周江，吳婷婷，李美云，雷小小，唐婷，桂卉

湖南省中藥現(xiàn)代化研究重點實驗室，湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208

Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化蓮心堿羥丙基-β-環(huán)糊精包合物制備及表征

周江，吳婷婷，李美云，雷小小，唐婷，桂卉

湖南省中藥現(xiàn)代化研究重點實驗室，湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208

目的 優(yōu)選蓮心堿羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD）包合物的最佳制備工藝，考察蓮心堿HP-β-CD包合物體外溶出性質(zhì)。方法 采用飽和水溶液法制備包合物，以45 min體外累積溶出度為指標(biāo)，采用三因素三水平Box-Behnken設(shè)計，考察HP-β-CD與蓮心堿投料比、攪拌時間、包合溫度對制備工藝的影響，對結(jié)果進(jìn)行多元線性和二項式擬合，效應(yīng)面法篩選出最佳包合工藝，進(jìn)行預(yù)測分析和驗證試驗，并應(yīng)用顯微電鏡掃描法、差示量熱掃描法、紅外光譜、X射線衍射法對包合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。結(jié)果 蓮心堿HP-β-CD包合物的最佳制備工藝為：HP-β-CD用量為蓮心堿投料量的4.5倍，攪拌時間為3.7 h，包合溫度為52 ℃。表征鑒定結(jié)果顯示蓮心堿HP-β-CD包合物已形成。結(jié)論 本研究優(yōu)選的最佳包合工藝穩(wěn)定可行，能顯著提高蓮心堿的溶出度，增加其生物利用度。

蓮心堿；羥丙基-β-環(huán)糊精；包合物；Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面法；累積溶出度

蓮心堿（liensinine）是中藥蓮子心中含量較高的一種雙芐基異喹啉類生物堿，具有降壓、抗心律失常、抗氧化、對抗血栓形成等作用[1-3]，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。但蓮心堿在水中溶解度差，口服溶出速率較慢，極大地限制其臨床應(yīng)用。通過增加其在體外的溶出速率有望提高蓮心堿在體內(nèi)的生物利用度。包合技術(shù)具有增加藥物溶解度、降低藥物刺激性、減少毒性、提高藥物穩(wěn)定性、提高生物利用度等優(yōu)點[4-5]。本研究采用相溶解度法考察羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD）對蓮心堿的增溶作用，以體外45 min累積溶出度為指標(biāo)，通過Box-Behnken試驗設(shè)計優(yōu)化蓮心堿HP-β-CD包合物的制備工藝，運(yùn)用顯微電鏡掃描法、差示量熱掃描法、紅外檢測法、X射線衍射法對蓮心堿HP-β-CD包合物進(jìn)行物相鑒定。

1 儀器與試藥

傅里葉紅外掃描儀（FTIR-8000，日本島津公司）；ZRS-8G型溶出儀（天津大學(xué)無線電廠）；756PC型紫外分光光度儀（上海奧普勒有限公司）；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華有限責(zé)任有限公司）；CP-114型電子分析天平（上海奧豪斯公司）；X衍射掃描儀（北京宏昌信科技有限公司：XRD系列）；差示量熱掃描儀（美國TA公司，Q2000）；REM電子掃描儀（FEI公司，Quanta-200）。

蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物有限公司，HPLC純度≥98％，批號20121122）；蓮心堿（自制，含量≥50％）；HP-β-CD（上海源葉生物科技有限公司）；甲醇（分析純，成都市科龍化工試劑廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在200～700 nm進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果顯示在282 nm處包合物中蓮心堿及蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品均有最大吸收。配制不同濃度蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品，測量其吸光度值，得線性回歸方程：Y＝0.139X＋0.018 3，r＝0.999 2。

2.2 精密度試驗

精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.10 mg/mL）1 mL，用甲醇定容至10 mL，取6份標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法操作，測量吸光度值分別為0.119、0.117、0.120、0.120、0.120、0.121，計算得RSD＝0.65％，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗

