馬春林，吳紅彥，2，3，李海龍，2，陳杰，張宣

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)方藥挖掘和創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)制工程實驗室，甘肅 蘭州 730000

參芪抑瘤方藥物血清對胃癌MKN-45細(xì)胞周期阻滯及抗侵襲轉(zhuǎn)移的影響

馬春林1，吳紅彥1，2，3，李海龍1，2，陳杰1，張宣1

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)方藥挖掘和創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)制工程實驗室，甘肅 蘭州 730000

目的 探討不同濃度參芪抑瘤方藥物血清對胃癌MKN-45細(xì)胞周期阻滯及抗侵襲轉(zhuǎn)移作用的相關(guān)機(jī)制。方法 60只SPF級Wistar大鼠，隨機(jī)分為對照組和參芪抑瘤方低、中、高劑量組，每組15只。參芪抑瘤方低、中、高劑量組分別給予0.25、0.50、1.00 g原藥材/mL藥液灌胃，空白組給予等量飲用水灌胃，每日2次，連續(xù)7 d，末次灌胃2 h后取血，分離血清。MKN-45細(xì)胞經(jīng)不同濃度藥物血清處理后，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，免疫組化檢測COX-2、PTEN蛋白表達(dá)。結(jié)果 藥物血清干預(yù)后細(xì)胞G0～G1期比例增加，S期比例減少；藥物血清可降低MKN-45細(xì)胞COX-2蛋白陽性表達(dá)率，升高PTEN蛋白陽性表達(dá)率（P＜0.05）。結(jié)論 參芪抑瘤方藥物血清阻滯細(xì)胞周期及抗侵襲轉(zhuǎn)移作用可能與影響COX-2、PTEN蛋白表達(dá)有關(guān)。

參芪抑瘤方；胃癌；MKN-45細(xì)胞；細(xì)胞周期；COX-2蛋白；PTEN蛋白；大鼠

中醫(yī)藥防治惡性腫瘤方面，近年來顯示出了一定優(yōu)勢，并越來越受到關(guān)注。當(dāng)歸貝母苦參丸出自《金匱要略》，原用于治療妊娠小便困難?，F(xiàn)代研究顯示，其對肝癌、胃癌細(xì)胞等有明顯的抑制作用[1-3]。參芪抑瘤方為臨床經(jīng)驗方，用于多種腫瘤疾病的治療，由當(dāng)歸貝母苦參丸加黃芪、全蝎、山慈菇等組成，契合了腫瘤正氣不足，痰（濕）濁、癌毒、瘀血內(nèi)阻的發(fā)病機(jī)制[4]。方中藥材所含有效成分黃芪多糖、當(dāng)歸多糖、貝母堿、苦參堿等對多種癌細(xì)胞有明顯的抑制作用[5-8]。本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索其抗腫瘤的相關(guān)作用機(jī)制，為抗腫瘤中藥研發(fā)提供一定的實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

60只SPF級Wistar大鼠，雌雄各半，6～8周齡，體質(zhì)量（200±20）g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研中心動物實驗室，合格證號SYXK（甘）2001-0001。室溫20～25 ℃、濕度45%～55%分籠飼養(yǎng)，喂標(biāo)準(zhǔn)飼料（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研中心動物實驗室提供），自由飲水。

1.2 藥物和細(xì)胞

參芪抑瘤方由苦參、黃芪、山慈菇、全蝎、當(dāng)歸、浙貝母等組成，所有飲片購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室楊扶德教授鑒定符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定。胃癌MKN-45細(xì)胞，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所提供。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco公司），四季青胎牛血清（杭州四季青公司），胰蛋白酶（Gibco公司），二抗（中杉金橋生物技術(shù)有限公司），RNAisoTMPlus（D9810A），the PrimeScript RT reagent、kit（DRRO37A），SYBR Premix Ex TaqTM（DRR081A，TakarBio），國產(chǎn)分析純試劑（北京化學(xué)試劑公司）。細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海申力，HF212），高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司，5804R），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司，CKX41+DP21），流式細(xì)胞儀（美國COULTER EPICS XL）。

