王俏玲，何 軍，李 攀，朱溫平，劉 翔，李永東

(贛南師范大學 化學化工學院，江西 贛州 341000)

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·有機藥物化學·

柑橘黃龍病病菌FabD蛋白酶的基因克隆與表達*

王俏玲，何 軍，李 攀，朱溫平，劉 翔，李永東?

(贛南師范大學 化學化工學院，江西 贛州 341000)

柑橘黃龍病病菌(CandidatusLiberibacter)是黃龍病的致病菌.脂肪酸是細胞生物膜的重要組成成分，脂肪酸的生物合成對于病原細菌的生存至關重要.干擾病原菌生物膜的合成將抑制病原菌的生長和繁殖.本研究克隆了柑橘黃龍病病菌脂肪酸合成通路中的關鍵蛋白酶-丙二酸單酰CoA：ACP轉酰基酶(FabD，Malonyl CoA: ACP transacylase)基因，構建了該基因在大腸桿菌系統(tǒng)中的表達載體pET28a-FabD，成功實現(xiàn)了該基因在大腸桿菌系統(tǒng)中的重組表達.結果表明，該蛋白酶在大腸桿菌內為包涵體表達，復性后最終制備得到濃度為0.38 mg/mL的可溶性FabD蛋白酶.

柑橘黃龍病病菌；克隆；蛋白表達；FabD

柑橘黃龍病被稱為柑橘的“癌癥”，嚴重影響著包括臍橙在內的柑橘生產安全.柑橘黃龍病最早于1919年在我國廣東潮汕地區(qū)發(fā)現(xiàn)，其致病菌為柑橘黃龍病病菌，一種革蘭氏陰性菌[1].脂肪酸是生物細胞膜的重要組成成分，是細胞存活所必需的結構性物質，因此，脂肪酸生物合成對于病原菌的生存和繁殖至關重要[2-3].一般地，脂肪酸合成酶系統(tǒng)分為FAS I和FAS II，F(xiàn)AS II則主要存在于細菌和植物中，由一系列小的分離蛋白組成，每一步反應都由完全不同的單功能酶催化完成[4-5].正是由于FAS II與FAS I差異性較大，F(xiàn)AS II通路中的蛋白酶成為了一個極具潛力的抗生素靶標，受到廣泛關注[6-7].

丙二酰-ACP是脂肪酸生物合成的關鍵原料.FabD蛋白將丙二?；鶑谋?CoA轉移到?；d體蛋白(ACP)，形成丙二酰ACP和游離CoA-SH[8]，是FAS II系統(tǒng)中關鍵的蛋白酶之一.目前，F(xiàn)abD蛋白酶的抑制劑報道不多[9]，黃龍病病菌FabD的研究尚未見報道.本研究以柑橘黃龍病病菌的脂肪酸合成通路中FabD為研究對象，克隆得到該蛋白酶基因，并實現(xiàn)了其在大腸桿菌系統(tǒng)中的重組表達，分離純化得到可溶性FabD蛋白酶.

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用柑橘黃龍病基因模板由國家臍橙工程技術中心提供.大腸桿菌DH5ɑ、 BL21(DE3)菌株購自天根生化科技(北京)有限公司，pET28a由實驗室保存，限制性內切酶NdeI和BamHI由Takara公司購買，PCR用的Taq酶、克隆所用的酶由南京Vazyme公司購買，其他有機、無機試劑均為分析純或生物級規(guī)格.

1.2 目的基因克隆與鑒定

以野生臍橙病樹葉片提取的總核酸為模板，設計基因擴增正向引物P1: 5’- GTGCCGCGCGGCAGCCATATGTCTACAGTGTTGACATTTCCAG-3’和反向引物P2: 5’- ACGGAGCTCGAATTCGGATCCCTAACCAACTATAGATCTGAGCGC-3’.反應體系為：2×AceTaqTMMaser Mix(南京Vazyme公司)25 μL,DNA模板1 μL，正、反向引物各1 μL，ddH2O 22 μL.PCR運行程序(95 ℃ 10 min, 94 ℃ 40 s, 55 ℃ 40 s, 72 ℃ 40 s, 30個循環(huán)，末次循環(huán)后延伸10 min).將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳驗證分析，確定獲得特異性的正確的目的基因片段.然后將PCR產物進行電泳、切膠、回收純化.

