59.

[30]劉詠，畢井輝，陳干，等．巢湖蘆葦濕地去除硝酸鹽污染的調(diào)查與分析[J]．合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010,33(3)：421-425．

[31]全為民，沈新強，甘居利，等．海洋沉積物中反硝化細菌的分離及去除硝酸鹽氮的模擬試驗[J]．海洋漁業(yè)，2005,27(3)：232-235．

Identification of a Denitro-Bacterium Strain from Low Beach Sediment

SHEN Hui1, 2, WAN Xi-he2, JIANG Ge1, LI Hui2, QIAO Yi2, SUN Rui-jian2, WANG Li-bao2, LING Yun2, SHI Wen-jun2, HE Pei-min1

(1.ShanghaiOceanUni.,Shanghai201306;2.JiangsuMarineFisheriesRes.Inst.,Nantong226007)

A denitrification-possessing bacterium strain was isolated and screened with enrichment culture method from low beach sediment in Jiangsu coastal area. Through morphological observation, sugar fermentation as well as 16S rDNA sequence analysis, the classification characterization, phylogenetic site, denitrifying performance, and other aspects of the strain was studied, and named it as MD5. The results showed that the isolated strain from oceanic sediment by enrichment, isolation, screening possessed fairly strong denitrification reaction, under the conditions of 30 ℃ with initial concentration of nitrate at 1 500 mg/L and after 144 h of cultivation, the nitrate in the medium could be removed by 90.1%; under the aerobic cultivation conditions the removal rate of concentration of nitrification acid mass declined to 89.3% in a ability test tube by the strain. The results of MD5 in morphology and sugar fermentation were in accord with that inHalomonas, in addition, the homology of its gene sequence was as high as 99% withHalomonassp. IW11-1(AB305262.1), suggested that was aHalomonasstrain. Strain MD5 obtained by isolation in this experiment had fairly strong denitrifying ability both under anaerobic and aerobic conditions, therefore, it could be applied in the oceanic sediment environment denitrification application study.

denitro-bacterium;Halomonas; nitrogen removal

國家科技支撐計劃課題(2012BAC07B03)；南通市農(nóng)業(yè)科學(xué)創(chuàng)新項目(HL2014014)；國家海洋局海洋生態(tài)環(huán)境科學(xué)與工程重點實驗室開放基金(MESE-2012-03)

沈輝 男，博士，副研究員。主要從事海洋生態(tài)學(xué)研究。Tel：0513-85223180，E-mail:darkhui@163.com

* 通訊作者。男，博士，教授。研究方向為海洋生態(tài)環(huán)境修復(fù)。E-mail：pmhe@shou.edu.cn

2015-02-28；

2015-07-20

Q93-331

A

1005-7021(2016)02-0050-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.02.009