2 實驗方法

2.1 分組、給藥及藥物血清制備

將60只SPF級Wistar大鼠隨機(jī)分為對照組和參芪抑瘤方低、中、高劑量組，每組15只。參芪抑瘤方低、中、高劑量組予0.25、0.50、1.00 g原藥材/mL藥液灌胃，對照組予等量飲用水灌胃。給藥體積均為1.5 mL/100 g，每日2次，連續(xù)7 d。末次灌胃2 h后取血，3000 r/min低溫離心15 min，分離血清，0.22 μm微孔濾膜過濾，56 ℃、30 min滅活，-80 ℃保存。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MKN-45細(xì)胞經(jīng)常規(guī)傳代培養(yǎng)，采用含10%滅火胎牛血清及青鏈霉素（100 U/mL）的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中貼壁生長，每2～3 d換液1次。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞情況，當(dāng)生長狀態(tài)良好且鋪滿瓶底時，采用25%胰酶消化、傳代，并取處于對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測MKN-45細(xì)胞周期

取對數(shù)生長期的MKN-45細(xì)胞接種于6孔板中，增殖為80%時，加入20%藥物血清處理48 h，檢測前用胰酶消化，1500 r/min離心5 min，棄上清液，PBS洗2次，70%乙醇固定，4 ℃固定過夜。用PBS配制成單細(xì)胞懸液，50 μg/mL碘化丙啶染色液室溫染色30 min后，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。

2.4 免疫組化檢測MKN-45細(xì)胞COX-2、PTEN蛋白表達(dá)

將無菌10 mm×10 mm的24片蓋玻片置入24孔培養(yǎng)板中，取對數(shù)生長期的MKN-45細(xì)胞消化后，制成單細(xì)胞懸液，以500 μL/孔接種于24孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞貼壁后，對照組加50 μL完全培養(yǎng)基，余孔依次加空白血清和高、中、低劑量藥物血清各50 μL，每組設(shè)3個復(fù)孔。細(xì)胞爬滿蓋玻片后，取爬片浸入4%多聚甲醛中過夜。用PBS洗3次，5 min/次，加50 μL 0.1%Triton X-100室溫下孵育15 min后，再用PBS洗5 min×3次，加3%H2O2室溫下孵育30 min，繼續(xù)用PBS洗5 min×3次，滴加50 μL 5%BSA封閉液。室溫封閉20 min后，甩去多余液體，滴加50 μL稀釋過的Rabbit Anti-collagen TypeⅡ（1∶100），置濕盒中4 ℃孵育過夜。并以PBS代替一抗，作為陰性對照，PBS洗3次，2 min/次，加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃孵育20 min，再用PBS洗2 min×3次。然后加SABC，37 ℃繼續(xù)孵育20 min，PBS洗5 min×4次。DAB顯色，自來水沖洗1 min。蘇木素復(fù)染5 min，0.5%鹽酸乙醇分化10 s，氨水返藍(lán)10 s。梯度乙醇脫水干燥，每一梯度5 min，二甲苯透明10 s，甘油封片。倒置相差顯微鏡觀察爬片，每組選6張爬片，每張爬片選擇3個高倍視野照相，用Leica Qwin病理圖像分析系統(tǒng)對所拍照片進(jìn)行分析，測定相對灰度值。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 參芪抑瘤方藥物血清對MKN-45細(xì)胞周期的影響

10%濃度藥物血清處理后MKN-45細(xì)胞較對照組細(xì)胞G0/G1期比例升高，S期低于對照組，見表1、圖1。表明藥物血清可有效抑制細(xì)胞進(jìn)入增殖周期，降低細(xì)胞S期，阻滯細(xì)胞于G0～G1期。

表1 各組MKN-45細(xì)胞細(xì)胞周期分布比較（%）

圖1 各組MKN-45細(xì)胞流式細(xì)胞圖

4.2 參芪抑瘤方藥物血清對MKN-545細(xì)胞COX-2、PTEN蛋白表達(dá)的影響

對照組細(xì)胞COX-2以強(qiáng)陽性和陽性表達(dá)為主，而藥物血清干預(yù)組細(xì)胞著色逐漸變淺，COX-2呈弱陽性或陰性表達(dá)；對照組細(xì)胞著色較淺，PTEN呈弱陽性或陰性表達(dá)，藥物血清干預(yù)組細(xì)胞著色逐漸變深，PTEN表達(dá)逐漸增強(qiáng)，呈強(qiáng)陽性或陽性表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見表2、圖2和圖3。

表2 各組MKN-45細(xì)胞COX-2、PTEN蛋白表達(dá)比較（±s，%）

表2 各組MKN-45細(xì)胞COX-2、PTEN蛋白表達(dá)比較（±s，%）

注：與對照組比較，▲P＜0.05

組別 n COX-2 PTEN對照組 18 0.22±0.12 1.02±0.01空白血清組 18 0.20±0.01 0.99±0.02低劑量組 18 0.45±0.02▲0.78±0.03▲中劑量組 18 0.69±0.04▲0.57±0.01▲高劑量組 18 0.89±0.03▲0.23±0.01▲