1.3 表達載體構建與鑒定

將實驗室保存有pET28a質粒用Nde I和BamH I進行雙酶切，產物進行瓊脂糖凝膠電泳后，切膠、回收純化.將目的基因與雙酶切處理過的DNA片段，按2：1摩爾比，用Clon Express II one step cloning Kit，37 ℃水浴30 min，進行重組連接.重組產物涂布到含有卡納霉素抗性的固體培養(yǎng)板上，37 ℃培養(yǎng)過夜.挑選單克隆菌落培養(yǎng)12-16 h，提取質粒進行酶切驗證，隨后將質粒送至上海生工進行精確測序.

1.4 目的蛋白表達及鑒定

將測序正確的重組質粒轉化至大腸桿菌菌株BL21(DE3)中，接種單克隆菌落，加入3支4 mL(含卡那霉素50 mg/mL)的LB培養(yǎng)基中，編號為標記為“0”“1”“2”，37 ℃ 200 rpm 培養(yǎng)至OD600約為0.6-0.8(約2.5-3 h).向試管培養(yǎng)液中加入終濃度0.5 mM IPTG(“0”對照組不加 IPTG)，“0”“1”放入15 ℃搖床誘導培養(yǎng)過夜，“2”放置37 ℃搖床誘導培養(yǎng)4 h.

分別取“0”“1”“2”試管中各 400-600 μL 培養(yǎng)液離心去除上清液，加入500 μL ddH2O重懸菌體，并再次于4 ℃條件離心去除上清液. 隨后，加入50 μL的磷酸緩沖液(PBS)混合重懸沉淀.再加入50 μL的2×SDS上樣緩沖液迅速在100 ℃加熱樣品15 min使蛋白變性，然后進行SDS-PAGE電泳驗證.

另取“1”號表達菌液500 μL，4 ℃離心，加500 μL ddH2O重懸菌體，再次離心后，取沉淀加入50 μL重懸，冰浴下超聲裂解，隨后離心獲得上清及沉淀，分別加入適量2×SDS上樣緩沖液迅速在100 ℃加熱樣品15 min使蛋白變性，然后進行SDS-PAGE電泳驗證.

1.5 目的蛋白的大量表達

取“1”和“2”保種的菌種20 μL至含50 μg/mL的硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于搖床(37 ℃，200 rpm)中培養(yǎng)過夜；第二天接種到含50 μg/mL 卡那霉素抗性的500 mL培養(yǎng)基中，搖床(37 ℃，200 rpm)中培養(yǎng)至OD=0.6～0.8時，將搖床溫度降至15 ℃，約1 h后加入終濃度0.5 mM的IPTG誘導培養(yǎng)16 h；4 ℃離心收集菌體，并用磷酸緩沖鹽(PBS)重懸一次以清洗一遍菌體，備用.

1.6 FabD蛋白包涵體的純化

用Buffer A(50 mM Tris,150 mM NaCl,1 mM DTT,1% Triton X-100, 1 μg/mL Pepstatin A,1 μg/mL Leupeptin, 20 mM咪唑，pH8.0)重懸菌泥(通常裂解液用量為10-15 mL/g 菌泥)；超聲裂解，用500 W功率,在冰浴中進行超聲；結束后，4 ℃離心棄去上清；包涵體沉淀用裂解液Buffer B(50 mM Tris,150 mM NaCl,6M Urea,20 mM咪唑，pH8.0重懸，裂解液用量10-15 mL/g 包涵體)超聲裂解，用500 W功率，在冰浴中進行超聲，4 ℃離心保留上清，并用0.45 μm濾膜過濾；用Buffer B平衡3 mL Ni-IDA柱至紫外達到基線；將過濾的上清同平衡后的Ni-IDA柱混合后置于旋轉混合儀上4 ℃孵育60-80 min；空層析柱截留含有FabD蛋白的Ni-IDA柱，并用Buffer B沖洗10-20 CV，流速1.0 mL/min，直至紫外示數(shù)達到基線；用分別含有50 mM、100 mM、300 mM咪唑的Buffer B洗脫目標蛋白，流速1.5 mL/min, 并收集每個咪唑梯度的洗脫液組分；最后，將收集到的各洗脫組分進行SDS-PAGE電泳.

1.7 目的蛋白的復性與鑒定

將上述收集的目標蛋白用3.5kDa透析袋透析到1 L Buffer C(50 mM Tris,4 mM GSH,0.4 mM GSSG,0.4 M L-Arginine,pH 8.0)中，4 ℃旋轉復性24 h，然后將蛋白換液至Buffer D(50 mM Tris,50 mM NaCl,10% Glycerol,2 mM EDTA,2 mM DTT,pH 7.4)中，用磁力攪拌器4 ℃旋轉，每隔2-3 h換液一次，總計換液4次；透析結束后，用0.22 μm膜過濾，保存于-80 ℃冰箱.