精密量取蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品（0.10 mg/mL）1 mL，定容至10 mL，每隔2 h取樣，于282 nm處測定紫外吸光度值，分別在0、2、4、6、8、12 h測得吸光度值為1.328、1.340、1.344、1.335、1.343、1.332，平均值為1.337，RSD＝0.206％（n＝6）。結(jié)果表明蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液在12 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.4 相溶解度法

在HP-β-CD濃度分別為0、0.025、0.05、0.1、0.125、0.2 mol/L的水溶液中（100 mL）添加蓮心堿提取物0.5 g（含蓮心堿4 mg），于25 ℃磁力攪拌，讓其平衡4 h，溶解平衡后取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，測量其吸光度值，計算蓮心堿的表觀溶解度，以HP-β-CD溶液濃度為橫坐標(biāo)、蓮心堿的表觀溶解度為縱坐標(biāo)，繪制平衡相溶解度曲線。結(jié)果表明，在0～0.2 mol/L范圍內(nèi)，隨著HP-β-CD濃度的增加，蓮心堿的表觀溶解度呈良好的線性增加，其相溶解度方程為Y＝0.828 0X＋0.225 0，r2＝0.999 1。說明蓮心堿與HP-β-CD以摩爾比1∶2的比例（質(zhì)量比約1∶4）進(jìn)行包合，且HP-β-CD具有提高蓮心堿溶解度的作用[6]。

2.5 累積溶出度測定

按照2010年版《中華人民共和國藥典》（二部）附錄ⅩC溶出度測定方法（槳法）測定溶出度。取樣品各1 g，以pH 6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為100 r/min，分別在0、3、8、10、20、30、45 min時取樣7 mL（取樣后立即補(bǔ)充等量的溶出介質(zhì)），過0.45 μm微孔濾膜，取濾液作為供試品，在282 nm處測定其吸光度值，按下式計算累積溶出百分率。

q（％）＝[Cq×V1＋(C1＋C2＋…＋Cq-1)×V2]/M/1000×100％

其中，q（％）為第q個取樣點時的累積溶出百分率；Cq為第q個取樣點時的藥物濃度；V1為溶出介質(zhì)的總體積，V1＝1000 mL；V2為每次取樣的體積，V2＝7 mL；M為稱取的樣品含蓮心堿的量。

精密稱取蓮心堿原料藥3份，分別為1.01、0.99、1.01 g，按上述方法測得3份原料藥樣品45 min累積溶出度分別為22.70％、21.34％、22.59％，樣品累積溶出度平均值為22.54％。

2.6 Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面分析法優(yōu)選包合物制備工藝

2.6.1 試驗設(shè)計與結(jié)果 通過預(yù)試驗得知，采用飽和水溶液法制備蓮心堿包合物對蓮心堿的增溶效果較好，影響包合物包合的主要因素為藥物與HP-β-CD比例、攪拌時間、包合溫度，每個因素設(shè)計3個水平（低、中、高分別以-1、0、1進(jìn)行編碼），因素水平見表1。以包合物中蓮心堿的累積溶出百分率（Y）為指標(biāo)，篩選蓮心堿包合的最佳工藝，按Box-Behnken試驗設(shè)計的統(tǒng)計學(xué)要求，各組試驗安排及結(jié)果見表2，模型方差分析見表3。

表1　Box-Behnken設(shè)計因素水平

2.6.2 模型擬合及顯著性檢驗 采用Design-Expert 8.05軟件對上述試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次回歸方程模型為：Y＝-401.896 50＋21.450 50A＋3.944 88B＋16.325 12C－0.461 25AB－0.232 25AC＋0.125 62BC－0.854 44A2－1.147 56B2－0.150 70C2，決定系數(shù)R2＝0.891 1。對該回歸模型及其系數(shù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示該模型方程達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），且失擬項不顯著（P＞0.05），表明該回歸模型的擬合情況良好，回歸方程的代表性較好，能準(zhǔn)確預(yù)測實際情況。其校正決定系數(shù)（R2adj）為0.971 2，表明此模型能解釋97.12％效應(yīng)值變化，因此該模型擬合程度良好，試驗誤差小，僅有約4％不能由此模型進(jìn)行解釋。