圖2 各組MKN-45細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)（免疫組化染色，×400）

圖3 各組MKN-45細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)（免疫組化染色，×400）

5 討論

胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多步驟、多基因參與的復(fù)雜病理過程。正常情況下，胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖和凋亡之間保持動態(tài)平衡。這種平衡的維持有賴于癌基因、抑癌基因及一些細(xì)胞因子等共同調(diào)控。多種因素會影響上述調(diào)控體系，共同參與胃癌的發(fā)生。

中醫(yī)認(rèn)為，胃癌是牽涉整體的全身性疾病的局部表現(xiàn)，多由先天稟賦不足、邪毒侵襲、痰凝血瘀等因素，引起機(jī)體陰陽失衡，臟腑經(jīng)絡(luò)功能失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致局部癌變。其主要病機(jī)為本虛標(biāo)實，本虛為素體虛弱或先天稟賦因素，標(biāo)實不外乎氣滯、血瘀、痰凝、毒聚。中醫(yī)藥治療在個體化、多層次、多靶點控制腫瘤生長、抗轉(zhuǎn)移、減少復(fù)發(fā)等方面具有獨到的優(yōu)勢，是胃癌的重要輔助治療方法。胃癌早期采用中西醫(yī)結(jié)合治療，可有效逆轉(zhuǎn)病情的惡化。利用中醫(yī)藥的整體調(diào)節(jié)作用，胃癌術(shù)后放化療過程中，使患者對放化療藥物的耐受性增強(qiáng)，免疫功能得到提高，抑瘤效果得以強(qiáng)化，痛苦明顯緩解，生存期延長，生活質(zhì)量提高。

COX-2是前列腺素合成關(guān)鍵限速酶環(huán)氧合酶的一種亞型，近年來研究發(fā)現(xiàn)，COX-2高表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡過程中起重要作用，其表達(dá)可延長癌細(xì)胞的生存期，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。在正常胃黏膜COX-2幾乎不表達(dá)，而在胃癌變時則過表達(dá)，對胃癌細(xì)胞的異常增殖、細(xì)胞凋亡、抑制血管形成及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)有重要生物學(xué)作用。COX-2過表達(dá)可上調(diào)黏附因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤與轉(zhuǎn)移；上調(diào)腫瘤細(xì)胞周圍血管生成因子，促進(jìn)腫瘤血管生成。研究表明，其在正常胃黏膜、淺表性胃炎、萎縮性胃炎伴腸化、不典型增生及胃癌組織中的表達(dá)呈逐漸遞增趨勢[9]。

作為抑癌基因的PTEN低表達(dá)會激活PPI3K-Ark信號通路，從而縮短細(xì)胞的分裂周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，與腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10]。PTEN的表達(dá)過低、受到抑制或缺失都會誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的無限增殖，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[11-13]。PTEN蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵襲程度密切相關(guān)。胃癌組織中PTEN蛋白的檢測可了解與判斷腫瘤增生、侵襲及轉(zhuǎn)移的能力和程度。

綜上，參芪抑瘤方藥物血清能明顯阻滯胃癌細(xì)胞于G0/G1期，減少S期細(xì)胞數(shù)量，有效抑制細(xì)胞進(jìn)入增殖周期，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞周期阻滯。參芪抑瘤方藥物血清可能通過抑制COX-2的表達(dá)從而抑制血管內(nèi)皮生長因子的活性，降低細(xì)胞間E-鈣黏蛋白活性，減弱腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，也可能通過升高PTEN的表達(dá)量，使其去磷酸化作用增強(qiáng)，進(jìn)而抑制細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和分化，抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等，從而發(fā)揮抗胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用。

[1] 舍雅莉,閆德祺,劉永琦,等.當(dāng)歸貝母苦參丸對順鉑化療H22荷瘤小鼠腫瘤及肝臟、腎臟和胸腺組織病理形態(tài)的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2014,21(5)：56-60.

[2] 閆德祺,劉永琦,李應(yīng)東,等.當(dāng)歸貝母苦參丸對順鉑化療H22荷瘤小鼠的抑瘤作用及對血清HIF-1α和LDH的影響[J].中成藥,2014,36(7)：1351-1355.