取一支分裝后凍于-80 ℃的FabD蛋白，放置于冰水混合物中待其緩慢融化，融化后查看有無明顯懸浮物，并且13 000 rpm，30 min，4 ℃離心后再次觀察有無沉淀.將其與BSA(牛血清白蛋白)做對照，進行SDS-PAGE電泳驗證，并采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白濃度測定.

2 結果

2.1 FabD基因克隆

將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳驗證，可以看到一條清晰而專一的擴增條帶，其位置在1 000 bp上下，與FabD基因理論值(945 bp)大小相符；將重組轉化后，抽提的質粒分別進行單、雙酶切驗證，雙酶切后，在1 000 bp處看到一條特異性條帶，與目的基因大小一致，說明重組表達載體構建成功.

圖1 FabD小量表達及鑒定SDS-PAGE電泳圖

2.2 FabD蛋白表達與鑒定

按1.4中的方法制備樣品，進行SDS-PAGE電泳(如圖1).對比空白組，實驗組中在35 kDa處可觀察到一特異性蛋白條帶，其大小與FabD蛋白分子量的理論值大小(33.7 kDa)相符，說明目標蛋白實現(xiàn)了表達；表達產物經裂解后，利用SDS-PAGE電泳分析上清和沉淀，表明表達產物在沉淀中，為包涵體表達.

2.4 FabD蛋白純化

將1.6包涵體純化的各收集產物進行SDS-PAGE電泳檢驗(如圖2，Lane M：SDS-PAGE Protein marker;Lane 1：包涵體溶解離心后上清；Lane 2：同Ni-IDA孵育的流出液;Lane3-4：50 mM咪唑的Buffer B洗脫液；Lane5-8：100 mM咪唑的Buffer B洗脫液;Lane 9-12：300 mM咪唑的Buffer B洗脫液)，可以看到從收集產物3之后，均為較純的目的蛋白.

圖2 FabD蛋白包涵體純化結果SDS-PAGE電泳圖

圖3 FabD蛋白鑒定電泳圖及標準曲線

2.5 FabD蛋白復性與鑒定

將復性后的FabD蛋白與BSA(牛血清白蛋白)對照，進行SDS-PAGE分析(如圖3左).采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒首先制作標準曲線(如圖3右)，測得復性FabD蛋白溶液的D=0.270，最終換算濃度為0.380 mg/mL.

3 展望

藥物靶標蛋白酶晶體結構為基礎的藥物設計是理性發(fā)展新型抗菌藥物的基本前提[10-11].柑橘黃龍病病菌脂肪酸的合成對于該病菌細胞的生存必不可少，該通路中各蛋白酶結構功能的研究對于抗黃龍病病菌藥物的設計和開發(fā)具有重要意義.在ACP(Acyl Carrier Protein)蛋白活化修飾和乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA Carboxylase)底物準備完成之后，柑橘黃龍病病菌蛋白酶FabD催化丙二酸單酰CoA生成丙二酸單酰ACP從而加載到活化的ACP蛋白上，完成脂肪酸合成第一步的原料準備步驟.該蛋白酶基因的克隆和重組蛋白的成功制備，為后續(xù)黃龍病病菌FabD蛋白酶的結構功能研究及其抑制劑的篩選打下了堅實的基礎.

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Cloning and Expression Analysis of Malonyl CoA:ACP Transacylase (FabD) from Candidatus Liberibacter Asiaticus

WANG Qiaoling, HE Jun, LI Pan, JU Wenpeng, LIU Xiang, LI Yongdong

(SchoolofChemistryandChemicalEngineering,GannanNormalUniversity,Ganzhou341000,China)

The pathogen ofCitrusHuanglongbingisCandidatusLiberibacte. The fatty acid biosynthesis in pathogenic microorganisms is essential for cell viability. The enzymes involved in the pathway of fatty acid synthase (FAS) have been regarded as targets for antibacterial drug discovery. In this study, one of the fatty acid sythase FabD fromCandidatusLiberibacterasiaticushas been cloned, and the recombinant plasmid of pET28a-FabD was constructed. Finally, the soluble FabD protease of a concentration of 0.38 mg/mL has been obtained successfully by the methods of inclusion body purification and protein refolding.

CitrusHuanglongbing; clone; protein expression; FabD

2016-10-24

10.13698/j.cnki.cn36-1346/c.2016.06.015

江西省科技支撐計劃項目(20142BBG70107)

http://www.cnki.net/kcms/detail/36.1037.C.20161209.1515.032.html

S666

A

1004-8332(2016)06-0066-03

? 通訊作者：李永東(1972-)，男，江西贛州人，贛南師范大學化學化工學院教授，研究方向：生物化學.