表2　Box-Behnken設(shè)計方案與試驗結(jié)果

表3　二次回歸模型方差分析結(jié)果

2.6.3效應(yīng)面的優(yōu)化與分析根據(jù)回歸分析結(jié)果，采用Design-Expert8.05軟件做三維圖（見圖1）。從曲面圖和等高線圖可以直觀看出，HP-β-CD用量和包合溫度對包合物的溶出性能有極其顯著的影響（P＜0.001），而攪拌時間對溶出性能的影響次之。當(dāng)HP-β-CD用量、攪拌時間及包合溫度逐漸增加時，包合物的溶解性能均為先增大后減小。當(dāng)HP-β-CD用量約為4倍、攪拌時間約4 h、包合溫度約50℃時，包合物的45 min累積溶出度接近最大值。根據(jù)本試驗?zāi)康?，要求包合物累積溶出度越大越好，通過Design-Expert8.05軟件可找到最佳包合工藝參數(shù)，即HP-β-CD用量為蓮心堿投料量的4.45倍，攪拌時間為3.68 h，包合溫度為52.26℃。

圖1　HP-β-CD用量、攪拌時間、包合溫度對包合物溶解性能的影響

2.6.4模型的預(yù)測與驗證考慮到實際操作方便，將最佳包合工藝修正為：HP-β-CD用量為蓮心堿投料量的4.5倍，攪拌時間為3.7 h，包合溫度為52℃。在此條件下，蓮心堿包合物的45 min累積溶出度的理論值為79.77％。按修正后的最佳包合工藝進(jìn)行驗證試驗，測得的蓮心堿45 min累積溶出度為（78.58± 1.21）％。與理論預(yù)測值比較接近，說明此模型擬合度高，基于Box-Behnken設(shè)計所得的最佳包合工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

Optimal Preparation and Characterization of Liensinine HP-β-CD Inclusion Compound by

Box-Behnken Design-Response Surface Methodology

ZHOU Jiang, WU Ting-ting, LI Mei-yun,

LEI Xiao-xiao, TANG Ting, GUI Hui (Hunan Provincial Modernization Key Laboratory of Chinese Medicine, College of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China)

Objective To optimize the preparation of liensinine HP-β-CD inclusion compound; To investigate its dissolution performance in vitro. Methods The inclusion compound of liensinine was prepared by using saturated water solution method; the cumulative dissolution (45 min) was used as an indicator and Box-Behnken design was adopted to evaluate the influence of feed ratio, mixing time and inclusion temperature on preparation process. Results were analyzed by multiple linear and binomial fitting; response surface methodology was used to screen the optimal inclusion process; predictive parsing and verification experiment were conducted; SEM, DSC, IR, and XRD were applied for the structural characterization of inclusion compound of liensinine. Results The optimal preparation process was: HP-β-CD was 4.5 times the amount of liensinine feeding amount; mixing time was 3.7 h; inclusion temperature was 52 ℃. HP-β-CD inclusion compound of liensinine formed. Conclusion Optimal inclusion process is stable and feasible, which can significantly improve the dissolution of liensinine and increase its bioavailability.

liensinine; HP-β-CD; inclusion compound; Box-Behnken design; cumulative dissolution

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.022

R283.5

A

1005-5304(2016)03-0080-05

湖南省高校創(chuàng)新平臺開放基金（13K078）；湖南省科技計劃項目（2013SK3100）

桂卉，E-mail：guihui1993@126.com