[3] 石金鳳,李海龍,吳紅彥,等.當(dāng)歸貝母苦參丸含藥血清對胃癌細(xì)胞SGC-7901和侵襲轉(zhuǎn)移能力和周期的影響[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2014,16(10)：30-33.

[4] 梁云麒,沈克平,胡兵.中醫(yī)胃癌病機(jī)與治法研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2014,32(3)：513-515.

[5] GUO L, BAI S P, ZHAO L, et al. Astragalus polysaccharide injection integrated with vinorelbine and cisplatin for patients with advanced non-small cell lung cancer：effects on quality of life and survival[J]. Med Oncol,2012,29(3)：1656.

[6] 吳素珍,李加林,陳水親,等.硫酸酯化當(dāng)歸多糖抗腫瘤實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2012,23(2)：319-320.

[7] 劉琦,程旭鋒,張新峰,等.山慈菇-蜂房藥對抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞體外侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)理研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2014,25(4)：389-392.

[8] 王晶娟,張貴君,吳明俠,等.全蝎蛋白藥效組分對HepG2細(xì)胞的體外抑制作用[J].藥物分析雜志,2011,31(1)：71-74.

[9] TATSUGUCHI A, MATSUI K, SHINJI Y, et al. Cyclooxygenase-2 expression correlates with angiogenesis and apoptosis in gastric cancer tissue[J]. Hum Pathol,2004,35：488.

[10] WANG S I, PARSONS R, ITTMANN M, et al. Homozygous deletion of PTEN tumor suppressor gene in a subset of prostate adenocarcinoma[J]. Clin Cancer Res,1998,4(6)：811-815.

[11] TIBAREWAL P, ZILIDIS G, SPINELLI L, et al. PTEN protein phosphatase activity correlates with control of gene expression and invasion, a tumor-suppressing phenotype, but not with AKT activity[J]. Sci Signal,2012,213：18.

[12] ZHENG H, TAKAHASHI H, MURAI Y, et al. Low expression of FHIT and PTEN correlates with malignancy of gastric carcinomas：tissue-array findings[J]. Appl Immunohistochem Mol Morphol,2007, 15(4)：432-440.

[13] ZHANG B G, LI J F, YU B Q, et al. MicroRNA-21 promotes tumor proliferation and invasion in gastric cancer by targeting PTEN[J]. Oncol Rep,2012,27(4)：1019-1026.

Effects of Shenqi Yiliu Decoction Medicated Serum on Blocking Cell Cycle and Inhibiting

Invasion and Metastasis of Gastric Cancer Cell Lines MKN-45

MA Chun-lin1, WU Hong-yan1,2,3,

LI Hai-long1,2, CHEN Jie1, ZHANG Xuan1(1. Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 2. Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Excavation Innovation and Transformation of Gansu Province, Lanzhou 730000, China; 3. Laboratory for TCM New Products Development Engineering of Gansu Province, Lanzhou 730000, China)

Objective To investigate the relevant mechanism of different concentrations of Shenqi Yiliu Decoction medicated serum on blocking cell cycle and inhibiting invasion and metastasis of gastric cancer cell lines MKN-45. Methods Sixty SPF Wistar rats were randomized into Shenqi Yiliu Decoction low-, medium-, and high-dose groups and control group, with 15 rats in each group. Low-, medium- and high-dose groups were fed with different concentrations of TCM liquid from which containing crude medicine (0.25, 0.50, 1.00 g/mL) separately for gavage. Rats in the blank group were given the same amount of drinking water for gavage, twice a day, for 7 days. 2 h after the last gavage, rat blood was taken and serum was separated. After MKN-45 cells were dealt with different concentrations of medicinal serum, FCM was used to detect cell cycle and immunohistochemistry technology was used to detect the expressions of COX-2 and PTEM proteins. Results FCM analysis showed that medicated serum could increase G0-G1 phase and shorten S phase of cells; medicated serum could reduce the positive expression rate of COX-2 of the MKN-45 cells and increase positive expression rate of PTEN proteins (P<0.05). Conclusion Shenqi Yiliu Decoction medicated serum can block the cell cycle and inhibit invasion and metastasis of MKN-45 cell lines, which may be related to the intervention in the expression levels of COX-2 and PTEN proteins.

Shenqi Yiliu Decoction; gastric cancer; MKN-45 cell; cell cycle; COX-2; PTEN; rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.017

R285.5

A

1005-5304(2016)04-0064-04

2015-06-24）

（

2015-07-03；編輯：華強(qiáng)）

甘肅省高等學(xué)?？蒲许椖浚?013A-088）

吳紅彥，E-mail：wuhy@163.com